一种乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建方法

专利名称：一种乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法。
背景技术：
乳链菌肽(Nisin)亦称为乳酸链球菌素，是由乳酸乳球菌(丄"ctoco"附/ac似)产生的一种含34个氨基酸 的小肽抗菌物质，对许多革兰氏阳性菌，包括引起食品腐败和对人体健康有害的葡萄球菌 (Stop/^/ococcitf)、链球菌(^rc/^ococc船)和利斯特氏菌("Wer/a)等有强烈抑制作用。1962年日本的Hara 证实了乳链菌肽对鼠的半致死量LD50约为7000mg/kg(体重)，与普通食盐的LD50相近，1969年 FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会确认Nisin是一种安全、高效的天然食品防腐剂，到目前为止， 己被世界50多个国家和地区(包括我国大陆、台湾和香港)广泛应用于肉类、鱼类、牛奶、干酪、蛋类、水 果、蔬菜、果汁饮料、啤酒酿造、豆制品等食品的防腐处理，并且随着应用研究的深入,Nisin应用范围目 前已扩展到造纸、农业饲料、医学移植、生殖避孕等(张国只,陈林海，王雁萍等.乳链菌肽应用新进展[J]， 食品科学，2006, 22 (5): 102)。 Nisin的研究己经经历了半个多世纪，但是在菌种改造方面仍然以传 统诱变育种为主，而传统诱变育种需要消耗大量的人力和物力，存在盲目性，i:作量大，而且效率低等缺 点。在基因工程菌方面报道很少，只有韩国的Cheigh等通过在乳链菌肽产生菌丄actococcws /acris /acfe 中增加nisRK,nisFEG等基因的拷贝数来提高nisin产量。但是现在Nisin的生产水平仍然很低，成本 高，远不能满足市场的需求。 一个很重要的原因是乳酸乳球菌的能量的低产生和高消耗，导致低生物量 和Nisin低产量。乳酸乳球菌不具备完整的三羧酸循环，其能量的产生主要来源于糖酵解途径，即1摩 尔葡萄糖净生成2摩尔ATP，并产生大量乳酸，而通过质子泵( 1+—ATPase)向胞外运输H+来维持胞 内的中性环境需要消耗大量ATP,能量的低产生和高消耗,使得乳酸乳球菌的生物量很低(O'Sullivan E, Condon S. Relationship between acid tolerance,cytoplasmic pH， and ATP and H+—ATPase levels in chemostatcultures of丄a"ococ， /ac"s[J].Appl Environ Microbiol, 1999,65(6): 2287)。而谷氨酸脱羧 酶系统是微生物的一种耐酸机制，即谷氨酸通过转运体进入胞内后，在谷氨酸脱羧酶的作用下脱掉 --个羧基，生成一个比谷氨酸更偏碱性的Y-氨基丁酸，并消耗一个H+，'Y-氨基丁酸再通过转fe体 送出胞外，这导致了胞内胞外pH值，同时上升(Small, P. L., and S. R. Waterman. Acid stress, anaerobiosis and gadCB: lessons from丄a"ococcjw /acfc and foc/ze"'c/"'a co//.卩]Trends Microbiol. 1998, 6:214)。 Higuchi et al研究认为谷氨酸脱羧酶连续三个脱羧反应还可以形成产生一个ATP分 子所需要的质子势动力，即可以产一个ATP分子(Higuchi T, H Hayashi， and K. Abe, Exchange of glutamate and gamma-aminobutyrate in a丄acfo&aci〃ws strain[J]. J. Bacteriol. 1997, 179:3362)。乳酸乳 球菌的乳酸亚种虽然有谷氨酸脱羧酶系统，但是这个酶系需要在较酸性环境下才能诱导表达，而起 不到节约能量的作用 (DE BIASE D，TRAMONTI A,BOSSA F，et al.The response to stationary-phase stress conditions in五sc/ze".c/n'a co": role and regulation of the glutamic acid decarboxylase system[J]. Mol Microbio1,1999,32:1198)(

发明内容
本发明的目的在于提供一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法。 本发明所述的乳链菌肽基因工程菌的构建方法，其特征在亍以乳酸乳球菌"actococcw facto) i11403总DNA为模板，扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gs沈B。将g3dCS基因克隆 到表达载体pMG36e中，然后再用重组表达质粒pMG36egad电转化nisin产生菌丄actococcus /acto ATCC 11454，获得本发明的乳链菌肽基因工程菌，将该基因工程菌命名为MELgad。
利用本发明方法所构建的的基因工程菌MELgad做初步发酵性能测试，本发明的基因工程菌MELgad的 生物量和乳链菌肽产量比原始菌(宿主菌)分别提高了 39%和24%。这为乳链菌肽高产工程菌的构 建开辟了一条新的途径。
本发明是这样实现的
一种乳链菌肽工程菌MELgad的构建方法，按照以下步骤
(1) 、 PCR引物设计和扩增根据GeneBank公布的丄a"ococc^ /ac^ i11403基因组序列，利用 Primer premier5.0软件设计如下一对引物
5'端引物5' CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3' ， 3'端引物5' ATGCTGCAG TGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3'，在所述引物5'端的F划线部分分别引入 Sac I和Pst I酶切位点；
(2) 、谷氨酸脱羧酶基因(卵^C5)的克隆通过PCR技术，以丄actococc^ /acto i11403总DNA 为模板，以步骤(1)所示的引物和LATaqDNA聚合酶(购自Takara公司)扩增得到编码谷氨酸脱 羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB。该谷氨酸脱羧酶基因(卵c/C^)的核苷酸序列具有如序列 表SEQIDNO: l所示的序列。与报道的谷氨酸脱羧酶基因序列是一致的。
(3) 、重组表达质粒pMG36egad的构建
1) 在克隆的卵"O 基因的两端分别引入引入Sac I和Pst I酶切位点，经纯化后用限制性内切酶Sac I和Pst I酶切；
2) 将从大肠杆菌TGI抽取的表达载体pMG36e用用限制性内切酶Sac I和Pst I酶切；
3) 将步骤l)和2)的酶切产物用T4DNA连接酶连接；
4) 用步骤3)的限制性内切酶酶连产物转化大肠杆菌TG1;
5) 少量快速提取筛选阳性重组子；
6) 对阳性重组子进行验证，
(4) 、用重组表达质粒pMG36egad电转化乳酸乳球菌(丄actococc附/ac"s ATCC 11454)，得到基因工 程菌株MELgad候选菌株，和
(5) 、对步骤(4)的候选基因工程菌做发酵性能测定，筛选得到基因工程菌MELgad。 上述步骤(2)所述的PCR条件是在25 u L反应体系中，引物浓度为lpmol/u L; dNTP各25pmo1/
liL， Mg2+25pmol/y L ,PCR扩增条件:95'C预变性5min; 95。C20s，55。C45s,72'C3min，进行25个循 环；72。C7min。
上述步骤(3)所述的PCR产物酶切反应体系为 PCR产物20 ul H20 29 ul
Sac I 2. 5 ul Pst I 2. 5 ul
M Buffer6 ul
37'C反应4小时；反应结束后于65。C保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。
上述步骤(3)所述的表达载体pMG36e的酶切反应体系(60ul)为
pMG36e 20ul
H20 29 ul
Sac I 2. 5 ul
Pst I 2. 5 ul
M Buffer 6 ul
