一种葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子酶学与生物技术，具体涉及一种高活力葡萄糖氧化酶的编 码基因，同时涉及该突变株编码基因的制备方法。该突变基因编码的高酶活葡 萄糖氧化酶突变株蛋白，可以广泛应用于食品、医药及生物等领域。
背景技术：
葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。目前应用中使用的葡萄糖 氧化酶的生产一般都采用黑曲霉和青霉属菌株作生产菌，进行深层通风培养的方 法制取。我国和美国常以点青霉和黄色青霉为生产菌种，日本则筛选出尼崎青霉 作为常用菌种。
自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测 定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。
在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并 为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗 氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主 要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一 氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中 的葡萄糖含量，指导生产。
在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(桨)、尿液及脑脊 液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙
垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H202，还 可用于对H202敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。
GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消 化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加 剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。
由于GOD具有广泛的实用价值，随着GOD在酵母中外源表达的成功，也有 人利用定向进化的手段改造GOD，使酶活提高至原来的1.5倍，在热稳定性、pH 稳定性方面，也得到了性质改善的突变株。

发明内容
本发明的目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的编码基因 GOD-A137S,具有SEQ IDNO.l所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突变 酶，该突变酶具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。在黑曲霉GOD结构基因 中通过over-lap PCR引入突变，连接于表达载体，生产高酶活GOD突变酶，该 突变酶的酶活是野生型的2倍，同时也具有良好的热稳定性和储存稳定性。
本发明的另一个目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的制备 方法，该方法是构建酵母表达载体，利用阴离子交换层析方法纯化高酶活葡萄 糖氧化酶突变株蛋白，该方法简便，成本低廉。
本发明的再一个目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白，在食 品、医药上的应用，即一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在酒中和茶叶保鲜 中的应用。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施
本发明的一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高酶活葡萄糖 氧化酶突变株蛋白，具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，其特征是在于野生 型GOD结构基因上具有960位由G突变为T的点突变。由以下步骤制备
1. 突变酶GOD-A137S突变点的引入
(1) 设计一对诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型 GOD基因上960位的G突变为T;
(2) 上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶S朋BI及Wort进行 酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接后，转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5a/GOD-A137S;
2. 鉴定重组质粒pPIC9kGOD-A137SV:用酶切、PCR方法对重组质粒进 行鉴定，并测序检验，由此得到具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。
本发明所述的编码高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的基因GOD- A137S，
具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，有以下特征
1. 本发明所用的GOD野生型基因来自黑曲霉，长度为2303bp，其中结构 基因长度为1752bp。
2. 具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列，与野生型相比在此结构基因上 具有一处点突变，即为960位的G突变为T。
