专利名称：利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK15提高植物耐盐能力的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所 述的基因与植物耐盐有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米的组成型启动子(Ubiquitinl) 结合后直接转入一般植物体，转基因植株的耐盐能力显著提高。
背景技术：
植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、盐害和低温往往导致农作物的大规模减产，在 许多地区是农业发展的瓶颈。为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种 途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受千旱、高盐、低温等胁迫伤害的功 能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong 等Cell signaling during cold, drought and salt stress. Plant Cell. 14 (suppl), S165—S183 ， 2002)。而那些功能基因 的表达对植株对环境刺激做出反应，最终使其存活起着重要的作用。而目前在许多植物屮发现CDPK、 CIPK、 MAPK等蛋白激酶家族在植株逆境信号的传递、逆境的适应性方面起着重要的作用。这些蛋白激酶基闪在不 同的逆境胁迫下，可诱导表达或被抑制，因而认为这些蛋白激酶基因在植物对逆境的应答过程中起着非常重 要的作用。因此分离和鉴定这类能提高植物应对逆境的功能基因对于于作物抗逆境的遗传改良，对育种有着 重要的意义。目前人们己在植物抗性改良方面作了尝试，利用DREB1A和DREB2A培育的转基冈拟南芥植株， 其低温耐性和干旱，高盐耐性都比野生型强(Liu Q等Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought 隱 and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell. 1998, 10: 1391-1406.)。禾U用 OsNACl培育转基因水稻显著的提高了植株对干旱和高盐的耐受能力(Hu等Owrexpressing aNAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice. PNAS. 2006, 103: 12987-12992.;)
水稻是最重要的粮食作物之一，耐盐的水稻对我们来说具有重要的意义，因而找出与耐盐的功能基因， 培育耐盐的品种对提高水稻产量和种植面积具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含有耐盐相关基因完整编码区段的DNA片段，利用这个基因改 良水稻或其它植物的抗逆性，特别是通过转基因，提高转基因植物的耐盐性。对这个基因进行结构分析其属 于植物CIPK蛋白激酶家族，而且是跟逆境相关的，将该克隆的基因被命名为OsCffK"。
本发明涉及分离和应用一种包含QsC7i^"基因的DNA片段，该片段赋了，植物在高盐等逆境条件下，增 强耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQIDNO: l所示，或者基本h相当于SEQIDNO: 1所示的髙度同 源DNA序列，或者其功能相当于SEQIDNO: 1所不序列的亚片段。
可以采用已经克隆的0sC//lO5基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基 因。同样，也可以采用PCR (polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明
的OsC/尸A75基因以及任何感兴趣的--段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含 0sC7PK"基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得 对高盐胁迫耐受力得到增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸 前加上任何 -种强启动子或诱f型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这 些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的翻译。
携带有本发明0$(1'//^"基因的表达载体可通过使州11质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射， 电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998, Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp.411-463; Geiserson and Corey, 1998， Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
可使用包括本发明的OsC/i^:/5基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗盐的植物品种。
本发明基因是受逆境诱导表达的，因此其启动子是诱导型启动子，将本发明的启动子区段与任何感兴趣 的基因同时连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物对逆境的耐受 能力。
下面结合具体实施例对本发明做进…步说明。
序列表SEQ ID NO:l显示的是本发明分离克隆的包含有OsC7PK/5基因编码区DNA片段序列。 图l: OsC77^W基因分离和鉴定流程图。
图2:用Northern杂交检测OsC7/^75基因在十旱，高盐，低温，PEG和ABA等逆境胁迫不同时l'nj点的 表达水平。