37'C反应4小时；将酶切后的DNA溶液于65'C保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。 所述的表达载体pMG36e和PCR产物的酶连反应体系为 PCR产物 5ul pMG36e lul Buffer lul T4 Ligase 0.5ul H20 2.5ul
4'C过夜反应；反应结束后65'C保温IO分钟，以灭活T4DNA连接酶。 酶连产物转化大肠杆菌TG1的方法是
(1) 制备大肠杆菌TG1的感受态细胞用牙签接一大肠杆菌TG1 (张岚岚等，大肠杆菌感受态细胞转化 能力的影响因素，细胞生物学杂志，2004， 26 (4): 429-432)单菌落于5miLB中过夜振荡培养；然后按 体积比为P/。大肠杆菌菌液转接于5mlLB中，培养至OD600为0.5 0.8左右停止培养；吸取该菌液1.5ml于 Eppendorf管中，将菌液冰浴5min, 4'C4000r/min离心4min，倾去上清，用手指轻弹管底使菌体分散在残 余的液体中；加入500ul冰冷的0.1MCaC12，用移液枪轻轻打散菌体，继续冰浴30min， 3000r/min离心4min, 倾去上清；加入100ul冰冷的0.1MCaCI2，得到用于转化的悬浮菌体，或将该悬浮菌体于-7(TC保存备用；
(2) 酶连产物转化每管加入5—10ul酶连产物和大肠杆菌感受态细胞冰浴30min， 42。C热激90sec， 冰镇1分钟，再加入600ulLB置于37'C振荡培养45min是使其转化，然后涂含有lmg/L红霉素的选择平板。
少量快速提取筛选阳性重组子的方法是从平板上挑取大量转化子，并将转化子划线扩大培养12h， 用接种环挑取一环菌体悬浮于添加葡萄糖50 mmol/L， Tris'HCl 25 mmol/L和EDTA 10mmol/L 50lU的 快检液中，加入25ul0.3MNaOH2n/。碱性十二烷基磺酸钠溶液，立即振荡混合完全，然后打开管盖，在70 'C放置15min后，于水浴中冷却至室温，加入10yl体积比为25:24: 1的酸性苯酚/氯仿/异戊醇.溶液，然 后将液体彻底混合均匀，混匀后在12000r/min离心5min，上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测(J.萨姆布 鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002年版)。结果显示，阳性重组子约占70%。
阳性重组子的验证的方法是抽取阳性重组子质粒，再用限制性内切酶Sac I和Pst I进行酶切， 酶切反应体系为(60ul):
重组质粒 2Q ul
H20 29 ul
Sac I 2. 5 ul
Pst I 2. 5 ul
M Buffer 6 ul
37'C反应4小时；酶切结束后琼脂糖电泳检测。并将重组质粒送北京奥科生物技术有限公司进行序列 重组表达质粒pMG36egad电转化Zactococcz /acto ATCC 11454的方法是
(1 ) Zactococc^ ATCC 11454电转化感受态制备将Zactococc附/acfe ATCC 11454单菌
落接种于5mLM 17 (培养基组成按g/L计胰蛋白胨50.0， 大豆胨50.0，牛肉膏50.0， 酵母 膏25.0， 抗坏血酸5.0， MgS04.7H20 2.5， 磷酸甘油二钠190.0 ，琼脂15.0%， 调pH至6.9 ) 培养基中，3(TC静置培养过夜;按培养基体积1%接种量转接过夜培养物到含1%甘氨酸的GSM 17 (培养基组成M 17培养基+1%甘氨酸+17.1%蔗糖)培养基中，30。C静置培养至OD6。。=0.2-0.5 (约 需6—8小时);然后在4'C ， 5，000卬m离心10min，收集菌体;用等体积冰冷的菌体电转缓冲溶液(蔗 糖0.5mol/L，甘油10%(V/V))重悬、洗潘细胞。4 °C ， 5,000卬m离心15min,弃上清。重复上述 操作一次;弃上清，吸干液体，菌体悬浮于1/100体积的冰冷菌体电转缓冲溶液(蔗糖0.5mol/L，甘 油10%(V/V))，置于冰浴备用。
(2)电击转化在45uL丄actococc^ATCC 11454电转化感受态细胞中加1-2 uL重组表达 质粒pMG36egad溶液,混匀后加入预冷的2mm电击杯中；冰浴10 min后电击，条件为25u F， 1OKV/cm; 电击后立即加1 mL冰冷的SM17培养基至30'C培养4小时；取电击过的菌液0.1mL涂于加含lug/ml 红霉素选择平板上，30'C培养48小时。
更详细的技术方案如下所述
乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建
1. 目的基因PCR
以丄a"ococcM /acto i11403 (由法国国家农学研究院的Bolotin教授惠赠)总DNA为模板，用 LA Taq DNA 聚合酶扩增 gadCB 基因 ， 5' 端引物 5' CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3' ， 3'端弓|物5' ATGCTGCAG TGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3'，在上述两条引物的两端(即引物的下划线部分)分别引 入Sac I和Pst I酶切位点。上述引物由北京奥科生物技术有限公司合成，在25 y L反应体系中，上述 两条引物的浓度均为lpmol/u L; dNTP各25pmol/" L。PCR扩增条件:95。C预变性5min; 95。C20s,55 'C45s,72。C3min，进行25个循环；72。C7min。
2. 重组质粒和菌株的构建
PCR产物采用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，产品编号为 AP-GX隱5())回收纯化后，用限制酶Sac I和Pst I酶切，克隆入载体pMG36e (荷兰Groningen大学J. Kok 博士惠赠)多克隆位点处的限制酶位点SacI和PstI ，转化大肠杆菌TG1 (张岚岚等，大肠杆菌感受态 细胞转化能力的影响因素，细胞生物学杂志，2004, 26 (4) : 429-432)，然后挑取大肠杆菌TG1转化子， 抽取质粒得到gadCB组成型表达质粒pMG36egad,再在表达质粒pMG36egad限制位点Sac I和Pst I处用 Sac I及Pst I酶切验证和测序验证。重组质粒pMG36egad电转化丄actococc船/acfe ATCC 11454 (购自美 国菌种保藏中心，保藏编号为ATCC 11454)，得到本发明的乳链菌肽基因工程菌，将该菌命名为MELgad。


图1:是本发明的乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建过程示意图。 图2:是本发明重组质粒pMG36egad的构建示意图
图3:是本发明克隆的基因工程菌MELgad与原始菌(宿主菌)Lactococcus lactis ATCC 11454发 酵液的抑菌圈大小对比图。发酵液都稀释100倍测定。图中代号如下CK:原始菌(宿主菌)Lactococcus lactis ATCC 11454; 1、 2、 3:本发明的基因工程菌候选菌株；4:本发明的基因工程菌MELgad
图4:是本发明克隆的基因gadCB PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 以丄actococc^ /acto i 11403总DNA为模板，扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白 的基因gadCB。将gadCB基因克隆到表达载体pMG36e中，然后再用重组表达质粒pMG36egad电转 化nisin产生菌￡actococc"s /acto ATCC 11454，获得乳链菌肽基因工程菌MELgad。
乳链菌肽基因工程菌MELgad具体构建步骤为
1、 PCR引物设计和扩增根据GeneBank公布的gadCB基因序列(登录号AE005176)利用Primer premier5.0软件设计了一对引物
5'端引物5' CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3', 3'端引物5' ATGCTGCAG TGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3'，在该5'端引物和3'端引物的两端(见引物 的下划线部分)分别引入Sac I和Pstl酶切位点。