本发明要求保护的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白可用如下方法生产。该 方法包括以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三 版)J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京科学出版社中所述的条件进行。
1. 突变酶GOD-A137S编码基因中突变点的引入
(1) 设计两条诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型 GOD基因上960位的G突变为T;
(2) 上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶S"flBI及7VM进行 酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接，转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5a/GOD-A137S;
2. 鉴定重组质粒pPIC9kGOD-A137SV:用酶切、PCR方法对重组质粒进 行鉴定，并测序检验，由此得到具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列；
3. 培养大肠杆菌菌株DH5a/GOD-A137S ， 提取重组质粒 pPIC9kGOD-A137S;
4. 限制性内切酶5g/n酶切，胶回收纯化大片段，即得到酵母转化所需含
突变基因的线性DNA;
5. 电转化法转化毕赤酵母菌株GS115，经筛选和鉴定获得毕赤酵母菌株 GS115/GOD-A137S;
6. 将步骤5中所得菌株转入1000mLMD培养基中培养至OD6o()=1.2-1.5; 离心收集酵母细胞，并将细胞用50mL MM培养基洗一次；将细胞分别转入 500mL MM培养基中诱导蛋白生成，每天向培养物中补加1%甲醇，培养4-5 天；离心收取上清液；
7. 将500mL含有目标蛋白的培养物上清液超滤浓縮至20-30mL，浓縮液 在0.02mol/L、 pH6.27的磷酸二氢钠缓冲液中透析除盐24小时。蛋白质的纯化 采用Q SepharoSeTM Fast Flow阴离子交换层析柱分离、纯化，由此获得具有
SEQUENCE N0.2氨基酸序列的蛋白，由此得到具有SEQ ID N0.2所示的氨基 酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白；
8.以新鲜的Sigma公司商品GOD作标准曲线。用pH5.6、 O.lmol/L磷酸 二氢钠缓冲液配制2mg/mL葡萄糖、O.lmg/mL的ABTS和100U/mL辣根过氧 化物酶溶液。在九十六孔板中分别加入lOOpL葡萄糖溶液、100pL的ABTS和 辣根过氧化物酶溶液40)LiL，加入lpL培养液或酶液，测定OD4M。
按照以上方法可以检验本发明要求保护的突变酶的活性。纯度检测可以用 SDS-PAGE方法检测。
注以上提到的酵母培养基配方如下
MD (L—1):酵母基本氮源培养基(YNB) 1.7g，硫酸铵5g，葡萄糖20g， 生物素400ng;
MM (I/1): YNB1.7g，硫酸铵5g，甲醇12mL，生物素400吗，酪蛋白 水解物10g,pH5.6。
本发明获得高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在食品、医药及生物等相关领 域有着广泛的应用。
1. 在pH7.0的条件下，取上述所得葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶以及 ABTS混合与磷酸缓冲液中，分别加入葡萄糖标准液或酒类样品与之反应，根 据标准曲线可得酒类中葡萄糖含量。本发明所述的高酶活葡萄糖氧化酶突变株 蛋白的优势在于其酶活是野生型的2倍以上，可以有效减少酶制剂的使用量。
2. 葡萄糖氧化酶在茶叶保鲜中的应用将葡萄糖氧化酶与其底物葡萄糖混 合在一起，包装于不透水但透气的薄膜袋中，密封后置于装有茶叶的密闭容器内， 当密闭容器内的氧气透过薄膜进入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，与葡萄糖发 生反应，从而去除密闭容器内的氧，防止茶叶被氧化而导致品质劣变。
葡萄糖氧化酶是一种广泛应用的工具酶，在食品工业中主要用于除氧、去 葡萄糖；在医药行业中主要用于血糖、尿糖的测定；在生物领域中，还可以制 成相应的生物传感器和酶电极，用于检测葡萄糖浓度。
所述酵母表达载体pPIC9k和毕赤酵母菌株GS115均购自invitrogen公司。 所述大肠杆菌感受态细胞DH5a购自TaKaRa公司，可以根据所用的表达载体 选择匹配的宿主细胞。所述重组质粒pPIC9kGOD-A137S为本发明所构建。所
述大肠杆菌菌株DH5ct/GOD-A137S是具有质粒pPIC9kGOD-A137S的大肠杆菌 菌株，保藏编号CCTCCNOM207089，保藏单位中国典型培养物保藏中心，
地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2007年6月27日，分类命名大肠杆
菌DH5a/GOD-A137S。所述编码基因GOD-A137S是具有SEQUENCENO.l的 核苷酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因。所述蛋白G0D-A137S 是具有SEQUENCE N0.2的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白。
本发明的优点和效果
本发明中提供的GOD突变株的核苷酸序列和蛋白质序列是一种GOD高酶活 突变株的基因和蛋白质序列，未见报道。本株GOD突变株酶活是野生型酶活的2 倍以上，同时也具有良好的热稳定性和储存稳定性，符合实际应用的要求。而葡 萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用，是生物传感器领域最主 要的工具酶，因此，获得高酶活的GOD，具有很高的实用价值，特别是在生物 传感器的分析器件中，要在微小的面积上固定具有足够催化活性的酶，酶活的高 低显得尤为重要。


图1重组质粒的构建示意图示意图
(1) 用PCR方法扩增出GOD基因；
(2) 设计两条诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型 GOD分子137位氨基酸由Ala突变为Ser;