图3:用于水稻遗传转化的载体。将目标基因OsC7/^75序列通过B,H1和& 双酶切连接到图屮红色 字体标注的酶切位点即得到<%c/p/:"超量表达载体。
图4:在水稻中超量表达0sC/ilO5基因能提高植株耐盐胁迫能力。A， QrC7/^75基因在转基因植株 中的表达情况，第-道为对照，其余为转基因独立转基因植株。B，转基因家系和野牛型对照在含IOOmMNaCi 的生根培养基上生长12天后的表型观察。C，转基因家系和野生型对照在含lOOmM NaCl的生根培养基上生 长12天后地上和地下部分长度的统计。D，转基因家系和野生型对照在含lOOmM NaCl的生根培养基上生长 12天以及正常生长条件下鲜重比较。
具体实施例方式
本发明的前期工作获得了来源于水稻品种明恢63 (—种中国普遍推广应用的-个水稻品种)的cDNA克 隆E1101U2。该cDNA是OyC/Pi:A5基因的全长cDNA，是-个抗逆境相关基因。主要依据有以下几个方面 (1)采用cDNA芯片技术(Gray A.Churchill， Fundamentals of exprerimental design for cDNA microarrays. Nature genetics supplement, 2002, 32, 490-495)分析发现cDNA克隆V2Chip#l6A22在水稻品种"屮旱5号"(由中国上 海农科院提供的-^个公开使用的一个水稻品种)干旱胁迫处理15天表达量增加2.95倍。对其进行测序，分析 发现该基因就是OsC/尸ja5 (Genebank登录号为AK121773)。鉴于该克隆表达量在千旱处理后的明显差异和 其功能特征，认为V2ChipW6A22克隆所代表的基因在逆境下参与调控基囚的表达。(2)对其进行逆境条件下 的表达谱分析(图2)，发现在胁迫处理的过程中，表达量有明显的提高。(3)，将其全长基因在植株中超量泉 达，转基因植株的耐盐性能力大大增强(图4)。这些结果都表明QsC7尸^^基因是…个逆境相关调控基因，参
与植物对逆境的调控。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsC//^/5基因完 整编码区段的dna片段以及验证OjC//^75基因功能的方法(发明流程如图l所示)。根据以下的描述和这 些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对 本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。 实施例l :分离克隆包含有C^Cff/:"—基因区段的DNA片段
通过水稻品种"中旱5号"(由中国上海农科院提供的'个公开使用的'个水稻品种)的千旱诱导基因表达 谱分析，发现了 -个受干旱强烈诱导(T旱胁迫后期表达量提高2.95倍以上)的EST (表达序列签)，经序列 分析发现，该基因为CIPK蛋白激酶家族的一个成员，其对应日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp) 中的 cDNA 克隆 J033092J11 。 根据该克隆序列，设计引物 OsCIPK15F (5'-TAAGGTACCGGCTAAAGAATTGCAGTCCA-3'，序列特异引物外加接头位点)禾B OsCIPK15R f5'匿TAAGGATCCTTGCGACTGCTGCTATTC曙3',序列特异引物外外加接头5awHI)，将该克隆的374-1773bp 序列从"中旱5号"品种中反转录扩增出来。扩增产物就是本发明的序列l-1400bp。具体步骤为采用TRIZOL 试剂(购自Invitrogen公司)从T旱胁迫处理的水稻品种"中旱5号"中提取叶片总rna (提取方法根据上述 TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第』链。根据cDNA克 隆001-015-H02的序列设计的巢式引物将其从反转录产物中扩增出来，反应条件为94'C预变性2min; 94'C 30sec， 55。C30sec， 72'C 2min， 30个循环；72'C延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购 自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆命名为PGEM-OsCIPK15。
实施例2:检测水稻内源基因OsC7^5的诱导表达
以水稻品种"中旱5号"为材料，在3叶期分别进行f旱、冷害和高盐胁迫以及脱落酸(ABA),聚乙二醇 (PEG)处理。干旱处理是将幼苗断水，并在0h,3h,6h， 12h,24h后取样。冷害处理是将幼苗置于4'C生长 箱,O h， 3 h， 6 h, 12 h， 24h后取样。高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200 mM/L NaCl溶液中并在0 h， 5h, 14h, 241: 后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100 nM/L ABA溶液中并在0 h, 3h, 6h, 12h和24h后取样。PEG处理 是将幼苗根部浸泡在20%的PEG6000溶液中并在0 h， 3h， 5h, 12h后取样。提取叶片的总RNA (Trizol试剂， Irwitrogen)后按《分子克隆》O.萨姆布鲁克，科学出版社，北京，1999年版)有关实验操作方法进行RNA 转膜，并以C^C7尸幻5为探针做Northern杂交。结果表明，本发明克隆的基因QsCffiK75能被下旱、冷害、高 盐和ABA、 PEG诱导表达(如图2所示)，是-一个与逆境相关的蛋白激酶。
实施例3， OsC7WS75基因超量表达载体的构建，转化
根据实施例2的结果，知道本发明基因O^C/WT/5是能被干旱、冷害、高盐，聚乙二醇(PEG)和脱落酸 (aba)诱导表达的，为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中超暈表达，从转基囚棺株的表 型来验证。方法是首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsCIPK15质粒用S。wHI和XpHl双酶切，回收 外源片段；同时，用同样的方法酶切携带玉米强启动子Ubquitin的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上 常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301 (来自澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米强启动子 Ubiquitinl的农杆菌介导的遗传转化载体)，酶切完毕，用氯仿异戊醇(24:1)抽提，纯化酶切产物。用包含