在25uL反应体系中，上述两条引物浓度均为lpmol/uL; dNTP各25pmol/iiL， Mg2+25pmol/ u L ,PCR扩增条件:95。C预变性5min; 95。C20s,55。C45s，72。C3min，进行25个循环；72。C7min。
将PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第二版，2002年版)， 结果显示得到一条约3kb的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合。
2、 PCR产物的回收与酶切
PCR产物的回收采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，产 品编号为AP-GX-50)。根据扩增gadCB基因所用引物两端的酶切位点Sac I和Pst I , PCR产物用限 制酶Sac I和Pst I进行酶切，产生带有单链突出端的DNA片段，为下一步的互补粘性末端连接做 准备，具体操作步骤
(1) 酶切反应体系(60ul), PCR产物20 ul H20 29 ul
Sac I 2. 5 ul Pst I 2. 5 ul
M Buffer6 ul 条件37'C反应4小时；
(2) 酶切后的DNA溶液* 65。C保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。
3、 表达载体pMG36e的抽提与酶切
表达载体pMG36e用碱裂解法(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002)提取，根据表达 载体pMG36e的多克隆位点处及gadCB基因两端所含有的Sac I和Pstl酶切位点，确定酶切反应体系 (60ul)为
pMG36e 20ul H20 29 ul
Sac I 2. 5 ul
Pst I 2. 5 ul
M Buffer 6 ul
条件37。C反应4小时；酶切后的DNA溶液于65。C保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。
4、 PCR产物和表达载体pMG36e的连接
经过相同双酶切并且纯化了 PCR产物和表达载体pMG36e的酶连反应体系为 PCR产物 5ul
pMG36e lul Buffer lul T4 Ligase 0.5ul H20 2. 5ul
4'C过夜反应；反应结束后65'C保温10分钟，以灭活T4DNA连接酶。
5、 酶连产物转化大肠杆菌TGI
大肠杆菌TG1的感受态制备方法用牙签接一大肠杆菌TG1 (张岚岚等，大肠杆菌感受态细胞转化能力 的影响因素，细胞生物学杂志，2004， 26 (4): 429-432)单菌落于5ml LB屮过夜振荡培养；然后按1%培 养基体积转接于5mlLB中，培养至OD600为0.5 0.8左右停止培养；吸取1.5ml于Eppendorf管中，将菌液 冰浴5min， 4°C4000r/min离心4min，倾去上清，用手指轻弹管底使菌体分散在残余的液体中；加入500ul冰 冷的0.1MCaC12,用移液枪轻轻打散菌体，继续冰浴30min， 3000r/min离心4min，倾去上清；加入100ul冰 冷的0.1MCaC12，悬浮菌体，即可用于转化，或-7(TC保存备用。酶连产物转化转化时每管加入5—10ul酶 连产物和大肠杆菌感受态细胞冰30min。 42'C热激90sec，冰镇1分钟，再加入600ul LB置于37'C振荡培养 45min。涂含有lmg/L红霉素的选择平板。
6、 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取筛选阳性重组子
从平板上挑取大量转化子，并将转化子划线扩大培养12h，用接种环挑取一环菌体悬浮于50ul快检 液(葡萄糖50 mmol/L， Tris.HCl 25 mmol/L， EDTA 10mmol/L)中，加入25 u 1碱性十二烷基磺酸钠 (SDS)溶液(0.3MNaOH2%SDS),立即振荡混合完全，然后打开管盖，在7(TC放置15min后，于水 浴巾冷却至室温，加入10u 1酸性苯酚/氯仿/异戊醇.(体积比为25 : 24 : 1).溶液，然后将液体彻底混合均 匀，混匀后在12000r/min离心5min，上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测(J.萨姆布鲁克，分子克隆实 验指南第二版，2002)。结果显示，阳性重组子约占70%。
7、 阳性重组子的双酶切和测序验证
抽取阳性重组子质粒，再用限制酶Sac I和Pst I进行酶切，酶切反应体系为(60ul):
重组质粒 20 ul
H20 29 ul
Sac I 2. 5 ul
Pst I 2. 5 ul
M Buffer 6 ul
条件37'C反应4小时；酶切结束后琼脂糖电泳检测。结果显示重组质粒完全正确。然后将重组质粒送 北京奥科生物技术有限公司进行序列测定，结果与文献报道序列完全相符。将获得的重组质粒命名 为pMG36egad。
8、 重组表达质粒pMG36egad电转化￡actococcz /acto ATCC 11454
丄a"ococczw /acfc ATCC 11454电转化感受态制备接 一 丄actococcws /acto ATCC 11454单菌落十 5mLM17 (g/L:胰蛋白胨50.0， 人豆胨50.0，牛肉膏50.0， 酵母膏25.0， 抗坏血酸5.0， MgS04.7H20 2.5， 磷酸甘油二钠190.0 ，琼脂15.0， pH 6.9 )培养基中，30。C静置培养过夜; 按培养基体积1%接种量转接过夜培养物到含1%廿氨酸的GSM 17 (M 17+1%甘氨酸+ 17.1%蔗糖) 培养基中，30'C静置培养至Of>,=0.2-0.5，约需6—8小时;然后在4'C , 5,000rpm离心1 Omin,收 集菌体;用等体积冰冷的菌体电转缓冲溶液(蔗糖O.5mol/L，甘油10。/。(V/V))重悬、洗涤细胞。4 。C , 5，000rpm离心15min,弃上清。重复上述操作一次;弃上清，吸干液体，菌体悬浮于1/100体积的冰
冷菌体电转缓冲溶液(蔗糖0.5mol/L，甘油10%(V/V))，置于冰浴备用。电击转化在45uL丄actococcztf /acto ATCC 11454电转化感受态细胞中加1-2 uL重组表达质粒pMG36egad溶液,混匀后加入预冷的 2mm电击杯中；冰浴10min后电击，条件为25u F,10KV/cm;电击后立即加lmL冰冷的SM17培养 基至30'C培养4小时；取电击过的菌液O.lmL涂于加含lug/ml红霉素选择平板上，30。C培养48 小时。
9、阳性克隆的筛选与PCR验证
将挑取的丄actococcw facto ATCC 11454转化子抽取质粒，用限制酶Sac I禾[l Pst I进行酶切验 证，再以经过酶切验证后的质粒为模板，以扩增gadCB基因的引物为引物进行PCR验证，PCR反应 条件为在25 u L反应体系中，引物浓度皆lpmol/u L; dNTP各25pmol/u L， Mg2+25pmol/u L ,PCR 扩增条件:95。C预变性lmin; 95°C20s，55°C45s,72°C3min，进行25个循环；72。C7min。 PCR产物用
0. 8、琼脂糖凝胶电泳，结果显示得到一条约3kb的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合， 说明已经成功获得含有重组表达质粒pMG36egad的工程菌，并将该工程菌命名为MELgad 。
工程菌MELgad中谷氨酸脱羧酶系的表达分析。
1、 SDS-PAGE分析
将活化好的工程菌MELgad和原始菌ATCC11454按培养基体积1%的接种量接种，在5-7小时 左右，达到对数期，各取样1.5mL，离心，TE溶液(Tri s-HCl 10mM， EDTA lmM)洗涤两次， 再加入100^iLTE溶液和2(VL10mg/ml的溶菌酶(购自华美生物工程公司)处理1个小时，煮沸3min，离 心，取上清即可使用。SDS-PAGE凝胶制备好后点样，每个点5—15uL，然后电泳、染色及脱色(J.萨姆 布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002) 。 SDS-PAGE结果表明谷氨酸脱羧酶系在丄程菌MELgad 中获得了组成型表达，而丄actococcitf /acfe ATCC 11454则没有。
