4、生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备
(1)SnO2负载石墨烯聚苯胺的制备
称取40mg的SnO2负载石墨稀，量取10 mL N，N_ 二甲基甲酰胺，混合于50 mL烧杯中，继续加入0.04mL苯胺，I mL,质量分数为37%的盐酸HCl溶液，磁力搅拌I h，后称取0.05g过硫酸铵加入上述烧杯中，室温下超声反应12 h ;离心分离得到SnO2负载石墨烯聚苯胺；
(2)生物素化氨基化Fe3O4的制备
①氨基化Fe3O4的合成
称取0.5 g Fe3O4溶解于50 ml无水乙醇中，超声时间I h，在恒温40°C、搅拌条件下加入2 g的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌时间8 h ;后磁分离，水洗三次，乙醇洗涤三次，室温干燥，制得氨基化Fe3O4;
②生物素化氨基化Fe3O4的合成
将1.5 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I ml的N，N- 二甲基甲酰胺中，然后加入10 mg氨基化磁性Fe3O4和30 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，37°C下搅拌12 h，分别用N，N- 二甲基甲酰胺和水进行三次洗涤，室温干燥，制得生物素化氨基化Fe3O4;
(3)生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备将I mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μ?、80 Pg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μ?、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液，40C下保存备用。
[0018]实施例5 SnO2负载石墨烯聚苯胺、生物素化氨基化Fe 304、生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备
(1)SnO2负载石墨烯聚苯胺的制备
称取50 mg的SnO2负载石墨稀，量取10 mL N，N-二甲基甲酰胺，混合于50 mL烧杯中，继续加入0.05 mL苯胺，I ~ 2 mL,质量分数为37%的盐酸HCl溶液，磁力搅拌I h，后称取0.10 g过硫酸铵加入上述烧杯中，室温下超声反应12 h ;离心分离得到SnO2负载石墨烯聚苯胺；
(2)生物素化氨基化Fe3O4的制备
①氨基化Fe3O4的合成
称取1.0 g Fe3O4溶解于50 ml无水乙醇中，超声时间I h，在恒温40°C、搅拌条件下加入4 g的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌时间8 h ;后磁分离，水洗三次，乙醇洗涤三次，室温干燥，制得氨基化Fe3O4;
②生物素化氨基化Fe3O4的合成
将2.0 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I ml的N，N- 二甲基甲酰胺中，然后加入20 mg氨基化磁性Fe3O4和30 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，37°C下搅拌12 h，分别用N，N- 二甲基甲酰胺和水进行三次洗涤，室温干燥，制得生物素化氨基化Fe3O4;
(3)生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备
将2 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μ?,ΙΟΟ Pg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μ?、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液，40C下保存备用。
[0019]实施例6 SnO2负载石墨烯聚苯胺、生物素化氨基化Fe 304、生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备
(1)SnO2负载石墨烯聚苯胺的制备
称取60 mg的SnO2负载石墨稀，量取10 mL N，N-二甲基甲酰胺，混合于50 mL烧杯中，继续加入0.06 mL苯胺，2 mL,质量分数为37%的盐酸HCl溶液，磁力搅拌I h，后称取0.15 g过硫酸铵加入上述烧杯中，室温下超声反应12 h ;离心分离得到SnO2负载石墨烯聚苯胺；
(2)生物素化氨基化Fe3O4的制备
①氨基化Fe3O4的合成
称取1.5 g Fe3O4溶解于50 ml无水乙醇中，超声时间I h，在恒温40°C、搅拌条件下加入6 g的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌时间8 h ;后磁分离，水洗三次，乙醇洗涤三次，室温干燥，制得氨基化Fe3O4;
②生物素化氨基化Fe3O4的合成
将2.5 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I ml的N，N- 二甲基甲酰胺中，然后加入30 mg氨基化磁性Fe3O4和30 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，37°C下搅拌12 h，分别用N，N- 二甲基甲酰胺和水进行三次洗涤，室温干燥，制得生物素化氨基化Fe3O4;
(3)生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备
将3 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μ?、120 Pg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μ?、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液，40C下保存备用。
[0020] 实施例7肿瘤标志物AFP的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 S，运行时间 400 s ；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μ?、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