QsC7/l^5基因的酶切片段和酶切的pU1301载体(如附图3所示)做连接反应，转化大肠杆菌DH10p (菌株 购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11 (中国农业科学院作物科学研究所提供 的 -个公开使用的寸水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生 根、炼苗、移栽，得到转基因植株。将获得的转基因水稻植株被命名为S15。本发明总共获得独立转基因水稻 植株26株。
农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系采用申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室建立的转化 体系。该体系的具体步骤如下
(1) 试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的縮写表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine， 6-节基腺嘌呤)； CN (Carbenicillin，羧节青霉素);KT (Kinet丄n，激动素);NAA (Napthalene acetic acid，萘 乙酸)；IAA (Indole-3-acetic acid，卩引哚乙酸)；2， 4-D (2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid， 2, 4-二氯苯氧乙酸);AS (Acetosringone,乙酰丁香酮);CH (Casein Enzymatic Hydrolysate， 水解酪蛋0) ; HN (Iygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚砜)；N6max (N6大韋成分溶液)；N6raix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分 溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培养基大量元素母液[IO倍浓縮液(10X)]的配制 硝酸钾(KN0:O 28.3 g 磷酸二氢钾(KH2P04) 4.0 g
硫酸铵((NH4)2S04) 4.63 g
硫酸镁(MgS047H20) 1.85 g
氯化钙(CaCL2H20) 1. 66 g
逐溶解，然后室温下定容至IOOO ml。
2) N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制 碘化钾(KI) 0. 08 g
硼酸(H3B03) 0. 16 g
硫酸锰(MnSO^ . 4H20) 0.44 g
硫酸锌(ZnSO., 7H20) 0. 15 g
室温下溶解并定容至IOOO ml。
3) 铁盐(Fc2EDTA)贮存液(100X)的配制
准备800 ml双蒸水并加热至70'C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA 2H20) 3.73克，充分溶 解后在70'C水浴中保持2小时，定容至1000 ral, 4'C保存备用。
4) 维生素贮存液(100X)配制
'烟酸(Nicotinic acid) 0.1 g
维生素Bl (Thiamine HC1) 0.1 g
维生素B6 (Pyridoxine HC1) 0.1 g
甘氨酸(Glycine) 0. 2 g
肌醇(Inositol) 10 g
加水定容至1000 ml, 4'C保存备用。
5) MS培养基大量元素母液(IOX)的配制 硝酸铵(NH4N03) 16, 5 g 硝酸钾 19. 0 g 磷酸一.氢钾 1.7 g 硫酸镁3. 7 g 氯化钙4. 4 g 室温下溶解并定容至IOOO ml。
6) MS培养基微量元素母液(IOOX)的配制 碘化钾 0. 083 g 硼酸 0.62 g 硫酸锰 0. 86 g 钼酸钠(Na2Mo04 2H20)0. 025 g 硫酸铜(CuS04 5H20 ) 0, 0025 g 室温下溶解并定容至IOOO ml。
7) 2,4-D贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取2,4-D 100 mg，用l ml 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO ral蒸馏水溶解完全后定容 全100 ml， f室温下保存。
8) 6-BA贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取6-BA 100 mg，用l ml 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO ml蒸馏水溶解完全后 定容至100 ml，室温保存。
9) 萘乙酸(NAA)贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取NAA100 mg，用l ral 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO ml蒸馏水溶解完全后定容至 100 ml， 4'C保存备用。
10) 吲哚乙酸(IAA )贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取IAA 100 mg，用l ml 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO ml蒸馏水溶解完全后定容至 100 ml, 4'C保存备在一个大三角瓶中加入300 ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO,, 7H20) 2. 78g。在另--个大二角瓶中加入300 ral蒸馏水用。