2、 谷氨酸脱羧酶酶活测定
参照许建军等报道的方法进行谷氨酸脱羧酶活测定(许建军等，比色法快速测定乳酸菌谷氨酸 脱羧酶活力及其应用[J]， 2004),从本发明克隆的基因工程菌MEL4gad中提取谷氨酸脱羧酶为实验 材料，测定重复三次。结果显示，本发明克隆的基因工程菌的酶活为6.9U/mg ，而对照菌 (ATCC11454)几乎检测不到酶活，说明本发明克隆的gadCB基因在乳酸乳球菌中得到了活性表达。 本发明的基因工程菌MELgad和原始菌ATCC 11454的发酵性能试验
将活化好的本发明的基因工程菌MELgad和原始菌ATCC 11454以体积比1 %的接种量接入发酵培 养基(培养基配方，按g/L:大豆蛋白胨20.0,蔗糖20.0，酵母提取物5.0,谷氨酸钠5.0， Na2HP04'12H20 10.0， MgS04.7H20 0.12， pH 7.0)中，在2L的NBS发酵罐(购自美国NBS公司) 中3(TC发酵16小时，按照常规方法收集菌体并测定菌体的干重。Nisin效价的测定采用报道的琼脂 平板扩散法(参见张国只，琼脂平板扩散法测定乳链菌肽效价的优化，食品科学，2007 (3) 175-177) 进行。结果显示本发明的基因工程菌MELgad和原始菌ATCC 11454的菌体干重分别为1.3 5g/L ， 0.97g/L; 发酵液nisin效价分别为1104U/ml, 8901U/ml(见说明书附图3)。基因工程菌MELgad的生物量提高了 39%, nisin效价提高了24。/。，发酵终点pH值MEL4gad为4.7,原始菌ATCC11454为4.2，说明谷氮酸 脱羧酶在本发明的基因工程菌中的组成型表达减小了乳酸累积给细胞带来的压力，同时节约了能 量，改善了发酵性能，有利于菌体的生长。
序歹!j 表
<110> 华中农业大学
<120> —种乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建方法 <130〉
〈141〉 2007-06-06 <160〉 3
<170〉 Patentln version 3.1 〈210〉 1
<211> 2932 〈212〉 DNA
〈213〉 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) <220>
<221〉 CDS
〈222〉(1).. (1512)
<223>
<220>
<221〉 CDS
<222>(1532).. (2932)
<223〉
〈400〉 1
atg aat caa aaa aaa ata tea tta ttc ggt ttt ttt gca tta acc g'ct 48 Met Asn Gin Lys Lys lie Ser Leu Phe Gly Phe Phe Ala Leu Thr Ala 15 10 15
tea atg gtt ttg act gtc tat gag tat cca act ttt gec acg tea aaa % Ser Met Val Leu Thr Val Tyr Glu Tyr Pro Thr Phe Ala Thr Ser Lys
20 25 30
tta cat ttg gtg ttc ttt tta ctt etc gga gga eta etc tgg ttt ttg 144 Leu His Leu Val Phe Phe Leu Leu Leu Gly Gly Leu Leu Trp Phe Leu
35 40 45
ccc gta gcg etc tgt gca gca gaa atg gcg acg gtt gaa ggt tgg aaa 192 Pro Val Ala Leu Cys Ala Ala Glu Met Ala Thr Val Glu Gly Trp Lys
50 55 60
aat ggt gga att ttt agt tgg gtg age caa act tta ggg gag cgc ttt 240 Asn Gly Gly lie Phe Ser Trp Val Ser Gin Thr Uu Gly Glu Arg Phe 65 70 75 80
ggt ttt gca gec ata ttt ttt cag tgg ttt caa att aca gtt ggc ttt 288 Gly Phe Ala Ala lie Phe Phe Gin Trp Phe Gin lie Thr Val Gly Phe 85 . 90 95
gtc act Val Thr
ttt cag Phe Gin
ate att lie lie 130 act get Thr Ala 145
teg att Ser lie
cct ata Pro lie
C3d gta Gin Val
ggg gts Gly Val 210
3g已
Arg Asn 225
tta gat Leu Asp
Asp Leu
tta cat Leu His
a_tg 3tt Met lie 290
atg ate tat Met lie Tyr
100 gca ctt ast Ala Leu Asn 115
ttt tgg gga Phe Trp Gly
asa ttg gt3 Lys Leu Val
ttc Phe
Thr
ttg Leu
att tta ggg gec lie Leu Gly Ala 105
ga_t cca ttg att Asp Pro Leu lie
120 aca ttt tct
Lys Ala
150 gga tta
Thr Phe 135
get ggt
ate ttg ttt lie Leu Phe Gly Leu 165
gag ata cca att肌t Glu lie Pro lie Asn 180
tea act tta gta gtt Ser Thr Leu Val Val 195
gaa get tea get Glu Ala Ser Ala
Gly
get Ala
Lys
Ser
ttt Phe
gcg Ala
C3g
Gin
gt￡l
Val
etc Leu
Lys
tta Leu
tct tat gtg tta Ser Tyr Val Leu 110
ttt att ggt tta Phe lie Gly Leu 125
ggt ggg 3C3
tat ccc tta Tyr Pro Leu
gec ata gg Ala lie Gly Gly 245
tea tta agt gca Ser Leu Ser Ala 260
ttt aat cat cat Phe Asn His His 275
gec ttt ggg gtt Ala Phe Gly Val
gca Ala Met
230 gga ttt
teg
Ser His
215 atg att
ttt Phe Val
200 cac att
cat His Ala
185 gtt tct
gC3
Ala Tyr 170
get ttt
gtt Val Gly
155 tat ttt
Gly Gly 140
ggg 3t3
lie
lie
tta Leu
Ser
Asn
tta Leu
Phe
ttt Phe
g肌 Glu
Phe
gta Val
att lie
lie
ate lie
cca Pro
Thr
gtg Val
Gly
Gin
att lie
aat
eta Leu
aga Arg
Pro
160
ggt Gly
Phe
ggg Gly
ttg Leu
atg Met
tct gta gca Ser Val Ala Ala 250
gta att caa act Val lie Gin Thr 265
gga tgg tta gtt Gly Trp Leu Val 280
gga gaa gtg agt Gly Glu Val Ser
gta Val lie
235 gcg gU
ctt Leu Glu
220 ata tta
ctt Leu Ala
205 gaa aat
gat Asp Phe
190 get tat
38t
Asn 175
ttt tea
Leu
Asn
get Ala
Tyr
CC3
Pro
att lie
Ser
Met
aag Lys
tct Ser
240
Val
ttt Phe
aaa Lys
tea Ser
att cct caa aaa lie Pro Gin Lys 255
