与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素多重放大免疫传感器的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤的发病率高，不易察觉，我国病例数相当庞大，占全世界病例数的55%，且肿瘤的生长和转移的速度快，对人类的健康产生极大危害。肿瘤标志物的灵敏检测，在临床上对于肿瘤的早期发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。
[0003]目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
[0004]本发明中使用的石墨烯是褶皱的二维平面薄膜，具有大的比表面积，良好的电子传递能力和催化性能，能有效吸附固载抗体。SnO2纳米粒子原位吸附在石墨烯表面，有效地避免了石墨烯片层的堆叠，而聚苯胺加入后可以大大的提高SnO2的电化学性质，并且聚苯胺的存在可以使SnO2负载石墨与抗体通过氨基更牢固的键合在一起。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素多重放大免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。
[0006]本发明的目的之一是提供一种生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法。
[0007]本发明的目的之二是将所制备的生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器应用于肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测。
[0008]本发明的技术方案，包括以下步骤。
[0009]1.一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法，步骤如下:
(1)将直径为3~ 5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μ?、0.5 ~ 1.5 mg/mL的SnO2负载石墨稀聚苯胺滴涂到电极表面，室温下瞭干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
(3)继续将6μ?,8 ~ 12 Pg/mL的肿瘤标志物捕获抗体六匕滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；
(4)继续将3μ?、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.0005 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，40C冰箱中干燥；
(6)将6μ?Λ ~ 3 mg/mL的生物素化的肿瘤标志物检测抗体8^132溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(7)将6μ?、0.1 ~ 0.3 mg/mL的链霉亲和素溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(8)将6μ?Λ ~ 3 mg/mL的生物素化氨基化Fe3O4溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器。
[0010]2.所用SnO2负载石墨烯聚苯胺、生物素化氨基化Fe 304、生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备
(1)SnO2负载石墨烯聚苯胺的制备
称取40 ~ 60 mg的SnO2负载石墨稀，量取10 mL N，N-二甲基甲酰胺，混合于50 mL烧杯中，继续加入0.04 ~ 0.06 mL苯胺，I ~ 2 mL，质量分数为37%的盐酸HCl溶液，磁力搅拌I h，后称取0.05 ~ 0.15 g过硫酸铵加入上述烧杯中，室温下超声反应12 h;离心分离得到SnO2负载石墨稀聚苯胺；
(2)生物素化氨基化Fe3O4的制备
①氨基化Fe3O4的合成
称取0.5 ~ 1.5 g Fe3O4溶解于50 ml无水乙醇中，超声时间I h，在恒温40°C、搅拌条件下加入2 ~ 6 g的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌时间8 h ;后磁分离，水洗三次，乙醇洗涤三次，室温干燥，制得氨基化Fe3O4;
②生物素化氨基化Fe3O4的合成
将1.5 ~ 2.5 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I ml的N，N_ 二甲基甲酰胺中，然后加入10 ~ 30 mg氨基化磁性Fe3O4和30 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，37°C下搅拌12 h，分别用N，N-二甲基甲酰胺和水进行三次洗涤，室温干燥，制得生物素化氨基化Fe3O4;
(3)生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备
将I ~ 3 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μ?,80-120 Pg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μ?、50mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液，4°C下保存备用。
[0011]3.肿瘤标志物的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 S，运行时间 400 s ；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μ?、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
[0012]上述所述肿瘤标志物选自下列之一:AFP、CEA、PSA 本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
[0013]本发明的有益成果
(1)本发明使用了SnO2负载石墨稀聚苯胺，石墨稀有大的比表面积，可增加抗体的结合位点，石墨烯氧化得还原石墨烯，是亲水性物质，在水中有优越的分散性，且羧基能与抗体上的氨基有效结合，SnO2纳米颗粒在石墨烯片层上原位还原能有效避免石墨烯片层的堆叠，聚苯胺加入后可以大大的提高SnO2的电化学性质，并且聚苯胺的存在可以增加了抗体结合率，使得结合更加牢固；
(2)采用生物素化氨基化Fe3O4作为捕获抗体标记物，Fe304纳米颗粒有极高的强度和良好的导电性，且对过氧化氢有催化作用，将Fe3O4氨基化后可以有效的结合生物素。十字型的链霉亲和素有四个结合位点，可以同时与四个生物素结合，其中一个位点上结合生物素化的二抗，另外三个位点结合生物素化的捕获抗体标记物，实现了三重放大电化学信号的作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；
(3)—种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器对肿瘤标志物的检测，其线性范围0.0005 ~ 10 ng/mL，检测限最低0.1 pg/mL，表明一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器可以达到准确测定的目的。
【具体实施方式】
[0014]实施例1 一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备
(1)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μ?、0.5 mg/mL的SnO2负载石墨稀聚苯胺滴涂到电极表面，室温下瞭干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
(3)继续将6μ?,8 Pg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；
(4)继续将3μ?、0.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.0005 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，40C冰箱中干燥；
(6)将6μ?Λ mg/mL的生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2S液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(7)将6μ?、0.1 mg/mL的链霉亲和素溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(8)将6μ?、I mg/mL的生物素化氨基化Fe3O4溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器。
[0015]实施例2 —种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备
(1)将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μ?、1.0 mg/mL的SnO2负载石墨稀聚苯胺滴涂到电极表面，室温下瞭干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
(3)继续将6μ?, 10 Pg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，
4 °C冰箱中干燥；
(4)继续将3μ?、1.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.0005 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，40C冰箱中干燥；
(6)将6μ?,2 mg/mL的生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2S液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(7)将6μ?、0.2 mg/mL的链霉亲和素溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(8)将6μ?、2 mg/mL的生物素化氨基化Fe3O4溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器。
[0016]实施例3—种基于生物素化氨基化Fe 304与链霉亲和素的免疫传感器的制备
(1)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μ?、1.5 mg/mL的SnO2负载石墨稀聚苯胺滴涂到电极表面，室温下瞭干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
(3)继续将6μ?, 12 Pg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，
4 °C冰箱中干燥；
(4)继续将3μ?、1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.0005 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，40C冰箱中干燥；
(6)将6μ?、3 mg/mL的生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2S液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(7)将6μ?、0.3 mg/mL的链霉亲和素溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干；
(8)将6μ?、3 mg/mL的生物素化氨基化Fe3O4溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器。
[0017]实施例4 SnO2负载石墨烯聚苯胺、生物素化氨基化Fe 30