11) 葡萄糖贮存液(0.5 g/ml)的配制
秤取葡萄糖125 g，然后用蒸馏水溶解定容至250 ml,灭菌后4'C保存备用。
12) AS贮存液的配制
秤取AS 0.392 g ， DMSO 10 ml,分装至l. 5 ml离心管内，4'C保存备用。
13) IN氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6 g，并用蒸馏水溶解定容至100 ml,室温保存备用。 (3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基N6max 母液(10X) 100mlN6max 母液(100X) 10mlFe2－ EDTA 贮存液 (100X) 10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4－D 贮存液 2.5ml脯氨酸 (Proline) 0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhylagel 3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节PH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基
N6max 母液(10X) 100mlN6max 母液(100X) 10mlFe2－ EDTA 贮存液 (100X) 10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4－D 贮存液 2.5ml脯氨酸 (Proline) 0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhylagel 3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节PH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基N6max 母液(10X) 12.5mlN6max 母液(100X) 1.25mlFe2 EDTA 贮存液 (100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4－D 贮存液 0.75mlCH 0.15g蔗糖(Sucrose) 5g琼脂粉(Agarose) 1.75g4)共培养基N6max 母液(10X) 12.5ml
N6mix母液(100X)
Fe"EDTA贝'i存液(100X)
维生素贮存液(100X)
2, 4-D贮存液
CH
蔗糖
琼脂粉
1. 25ml
2. 5 ml 2. 5 ml
0.75 ml 0.2 g
5 g l.乃g
加蒸馏水至250 ml， IN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5 ml葡萄糖贮存液和250 14 AS贮存液，分装倒入培养皿中(25 ml 每皿)。
5)悬浮培养基 N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe"EDTA fC存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2, 4-D贮存液 CH
加蒸馏水至IOO ml，调节pH值到5.4， 使用前加入l ml葡萄糖贮存液和IOO
6) 选择培养基 N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2'EDTA jC存液(100X)
维生素贮存液(ioox)
2, 4-D贮存液
CH
蔗糖
琼脂粉
加蒸馏水至250 ml，调节pH值到6. 0， 使用前溶解培养基，加入250 W HN
7) 预分化培养基 N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2'EDTA C存液(100X) 维生素贮存液(ioox) 6-BA贮存液
5 ml 0. 5 ral 0. 5 ml 1 ml 0. 2 ml 0.08 g 2 g
分装到两个IOO ml的三角瓶中，封口灭菌。 W AS n存液。
25 ml 2. 5ml 2. 5 ml
2. 5 ml 0. 625 ml 0. 15 g 7. 5 g
1. " g 封口灭菌。
和400 ppm CN，分装倒入培养皿中(25 ml /皿)
25 ml
2. 5 ml 2. 5 ml
2. 5 ml 0. 5 ml
N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2tEDTA贮存液(100X) 维生素贮存液(100X) 6-BA贮存液 KT贮存液 NAA贮存液 IAA贮存液 C H
KT贮存液 0. 5 ml
NAA贮存液 50 W
IAA贮存液 50 W
CH 0. 15 g
蔗糖 7. 5 g
琼脂粉 1. 75 g
加蒸馏水至250 ml， 1 N氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250 W HN和200卯m CN，分装倒入培养皿中(25 ml /皿)。
8) 分化培养基
100 ml 10 ml 10 ml 10 ml 2 ml 2 ml 0. 2 ml 0. 2 ml
1 g 30 g
3 g
加蒸馏水至900 ml， 1 N氢氧化钾调节pH值到6. 0。
煮沸并定容至IOOO ml，分装到50 ml 二角瓶(50 ml /瓶)，封口灭菌。
9) 生根培养基
MSmax母液(10X) 50 ml
MSmix母液(100X) 5 ml
Fe2hEDTA E:存液(100X) 5 ml
维生素贮存液(100X) 5 ml
蔗糖 30 g
Phytagel 3 g
加蒸馏水至900 ml， 1 N氢氧化钾调节pH值到5. 8。 煮沸并定容至IOOO ral，分装到生根管中(25 ml /管)，封口灭菌。 (4)农杆菌介导的遗传转化步骤 4. 1愈伤诱导
(1) 将成熟的水稻种子(中花ll，中国农业科学院作物科学研究所)去壳，然后依次用70%的乙 醇处理1分钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；