caa acg tta ate Gin Thr Leu lie 270
gta att gca eta Val lie Ala Leu 285
tgg gtt gtt ggt Trp Val Val Gly
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864
912
295
300
cct tct Pro Ser 305
ttt tta Phe Leu
a 11 c aa lie Gin
Gly Gly
gtg att Val lie 370 tta ate Leu lie 385 肌3
Lys Arg
att ttt lie Phe
aat gag Asn Glu
act get Thr Ala 450 cat gat His Asp 465
ccc gcg Pro Ala
gaa gaei Glu Glu
卿ggg atg ttt gca Arg Gly Met Phe Ala 310
cgt aaa aca aat acg Arg Lys Thr Asn Thr 325
gga ate att gtt aca Gly lie lie Val Thr 340
gga aat aat tta tct Asn Leu Ser
gca Ala
cat His
ctt Leu
gca caa_兆3 ggc Ah Gin Arg Gly 315
gaa gtc cct gtt Glu Val Pro Val
330 tgg ggc get
Gly Asn 355
tat ttg Tyr Leu
tat aaa Tyr Lys
gtt gg'a Val Gly
gta Val
Lys
ggt Gly
c肌 Gin Asn 390
aca ate
tat Tyr Leu
375 aat 11a
Uc Phe Leu
360 etc tta
Trp Gly
345 tt3 gtt
Lys Thr lie 405
get eta ttt att tec Ala Leu Phe lie Ser 420
act cat act tac ca_a Thr His Thr Tyr Gin 435
ate ttg lie Leu
Leu
lie
ttt Phe
3tg Met
Leu
卿 Lys
gcg Ala
Val
ttc Phe
cgc Arg
gga Gly
Ala
gec Ala
ttt Phe
Val lie
tta Leu
cct Pro
tta Leu
act Thr Tyr 395
lie Gly
380 tat aat
tea
Ser Leu
365 ggt tac
tta cca aaa Leu Pro Lys
tta gtt atg Leu Val Met 335
act ttt Thr Phe
350 ctg aca Thr
320
gg3
Gly
gt￡l
Val
att lie
gtt Val Pro
425 ata ctt lie Leu
410
CCt CC3
Pro
gga Gly
gca Ala
Asn
ttt Phe
tea Ser
Tyr
gtt Val
tta Leu
ttt Phe
Pro
gtt Val
ggt Gly
400
tta Leu
ctt Leu
3t3
lie
CC8
Pro
ttt Phe
act att Thr lie
att tat lie Tyr
est ate His lie 500
3tt
lie Val 455
gaa gaa cca agg Glu Glu Pro Arg 470
cca gca get cgt Pro Ala Ala Arg 485
t"ta aaa cat taa Leu Lys His
440 gtt tat
Tyr
cax His
ggt Gly
gaa Glu
Phe
Glu
cat His
agt
Ser Phe
445 gat aaa Asp Lys 460
gC3 3g3 g3t
Ala Arg Asp 475
cat cat att att His His lie lie
att lie Ala
430 ttt gtt
tea Ser 415 gcg aaa
Ug Leu
Lys
Val
Arg
gtg Val
Lys
490
Lys
gtg Val
卿 Gly
Asn
aaa Lys 495
■
aaaattggag gatgtacct atg tta tac
Met Leu Tyr 505
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
1488
1540
14
gga犯a Gly Lys
tea ga_a_ Ser Glu
tea att Ser lie 540
Asp Glu 555
atg gaa Met Glu
gca att Ala lie
tgc gtc Cys Val
ttt atg Phe Met 620 gga 3tg Gly Met 635
tta gat Leu Asp
caa gtt Gin Val
g￡i3 gtg Glu Val
atg gat Met Asp 700
ga_a a^eit cgc Glu Asn Arg
510 3gt g犯ca_a Ser Glu 525
gaa cct Glu Pro
Gin
cga
gat Asp
gtg Val
gtg Val
gaa gca gag ttc Glu Ala Glu Phe 515
gat ttg cct aaa Asp Leu Pro Lys
530 gcc tat cag
gg'g
Gly Asn
CCt g￡L￡L
Pro Glu
get Ala
gca
Ala Val 575
gst a犯tcg gaa_ Asp Lys Ser Glu 590
aac atg ate get Asn Met lie Ala 605
ggg act tea acg Gly Thr Ser Thr
cgt Arg Leu
560 g'tc肌et
Ala Tyr
545 11a aat
Lys
tat Tyr
gac Asp
Asn
Ct￡L
Leu
cca Pro
Gin
Leu
atg Met
Leu
gcc Ala
ttg Leu
tat Tyr
gtt Val
gaa cca att ttt Glu Pro lie Phe 520
aaa tta get caa Lys Leu Ala Gin
535 caa gat gaa
gcc atg Ala Met
a11 aat lie Asn
aag Lys
gcg Ala
ttt Phe Ser
640 3肌
Lys Lys
lie Gly
625 tct tgg
ctt Leu Trp
610 ggt tct
Arg Thr
595 tgg
Ser Gin
580 aca act
Thr Phe
565 caa acc
Gin Asp 550
ttc tgt
Trp
Ser
cgc Arg
Asn
tea Ser
Lys
Thr
gcg Ala
Glu
Thr
g犯 Glu
Ser
Cys
ttg Leu
lie
Glu
c犯 Gin
gaa Glu
atg Met
act Thr
ggt Gly
c犯 Gin
tt￡L
Leu
tat Tyr
570
Lys
655
g犯
Glu Lys
tgc tgg Cys Trp 670
cca atg gat aaa Pro Met Asp Lys 685
tat gtt gat gag Tyr Val Asp Glu
ttc Phe
g肌 Glu
tac Tyr
CC3 ￡La_c tts Pro Asn Leu Val 660
tgt att tat tgg Cys lie Tyr Trp 675
cat atg tea ate His Met Ser lie 690
3Cg 3tt ggt gtd Thr lie Gly Val
Arg Ala
645 gtt att
get Ala Cys
630 gca gaa
g犯 Glu Lys
615 tgt atg
Glu Asn 600
aat Asn 585 aac cgt
Glu
Met Lys
Glu
ctt Leu
ttg Leu
Arg
Lys
ggt Gly
ggs Gly
650
lie
Asp
肌t Asn
gtt Val
tea tct ggt tat Ser Ser Gly Tyr 665
att gaa atg cga lie Glu Met Arg 680
ttg g￡lC 38g gtg