(3) 上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶5VjflBI及油/I进行 酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接，转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5a/GOD-A137S;
图2重组表达质粒pPIC9kGOD-A137S的PCR鉴定(b)和酶切鉴定(a) 结果(1%琼脂糖凝胶电泳)。
如图2(b)所示，以上下游引物扩增出的条带大小约为1800bp，与GOD 结构基因大小一致。
大肠杆菌-酵母穿梭质粒pPIC9k大小约9.3kb，含有两个5gZ II酶切位点。
而GOD基因内部则无5g/ II酶切位点。将质粒pPIC9k-GOD用5g/ II酶切，电 泳结果如图2 (a)中所示，5g/ II酶切pPIC9k-GOD得到2.4 kb和8.7kb两个片 段，与推测值一致。以上结果证明高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因 GOD-D401N/A574V已克隆到酵母表达载体pPIC9k。
图3纯化后的毕赤酵母菌株pPIC9kGOD-A137S诱导表达产生高酶活葡萄 糖氧化酶突变株蛋白(10 % SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)
葡萄糖氧化酶分子量约为160kDa，单体分子量为80kDa，与结果相符。
图4与野生型的热稳定性比较
在40°C中水浴保存50分钟内，野生型和GOD-A137S酶活都没有明显损失， 60分钟时野生型酶活略有下降，而GOD-A137S的酶活没有明显下降，如图4 (a)。在5(TC中水浴20分钟后，突变株GOD-A137S酶活开始快速下降，1小 时后降至原来的50%左右，而野生型酶活则下降相对缓慢， 一小时后分别降至 原来的72%,如图4 (b)。 60'C下10分钟后，野生型和GOD-A137S酶活均大 幅下降， 一小时后，野生型降至原来的30%， GOD-A137S降至原有的20。/。左 右，如图4(c)。总体而言，高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-A137S具有 良好的热稳定性，能够满足实际应用的需要。 图5与野生型的储存稳定性比较
在4。C下，野生型和GOD-A137S具有较好的储存稳定性，保存一个月后仍 保留80%以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天时野 生型有60%活力剩余，而GOD-A137S有80%活力剩余，如图5 (a)。在室温 (20-25°C)下长时间储存时，野生型和GOD-A137S的酶活都呈现逐步下降趋 势。在保存的前25天，GOD-A137S酶活的下降略高于野生型酶。但在储存后 期，野生型酶活的下降更加明显。在室温下储存一个月后，野生型和GOD-A137S 都可保留65%以上的剩余活力，40天后，两者都有40%活力剩余，如图5 (b)。 高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-A137S与野生型相比具有良好的储存稳 定性，能够满足实际应用的需要。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例中的实验方法，按
8
常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第二版，1992年， 科学出版社)中所述实验方法。
实施例l.高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的获得-
图1显示了重组突变葡萄糖氧化酶基因的构建原理和过程。天然的成熟的 葡萄糖氧化酶为同源二聚体，每个单体含583个氨基酸，基因长为1800bp左右。 1.突变酶GOD-A137S编码基因中突变点的引入
1)设计两条诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型GOD 基因上960位的G突变为T;
设计葡萄糖氧化酶定点突变所需引物序列 上游引物5，- CCACTACGTAAGCAATGGCATTGAAG陽3， 下游引物5，國TATGCGGCCGCTCACTGCAT -3'
定点突变引物
960a:5' —GAGTAGGCGG^CACATTGTC- 3' 960s:5' -GGGACAATGTGICCGCC -3'
用下游引物与引物960s以野生型葡萄糖氧化酶基因片段为模板，扩增出 137的长片段，PCR循环条件94°C 5min; 94°C lmin， 55°C lmin, 72°C lmin30sec， 30个循环；72。C6min30sec。 PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳 试剂盒回收。
用上游引物与960a以野生型葡萄糖氧化酶基因片段为模板，扩增出137 的短片段，PCR循环条件94°C 5min; 94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 30sec， 30个循环；72°C 5min。 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
然后将回收的两种PCR产物混合，加入上、下游引物进行第二次PCR， PCR反应条件为94°C 5min; 94。C lmin， 60。C lmin， 72。C 2min， 5个循环；94。C lmin， 54°C lmin， 72°C 2min， 30个循环；72°C 7min。 PCR扩增产物经1^琼 脂糖凝胶电泳试剂盒回收。得到含有突变位点A137S的葡萄糖氧化酶基因片段。
(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶S"flBI及A^I对所 得质粒进行酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接，转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5a/GOD-A137S;用限制性内切酶SwaBI及 A/ort进行分步酶切，酶切产物用PCR产物回收试剂盒回收后，用T4连接酶与