(2) 用灭菌水洗种子4-5次；
(3) 将种子放在诱导培养基上；
Phytagel
(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25土rC。 4. 2愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25土rc。 4. 3预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25士rc。 4. 4农杆菌培养
(1) 在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105 (来源于CAMBIA，商用菌株)两天， 温度28。C;
(2) 将农杆菌转移至悬浮培养基里，28'C摇床上培养2-3小时。 4. 5农杆菌侵染
(1) 将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；
(2) 调节农杆菌的悬浮液至OD柳,0.8-1.0;
(3) 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
(4) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20'C。 4. 6愈伤洗涤和选择培养
(1) 灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
(2) 浸泡在含400 ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；
(3) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
(4) 转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400 ppm，第 二次以后为250 ppm)
4.7分化
(1 )将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；
(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，在培养室温度26'C下每天光照培养14小时(光照强度 1000-15001x)，暗培养10小时。 4.8生根
(1) 剪掉分化时产生的根；
(2) 然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，培养条件同4. 7的步骤(2)所述。 4.9移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。 实施例4: OsCJWi:75基因转基因T2家系苗期耐盐筛选
为了验证转基因水稻植株的耐盐性是否增强以及其增强是否与转入的0sC7WO5基因有关，本发明采用 Northern杂交技术对转基因水稻植株中OsC/WH5基因的表达进行检测(图4A为Northern杂交(方法同实施 例2)的结果，并对本发明T2代植株的部分家系进行了耐盐性筛选。具体步骤如下T2代家系的种子在含有 50mg/ml潮霉素的生根培养基发芽5天后，将发芽一致的幼苗移栽100mM的生根培养基上并种植野生型对照 植株。同时在正常生根培养基上也进行了移植，正常培养基上的生长情况说明转基因对植株的生长发育没有 明显的影响(图4D)。而在含100mM盐的生根培养基上，在生长12天以后，我们分别测量了野生型和转基 因家系的鲜重、根长、地上部分长，结果显示转基因家系无论在地上和地下部分的长度，还是植株的鲜重都
远远强于对照，它们之间的差异极显著(户O.Ol)(图4D、表O。该结果说明C^C7Wa5基因的确与植株耐 盐相关，其超量表达能提高转基因植物的耐盐性，转基因水稻植株的抗性增强确实与转入的0^7户K"基因有关。
表l本发明的转基因家系与对照在含NaCl的生根培养基上生长12天植株的鲜重、地上和 根长统计
家系鲜重(g)标准差、S标准差根长(cm)标准差
WT0. 060.014. 320. 754. 720. 84
T40. 110. 049. 213. 449.602. 51
T140. 150. 0413.023. 0411. 171. 37
T190. 130. 0411. 054.8110. 674. 50
T220. 120. 0410. 022. 5510. 500. 79
说明表中WT为野生型对照，Tx:为转基因家系。
序列表
aio> 华中农业大学
<120〉利用水稻蛋白激酶基因flsa7y75提高植物耐盐能力
<130>
<141> 2007-05-31
<160〉 1
<170〉 Patentln version 3.1
<210> 1
<211〉 2044
<212〉 DNA
<213〉 水稻(0ryza sativa)
<220>
<221〉 gene
<222> (1)..(2044)
<223>
〈400〉 1
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cttc 204权利要求
1、OsCIPK15基因介导的赋予植物对盐胁迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-2044位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及耐盐有关的水稻DNA片段OsCIPK15的分离克隆、功能验证及应用。具体步骤是，将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米的组成型启动子(Ubquitin)结合后直接转入水稻，使转基因水稻植株的耐盐能力显著提高。克隆的OsCIPK15基因具有如序列表SEQ ID NO1中第1-2044位所示的DNA序列，或者编码与SEQ ID NO1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
文档编号C12N15/29GK101096681SQ20071005235
公开日2008年1月2日 申请日期2007年6月1日 优先权日2007年6月1日
发明者勇 向, 熊立仲 申请人:华中农业大学