Leu Asp Lys Val 695
ggt 3tt 3tg ggg Gly lie Met Gly
1588
1636
1684
1732
1780
1828
1876
1924
1972
2020
2068
2116
2164
705
710
att act lie Thr 715
a_tt gaa lie Glu
gat get Asp Ala
gsg tgg Glu Trp
cat aaa His Lys 780
Asp Lys 795
ggs gga Gly Gly
c aa 11a Glu Leu
tat aaa Tyr Lys
g， Lys Glu
860 c犯ttg Gin Leu 875
tgg组 Trp Asn
gtg cct Vsl Pro
tat act ggt cgt tat Tyr Thr G]y Arg Tyr 720
gaa tat aat saa cag Glu Tyr Asn Lys Gin 735
get tea gga gga ctt Ala Ser Gly Gly Leu 750
gat ttc cgt ttg aaa Arg Leu Lys
Asp Phe 765
tat ggt Tyr Gly
aaa tat Lys Tyr
gaa eta Glu Leu
gat gat ate aaa get Asp Asp lie Lys Ala 725
3C3 g3C t已t 犯3 gtt Thr Asp Tyr Lys Val 740
tat get ccc ttt gtt Tyr Ala Pro Phe Val 755
aat gtc att tea ate lie Ser lie
ttg gat aat tta Leu Asp Asn Leu
tat att cac gta Tyr lie His Val 745
gag cca gaa ctt Glu Pro Glu Leu
760 aat acc tea
730
Leu Leu
gtt Val
cca_ Pro
tat Tyr Pro 785
Asn Val 770
cct ggt
gaa Glu
訓 cca acg atg Pro Thr Met 815
att ggt caa tat tat lie Gly Gin Tyr Tyr 830
get att cat gag aga Ala lie His Glu Arg 845
stt ga^ ￡ta_a lie Glu Lys
gaa Glu
gec Ala
Asn
Gly Leu lie
Val lie
ggt Gly
ttt Phe
tgg Trp Val 790 gta
Asn Thr
775 gtt ttg
Lys
act Thr
cca att gtc Pro lie Val
ctt tat gat Leu Tyr Asp 895
gga
Gly Met
865 tat aaa Tyr Lys
880 ttg gcg gac Leu Ala Asp
Thr His
850 atg ttt
ttt Phe Val
835 cat aaa
aat Asn Phe
820 gta cgt
805 ttt tct
Arg
Ser
tat 丁yr
Val
cat His
gg3 Gly
Leu
agt Ser
兆t Ser
Ser
tgg Trp
tat Tyr
ggc Gly
cgt Arg
ctt Leu
810
gec Ala
tgc Cys
get tat cca ctt ccc aaa Ala Tyr Pro Leu Pro Lys 910
Phe
Leu
cgt Arg
aat Asn
gts gec atg Lys Val Ala Met Phe 855
gaa att atg aac gat Glu lie Met Asn Asp 870
gaa gat tea aat Lys Glu Asp Ser Asn 885
tta tta atg aag gga_ Leu Leu Met Lys Gly ■
ttg gaa aat gaa ate Leu Glu Asn Glu lie
ttt Phe Asp
840 ttt tta
tct Ser 825 糾gga
Leu
ggg Gly
cga Arg
Gly
gca Ala
tea Ser
ggt Gly
890
tgg c犯 Trp Gin 905 att caa lie Gin
2212
2260
2308
2356
2404
2452
2500
2548
2596
2644
2692
2740
2788
915
920
cgtttagtgattCg3gC3gattuggg3tg肌t3tggC3ttttat
ArgLeuVallieArgAlaAspPhe Gly MetAsnMetAlaPheAsnTyr
925930935
gttatgc肌attgaggetttaaa tgetcatatt
ValGinAsp MetGinGluAlalieGluAlaLeuAsnLysAlaHislie
940945950
etatatcatcctg犯肌tacatattttacttaa
LeuTyrHisGluGluProGluAsnLysThrTyrGlyPheThrHis
955960965
〈210〉2
<211〉 ！503
〈212〉 1PRT
<213〉乳酸孚L球菌(Lactococcus lactis)
〈400〉
MetAsnGinLysLyslieSerLeuPheGlyPhePheAlaLeuThrAla
151015
SerMetValLeuThrValTyrGluTyrProThrPheAlaThrSerLys
202530
LeuHisLeuValPhePheLeuLeuLeuGlyGlyLeuLeuTrpPheLeu
354045
ProValAlaLeuCysAlaAlaGluMetAlaThrValGluGlyTrpLys
505560
AsnGlyGlyliePheSerTrpValSerGinThrLeuGlyGluArgPhe
65707580
GlyPheAlaAlaliePhePheGinTrpPheGinlieThrValGlyPhe
859095
ValThrMetlieTyrPhelieLeuGlyAlaLeuSerTyrValLeuAsn
100105110
PheGinAlaLeuAsnThrAspProLeulieLysPhelieGlyLeuLeu
115120125
lieliePheTrpGlyLeuThrPheSerGinLeuGlyGlyThrGinArg
130135140
ThrAlaLysLeuValLysAlaGlyPheValValGlylieValliePro
145150155160
SerlielieLeuPheGlyLeuAlaAlaAlaTyrPhelieGlyGlyAsn
165170175
ProlieGlulieProlieAsnLysHisAlaPheValProAspPheSer
180185190
GinValSerThrLeuValValPheValSerPhelieLeuAla TyrMet
2836
2884
2932 195
200
205
Gly Val 210 Arg Asn 225
Leu Asp
Asp Leu
Leu His
Met lie 290 Pro Ser 305
Phe Leu
lie Gin
Gly Gly
Val lie 370 Leu lie 385
Lys Arg lie Phe Asn Glu
Glu Ala Ser Ala Ser His 215
Tyr Pro Leu Ala Met lie 230
Ala lie Gly Gly Phe Ser 245
Ser Leu Ser Ala Gly Val
260 265 Phe Asn His His Leu Gly Trp Leu 275 280 Ala Phe Gly Val Met Gly Glu Val
lie Asn Glu Leu Glu Asn Pro Lys 220
Leu Leu Val lie Leu Ala lie Ser
235
Val Ala Ala Val
250 lie Gin Thr
240
Phe
295
lie Pro Gin Lys 255
Gin Thr Leu lie 270
Val Lys Val lie Ala Leu 285
Ser Ser Trp Val Val Gly 300
Arg Gly Met Phe Ala 310
Arg Lys Thr Asn Thr 325