经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接，16i:连接过夜后连接产物转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，用氨苄青霉素(Amp) —LB平板筛选得到阳性菌落，经过 鉴定(见下一步骤)，命名为大肠杆菌菌株DH5a/GOD-A137S。
2. 质粒pPIC9kGOD-A137S的鉴定
用质粒抽提试剂盒从阳性菌落DH5a/GOD-A137S培养物中分别提取质粒 pPIC9kGOD-A137S，用限制性内切酶5g/II进行酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检査， 结果产生2.4Kb和8.7Kb两条带，如图2 (a)，与预期大小相符。进一步用PCR 进行鉴定，以重组质粒为模板，用上、下游引物进行PCR，可以得到大小为1.8kb 的扩增带，如图2 (b)，与预期大小相符。
质粒上GOD-A137S基因的测序由英俊(iiwitrogen)生物技术有限公司进 行。测序引物是利用pPIC9k质粒上的通用引物5，AOXl和3，AOXl，测序结果 表明获得的GOD-A137S基因序列与预期设计完全一致，由此得到具有SEQ ID NO.l所示序列的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因GOD-A137S。 GOD-A137S基因全长1752nt(包括终止密码TGA)，编码583个氨基酸的蛋白。 将产生的质粒命名为pPIC9kGOD-A137S。
3. 重组质粒pPIC9kGOD-A137S的提取
将DH5a/GOD-A137S接种到LB培养基，37'C过夜培养，用质粒抽提试剂 盒提取质pPIC9kGOD-A137S。
4. 限制性内切酶^g/n酶切，胶回收纯化大片段，即得到酵母转化所需含
突变基因的线性DNA。
5. 电转化法转化毕赤酵母菌株GS115，经筛选和鉴定获得毕赤酵母菌株 GS115/GOD-A137S。
(1) GS115感受态细胞的制备 将GS115接于50mL液体YPD培养基中30。C培养过夜，再以2: 100的比
例接种于500mlYPD中30。C培养至OD600=1.2-1.5 ， 4。C1500g离心收集细胞； 用500mL冰冷的无菌水重悬细胞，4'C1500g离心收集细胞；再用250mL冰冷 的无菌水重悬细胞，4'C1500g离心收集细胞；接着用40ml冰冷的lmol/L山梨 醇重悬细胞，4'C1500g离心收集细胞；重悬细胞于lmLlmol/L山梨醇。
(2) 重组质粒pPIC9kGOD-A137S转化GS115:
lOOiiL感受态细胞与5-l(Hig线性化质粒DNA (Sg/n切)混合，转入冰冷 的电转杯，放置5分钟；电击细胞与DNA的混合物(1.5kv， 4.2-4.9ms);加入 lmL冰冷的lmol/L山梨醇，继续放置30min;再加入0.5mLSOS (0.3xYPD， lmol/L山梨醇)，30。C放置2小时，偶尔摇动志菌体不易沉淀；用lmol/L山梨 醇稀释菌体后涂布于固体MD培养基。3(TC培养4-6天后挑取阳性菌落。经过实 施例3鉴定，将能产生GOD-A137S蛋白的菌株命名为GS115/GOD-A137S。
6.毕赤酵母菌株GS115/GOD-A137S经甲醇诱导产生GOD-A137S蛋白
从上述MD平板中挑取GS115/GOD-A137S单菌落于20mLMD培养基中培养 过夜；将培养物转入500mLMD培养基中培养至OD6o『1.2-1.5;离心收集酵母细 胞，并将细胞用20mLMM培养基洗一次；将细胞分别转入250mLMM培养基中 诱导蛋白生成，每天向培养物中补加1%甲醇，培养4-5天；离心收取上清液。 7.蛋白GOD-A137S的纯化
将近500mL含有目标蛋白的培养物上清液超滤浓縮至20-30mL,浓縮液 在0.02mol/L、 pH6.27的磷酸二氢钠缓冲液中透析除盐24小时，以保证阴离子 交换柱的吸附性质。
蛋白质的纯化采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，柱子用 20mM磷酸二氢钠(pH6.3)平衡，上样后，用20mM磷酸二氢钠，0 — 0.2M NaCl(pH6.3)梯度洗脱，用核酸蛋白质检测仪(波长280nm)监视收集，葡萄糖 氧化酶最先直接从柱中流出(带黄色)。由此得到分离纯化的如SEQUENCE N0.2所示的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V。
实施例2毕赤酵母菌株GS115/GOD-A137S表达GOD-A137S蛋白的活性 检测及其他酶学性质检测
以新鲜的Sigma公司商品GOD作标准曲线。用pH5.6、 0.1mol/L磷酸二 氢钠缓冲液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根过氧化 物酶溶液。在九十六孔板中分别加入100nL葡萄糖溶液、100pL的ABTS和辣 根过氧化物酶溶液40pL，加入lpL培养液或酶液，反应3-5分钟后测定OD414。
用Bio-Rad公司生产的蛋白质浓度测定试剂盒测定，以BSA作标准曲线。
计算酶比活
EnzymesSpecific activity(U/mg protein)
Wild type369.8±63.8
A137S1210.4±307.13
热稳定性分析-
催化活性提高的突变体有时会伴随热稳定性的降低，将野生型和突变株酶
液分别置于4(TC、 50°C、 6(TC下，每隔十分钟取样测定剩余酶活，评价了酶的 热稳定性。结果见图4。在40。C中水浴保存50分钟内，野生型和GOD-A137S 酶活都没有明显损失，60分钟时野生型酶活略有下降，而GOD-A137S的酶活 没有明显下降，如图4 (a)。在5(TC中水浴20分钟后，突变株GOD-A137S酶 活开始快速下降，1小时后降至原来的50%左右，而野生型酶活则下降相对缓 慢， 一小时后分别降至原来的72%，如图4 (b)。 60'C下10分钟后，野生型和 GOD-A137S酶活均大幅下降， 一小时后，野生型降至原来的30%， GOD-A137S 降至原有的20%左右，如图4 (c)。总体而言，高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋 白GOD-A137S具有良好的热稳定性，能够满足实际应用的需要。 储存稳定性分析