(4)根据所得电流强度与AFP浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得线性范围为0.0005 ~ 10 ng/mL，检测限为 0.1 pg/mL。
[0021 ] 实施例8肿瘤标志物CEA的检测
按照实施例7的方法对样品中CEA进行检测，其线性范围为0.001~10 ng/mL，检测限为 0.2 pg/mL。
[0022]实施例9肿瘤标志物PSA的检测
按照实施例7的方法对样品中PSA进行检测，其线性范围为0.0005 -10 ng/mL,检测限为 0.1 pg/mL。
【主权项】
1.一种基于生物素化氨基化Fe 304与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下: (1)将直径为3~ 5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净； (2)取6μ?、0.5 -1.5 mg/mL的SnO2负载石墨烯聚苯胺滴涂到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干； (3)继续将6μ?,8 ~ 12 Pg/mL的肿瘤标志物捕获抗体六匕滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥； (4)继续将3μ?、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干； (5)滴加6μ?、0.0005 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，40C冰箱中干燥； (6)将6μ?Λ ~ 3 mg/mL的生物素化的肿瘤标志物检测抗体8^132溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干； (7)将6μ?、0.1 ~ 0.3 mg/mL的链霉亲和素溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干； (8)将6μ?Λ ~ 3 mg/mL的生物素化氨基化Fe3O4溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种基于生物素化氨基化Fe304与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法，所述SnO2负载石墨烯聚苯胺、生物素化氨基化Fe 304、生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备，步骤如下: (1)SnO2负载石墨烯聚苯胺的制备 称取40 ~ 60 mg的SnO2负载石墨稀，量取10 mL N，N-二甲基甲酰胺，混合于50 mL烧杯中，继续加入0.04 ~ 0.06 mL苯胺，I ~ 2 mL，质量分数为37%的盐酸HCl溶液，磁力搅拌I h，后称取0.05 ~ 0.15 g过硫酸铵加入上述烧杯中，室温下超声反应12 h;离心分离得到SnO2负载石墨稀聚苯胺； (2)生物素化氨基化Fe3O4的制备 ①氨基化Fe3O4的合成 称取0.5 ~ 1.5 g Fe3O4溶解于50 ml无水乙醇中，超声时间I h，在恒温40°C、搅拌条件下加入2 ~ 6 g的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌时间8 h ;后磁分离，水洗三次，乙醇洗涤三次，室温干燥，制得氨基化Fe3O4; ②生物素化氨基化Fe3O4的合成 将1.5 ~ 2.5 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I ml的N，N_ 二甲基甲酰胺中，然后加入10 ~ 30 mg氨基化磁性Fe3O4和30 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，37°C下搅拌12 h，分别用N，N-二甲基甲酰胺和水进行三次洗涤，室温干燥，制得生物素化氨基化Fe3O4; (3)生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液的制备 将I ~ 3 mg生物素氨基乙酸η-羟基琥珀酰亚胺溶于I mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μ?,80-120 Pg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μ?、50mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得生物素化的肿瘤标志物检测抗体B-Ab2溶液，4°C下保存备用。3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于生物素化氨基化Fe304与链霉亲和素的免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，检测步骤如下: (1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试； (2)用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 S，运行时间 400 s ； (3)当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μ?、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。4.根据权利要求1、2、3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物选自下列之一:AFP、CEA、PSA0
【专利摘要】本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，提供了一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用生物素化Fe3O4作为标记物，制备了一种检测肿瘤标志物抗原的电化学免疫传感器。
【IPC分类】G01N33/531, G01N33/574
【公开号】CN105158469
【申请号】CN201510598028
【发明人】李月云, 姜丽萍, 王平, 刘青, 董云会
【申请人】山东理工大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月18日