Gly lie lie Val Thr 340
Gly Asn Asn Leu Ser
355
Tyr Leu Val Gly Tyr 375
Tyr Lys Lys Gin Asn Leu 390
Val Gly Lys Thr lie 405
Ala Leu Phe lie Ser 420
Thr His Thr Tyr Gin
435
lie Leu Pro Phe lie
Ala Ala Gin Arg Gly Leu Leu Pro Lys
315
His Glu Val Pro Val 330
Leu Trp Gly Ala Val 345
Phe Leu Val Ala lie 360
Leu Leu Phe Phe lie
320
Pro
Leu Val Met 335 Thr Phe Gly
350 Leu Thr Val 365
Gly Tyr Phe Val
Leu
Ser
lie
Phe
Met
380
Lys Arg Thr Tyr Asn Val Pro Gly
395 400 Ala Gly lie Gly Phe Leu Leu Ser
415
Ala Ser lie Ala Lys 430
lie Ser Phe Val Val 445
His Asp Lys Arg Gly 柳
Ala Arg Asp Val
410 Val Pro Pro
425 lie Leu Leu 440
Val Tyr Glu Leu
Thr Ala
450 455 His Asp Thr lie Glu Glu Pro Arg His Phe Lys 465 470 475
Pro Ala lie Tyr Pro Ala Ala Arg Gly Glu His His lie lie Lys
485 490 Glu Glu His lie Leu Lys His 500
Asn
Lys 495
480
<210〉 3
<211> 466
<212〉 PRT
<213〉 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
<400> 3
Met Leu 1
lie Phe
Ala Gin
Glu Met 50
Gin Thr 65
Glu Lys
Glu Asn
Lys Glu
Met Leu 130 Lys Leu 145
Ser Gly
Glu Met
Asp Lys
lie Met 210 Asp Asn 225
lie His Pro Glu
Tyr Gly
Gly Ser 20
Gin Ser 35
Leu Asp
Lys
5 Glu
Glu
Asn
Ser Glu
lie Glu Pro
Glu Gly Tyr Met Glu
Asn Ala
lie 85 Val
Pro 70
Asp
Asn 55 Glu
Gly Thr
Met
Arg Asp Glu Ala Glu Phe Leu Glu Pro
10 15 Gin Val Asp Leu Pro Lys Tyr Lys Leu
25 30 Arg Val Ala Tyr Gin Leu Val Gin Asp
40 45 Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Cys 60
Ala Val Lys Leu Met Ser Gin Thr Leu
75 80 Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Thr Glu lie 90 95 Asn Met lie Ala Asp Leu Trp Asn Ala Ser Glu 105 110 Ser Thr lie Gly Ser Ser Glu Ala Cys
120 125 Lys Phe Ser Trp Arg Lys Arg Ala Glu 135 140 Asn Ala Lys Lys Pro Asn Leu Val lie Ser 150 155 160
Cys Trp Glu Lys Phe Cys lie Tyr Trp Asp Lie 165 170 175
Arg Glu Val Pro Met Asp Lys Glu His Met Ser lie Asn Leu
180 185 190
Val Met Asp Tyr Val Asp Glu Tyr Thr lie Gly Val Val Gly 195 200 205
Gly lie Thr Tyr Thr Gly Arg Tyr Asp Asp lie Lys Ala Leu
215 220 Leu lie Glu Glu Tyr Asn Lys Gin Thr Asp Tyr Lys Val Tyr
230 235 240
Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Leu Tyr Ala Pro Phe Val Glu 245 250 255
Leu Glu Trp Asp Phe Arg Leu Lys Asn Val lie Ser lie Asn 260 265 270
Arg Cys 100
Lys Phe Met 115
Gly Gly Met Gly Leu Asp Tyr Gin Val
Ala
lie
Thr Ser
Leu
Ser 305 Ser
Trp 290 Tyr
Ala
Val
Phe Asp
Phe Leu
Lys
Glu
Asp
Asn 385 Gly
Gly 370
Arg
Thr 465
His 450 His
Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val Gly Trp Val 275 280 285
Arg Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Glu Leu lie Phe Lys Val
295 300 Leu Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala lie Asn Phe Ser His
310 315 320
Ser Gin Leu lie Gl'y Gin Tyr Tyr Asn Phe
325 330 Gly Tyr Lys Ala lie His Glu Arg Thr His
340 345 Ala Lys Glu lie Glu Lys Thr Gly Met Phe 355 360 Ser Gin Leu Pro lie Val Cys Tyr Lys Leu
375 380 Gly Trp Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Met Lys
395 400 Pro Leu Pro Lys Asn Leu Glu Asn Glu 410 415 Arg Ala Asp Phe Gly Met Asn Met Ala
425 430 Gin Glu Ala lie Glu Ala Leu Asn Lys
440 445 Glu Pro Glu Asn Lys Thr Tyr Gly Phe
Arg Tyr Gly 335
Val Ala Met
350 lie Met Asn 365
Lys Glu Asp Ser
390
Trp Gin Val Pro Ala Tyr 405
lie lie Gin Arg Leu Val lie
420
Phe Asn Tyr Val Gin Asp Met 435
Ala His lie Leu Tyr His Glu
455
460
权利要求