将酶液保存在4"C和室温下，定期取样测定酶活，评价了酶的储存稳定性。 结果见图五。在4"下，野生型和GOD-A137S具有较好的储存稳定性，保存一个 月后仍保留80%以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天时 野生型有60%活力剩余，而GOD-A137S有80Q/。活力剩余，如图5(a)。在室温(20-25 °C)下长时间储存时，野生型和GOD-A137S的酶活都呈现逐步下降趋势。在保 存的前25天，GOD-A137S酶活的下降略高于野生型酶。但在储存后期，野生型 酶活的下降更加明显。在室温下储存一个月后，野生型和GOD-A137S都可保留 65%以上的剩余活力，40天后，两者都有40%活力剩余，如图5 (b)。高酶活葡 萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-A137S与野生型相比具有良好的储存稳定性，能够 满足实际应用的需要。
GOD-A137S在酶活提高的同时，热稳定性和储存稳定性并未有大的损失， 满足实际应用的要求。 实施例3葡萄糖氧化酶在酶法测定酒中葡萄糖含量中的应用
在pH7.0的条件下，取上述所得葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶以及ABTS
混合与磷酸钠缓冲液(0.1mol/L)中，其中葡萄糖氧化酶终浓度为10U/mL，辣
根过氧化物酶终浓度为10U/mL， ABTS终浓度为0.1mg/mL。
取上述混合液3mL，分别加入葡萄糖标准液或酒类样品0.5 mL与之37°C
水浴反应10min，测定其在414nm处的吸收。根据标准曲线可得酒类(白酒、
红酒、啤酒)中葡萄糖含量。本法在含葡萄糖150 mg/L以内，吸光度与样品葡
萄糖含量具有良好的正相关性。故测定范围在0-150 mg/L。
实施例4葡萄糖氧化酶在茶叶保鲜中的应用
将葡萄糖氧化酶与其底物葡萄糖以摩尔比l: 100000的比例混合在一起，包 装于不透水但透气的薄膜袋中，密封后置于装有茶叶的密闭容器内，加入量为 6-8g混合物/L，当密闭容器内的氧气透过薄膜进入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用 下，与葡萄糖发生反应，从而去除密闭容器内的氧，防止茶叶被氧化而导致品质 劣变，茶叶的保质期延长至18-24个月。
葡萄糖氧化酶是一种广泛应用的工具酶，在食品工业中主要用于除氧、去 葡萄糖；在医药行业中主要用于血糖、尿糖的测定；在生物领域中，还可以制 成相应的生物传感器和酶电极，用于检测葡萄糖浓度。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院武汉病毒研究所
<120> —种葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
<130> —种葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
<160> 2
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 2303
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 1
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515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gin Gly Leu
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Arg Val lie Asp Gy Ser lie Pro Pro Thr Gin Met Ser Ser His Val 545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys lie Ser Asp Ala lie Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gin 580
权利要求
1.一种分离的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因，其序列为SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2. —种分离的蛋白，其序列为SEQIDNa2所示的氨基酸序列。
3. —种大肠杆菌，其特征在于大肠杆菌(Esc/zeWcWfl co/z')DH5a/GOD- A137S， CCTCC NO.M207089。
4. 一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在酒中的应用。
5. —种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在茶叶保鲜中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄糖氧化酶突变体编码基因及制备方法和应用。这种高活力葡萄糖氧化酶突变体的编码基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步骤是首先设计一对诱变引物；第二是获得大肠杆菌菌株DH5α/GOD-A137S；第三是鉴定重组质粒pPIC9kGOD-A137S；第四是培养大肠杆菌菌株DH5α/GOD-A137S；第五是得到含突变基因的线性DNA；第六是获得毕赤酵母菌株GS115/GOD-A137S；第七是诱导纯化获得目的蛋白。本发明方法易行，成本低廉，高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在食品糖类检测和保鲜中的应用，具有很高的实用价值。
文档编号C12G3/02GK101348795SQ20071005278
公开日2009年1月21日 申请日期2007年7月19日 优先权日2007年7月19日
发明者丹 刘, 周亚凤, 张先恩, 张治平, 郭永超 申请人:中国科学院武汉病毒研究所