1、一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法，其特征是按照以下步骤(1)、PCR引物设计和扩增根据GeneBank公布的Lactococcus lactis il1403基因组序列，利用Primer premier5.0软件设计如下一对引物5′端引物5′CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3′，3′端引物5′ATGCTGCAG TGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3′，在所述引物5′端的下划线部分分别引入Sac I和Pst I酶切位点；(2)、谷氨酸脱羧酶基因(gadCB)的克隆通过PCR技术，以Lactococcus lactis il1403总DNA为模板，以步骤(1)所示的引物和LA TaqDNA聚合酶扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因即谷氨酸脱羧酶基因(gadCB)；(3)、重组表达质粒pMG36egad的构建1)在克隆的gadCB基因的两端分别引入引入Sac I和Pst I酶切位点，经纯化后用限制性内切酶Sac I和Pst I酶切；2)将从大肠杆菌TG1抽取的表达载体pMG36e用限制性内切酶Sac I和Pst I酶切；3)将步骤1)和2)的酶切产物用T4DNA连接酶连接；4)用步骤3)的限制性内切酶酶连产物转化大肠杆菌TG1；5)少量快速提取筛选阳性重组子；6)对阳性重组子进行验证；(4)、用重组表达质粒pMG36egad电转化Lactococcus lactis ATCC 11454，得到基因工程菌MELgad候选菌株，和(5)、对步骤(4)的候选菌株做发酵性能测定，筛选得到基因工程菌MELgad。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在十，所述的谷氨酸脱羧酶基因(gadCB)的核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO: 1所示。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR条件是在25 y L反应体系中, 引物浓度为lpmol/u L; dNTP各25pmol/u L, Mg2+25pmol/u L ,PCR扩增条件:95。C预变性5min; 95'C20s,55'C45s,72。C3min，进行25个循环；72。C7min。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的PCR产物酶切反应体系为FCR产物20 ul H20 29 ulSac I 2. 5 ul Pst I 2.5 ulM Buffer6 ul37。C反应4小时；反应结束后丁 65'C保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的表达载体pMG36e的60ul酶切反应体系 为pMG36e 20ul H20 29 ulSac I 2. 5 ulPst I 2. 5 ulM Buffer 6 ul37'C反应4小时；将酶切后的DNA溶液于65。C保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的表达载体pMG36e和PCR产物的酶连 反应体系为PCR产物 5ul pMG36e lul Buffer lul T4Ligase 0.5ul FLO 2.5ul4'C过夜反应；反应结束后65'C保温10分钟，以灭活T4DNA连接酶。
7、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于，歩骤(3)所述的酶连产物转化大肠杆齒TG1的方法是(1) 制备大肠杆菌TG1的感受态细胞用牙签接一大肠杆菌TGl单菌落于5mJ LB屮过夜振荡培养；然后 按体积比为"/。大肠杆菌菌液转接于5mlLB中，培养至OD600为0.5 0.8左右停止培养；吸取该菌液1.5ml于 E卯endorf管中，将菌液冰浴5min， 4'C4000r/min离心4min，倾去上清，用手指轻弹管底使菌体分散在残 余的液体中；加入500ul冰冷的0.1MCaC12，用移液枪轻轻打散菌体，继续冰浴30min， 3000r/min离心4min, 倾去上清；加入100ul冰冷的0.1MCaC12，得到用亍转化的悬浮菌体，或将该悬浮菌体于-7(TC保存备用；(2) 酶连产物转化每管加入5—10ul酶连产物和大肠杆菌感受态细胞冰浴30min， 42'C热激90sec， 冰镇1分钟，再加入600ulLB置于37r振荡培养45min是使其转化，然后涂含有lmg/L红霉素的选择平板。
8、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的少量快速提取筛选阳性重组子的方法 是从平板上挑取大量转化子，将转化子划线扩大培养12h，用接种环挑取一环菌体悬浮于添加葡萄糖50 mmol/L， Tris-HCl 25 mmol/L和EDTA 10mmol/L 50 u l的快检液中，力口入25 u 1 0.3M NaOH 2%碱性十二 垸基磺酸钠溶液，立即振荡混合完全，然后打开管盖，在70。C放置15min后，于水浴中冷却至室温，加入 10ul体积比为25:24: 1的酸性苯酚/氯仿/异戊醇溶液，然后将液彻底混匀，混匀后在12000r/min离心 5min，取上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测。
9、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的阳性重组子的验证的方法是抽取阳性重 组f质粒，再用限制内切酶Sac I和Pst I进行酶切，60ul的酶切反应体系为重组质粒 20 ul H20 29 ulSac I 2. 5 ulPst I 2. 5 ulM Buffer 6 ul37'C反应4小时；酶切结束后用琼脂糖电泳检测并将重组质粒测序。
10、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的重组表达质粒pMG36egad电转化丄"ctococc^ fac& ATCC 11454的方法是(1 ) iactococcitf /acft'5 ATCC 11454电转化感受态制备将丄actococciw /"cto ATCC 11454单菌落 接种于添加有5mL M 17培养基中，3(TC静置培养过夜;按培养基体积1%接种量转接过夜培养物到 含1。/。甘氨酸的GSM 17培养基中，30'c静置培养至OD6qq=0.2-0.5，然后在4°c , 5,000rpm离心I Omin，收集菌体;用等体积冰冷的菌体电转缓冲溶液重悬、洗涤细胞。4 。C ， 5,000rpm离心15min, 弃上清，重复上述操作一次;弃上清，吸干液体，将菌体按V/V悬浮于1/100体积的冰冷菌体电转 缓冲溶液)，置于冰浴备用；(2)电击转化在45uL iactococcM/acto ATCC 11454电转化感受态细胞中加l-2uL重组表达质 粒pMG36egad溶液,混匀后加入预冷的2mm电击杯中;冰浴10 min后用25u F,10KV/cm电击，电击 后立即加1 mL冰冷的SM17培养基至30'C培养4小时，取电击过的菌液O.lmL涂于含lug/ml红 霉素选择平板上，3(TC培养48小时，其中所述的培养基按照下列步骤配制M17培养基按g/L计胰蛋白胨50.0 g/L，大豆胨50.0 g/L，牛肉膏50.0 g/L,酵母膏25.0 g/L，抗坏血酸5.0 g/L， MgS04.7H20 2.5 g/L,磷酸甘油二钠l卯.O g/L，琼脂15.0%,调pH至6.9; GSM 17培养基M 17培养基+1%甘氨酸+17.1%蔗糖； 缓冲溶液配制按V/V计，蔗糖0.5mol/L+甘油10%)。
全文摘要
本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法，以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)il1403总DNA为模板，扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB。将gadCB基因克隆到表达载体pMG36e中，构建得到重组表达质粒pMG36egad，然后再用重组表达质粒pMG36egad电转化乳链菌肽产生菌Lactococcus lactis ATCC 11454，获得本发明的乳链菌肽基因工程菌，将该基因工程菌命名为MELgad。应用SDS-PAGE分析和酶活测定，显示本发明克隆的gadCB基因在基因工程菌中得到组成型和活性表达。测定结果表明本发明克隆的基因工程菌的生物量和乳链菌肽产量比宿主菌分别提高了39％和24％。本发明为乳链菌肽高产基因工程菌的构建开辟了一条新的途径。
文档编号C12N15/60GK101096668SQ200710052388
公开日2008年1月2日 申请日期2007年6月6日 优先权日2007年6月6日
发明者滔 李, 郭志伟, 陈守文 申请人:华中农业大学