用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法

专利名称：：用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法
技术领域：
：本发明属于生物发酵工程技术，具体涉及一种利用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法。
背景技术：
：S-腺苷蛋氨酸，又名S-腺苷-L-蛋氨酸，英文名S-adenosy卜L-methionine,化学名5'-{[3S-3-氨基-3-羧基-丙基]-曱基-S-砜)-5'-脱氧腺苷，常用缩写SAM、SAMe、AdoMet，分子式C"H22N606S。SAM是蛋氨酸的活性形式,1952年由Cantoni所发现。它是生物体内重要的中间代谢物质，参与多种生化反应。在生物体内，由底物L-蛋氨酸和ATP经过SAM合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase,即ATP:L-methionineS-adenosyltransferase，EC2.5.1.6)酶促合成的。SAM是双手性物质，有2种异构体:(R，S)-SAM和(S，S)-SAM。只有(S,S)-SAM,即(-)-SAM才具有生物活性。作为一种重要的生理活性物质，SAM在人体生命活动中发挥着重要的生理作用，对维护人体健康至关重要。目前已发现至少有35种不同的曱基转移酶反应需要SAM作为曱基供体。许多含氮物质的生物合成都需要从SAM获取曱基，如肌酸、松果素、肾上腺素、曱氧肾上腺素、肉碱、胆碱、曱基组胺等。而曱基化作用不仅仅限于这些物质的合成，在核酸和蛋白质的修饰加工方面也极为重要，如对RNA来说，在rRNA、tRNA或mRNA中，核糖的羟基和碱基的氨基在曱基化时都需要SAM参与。SAM通过转氨丙基参与生物胺的合成。亚精胺和精胺是哺乳动物细胞中不可缺少的组分。SAM两次脱羧后生成5-甲硫腺苷(MTA),接着将氨丙基转移给腐胺和亚精胺而生成相应的亚精胺和精胺。SAM的制备方法有化学合成、酶法合成和微生物发酵等。SAM可以通过S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)和曱基供体(CH3I)化学合成得到。但此法有产率低、反应物S-腺苷高半胱氨酸价格昂贵、反应产物为(士)-SAM的混旋物、少量非活性(+)-SAM难以分离等明显缺点，因而很少在实际生产中应用(MatosJRetal，BiotechnolApplBiochem,1987，9:39~52)。酶法合成利用SAM合成酶催化底物L-蛋氨酸和ATP生成(-)型SAM。该法具有反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短以及无污染等优点。但是，SAM合成酶在动植物和微生物体内含量少、酶活不高、分离纯化困难，，用该法大规模制备SAM受到SAM合成酶活力的限制。考虑到成本太高，所以一般只将其用于合成同位素标记的SAM(ReedBRetal，1986,EP0189322)。某些微生物可以在细胞内积累SAM,尤其是酵母Saccharomyces属的一些菌抹，通过对这些孩支生物的发酵，在培养基中添加一定量蛋氨酸的情况下，可以获得大量的SAM(ShiozakiSetai，AgricBoilChem,1984，48(9):2293~2300)。因此，通过微生物的发酵进而提取SAM是目前SAM工业生产的主要途径。Shiozaki筛选了不同种属的微生物(主要为Saccharomyces和Candida属的不同种的菌抹),分离到一抹Saccharomycessakek-6菌，在10ml培养基中小量发酵产出1.55g/L的SAM。进一步优化培养条件，该菌在IOL发酵罐中培养7天后，SAM产量高达10.8g/L(ShiozakiSetal.JournalofBiotechnology,1986，4:345-354)。这是目前从文献中查到的最高产量。Angeles等通过在细菌中表达大鼠肝脏来源的SAM合成酶，使得细胞内的SAM含量大大提高，但其单位发酵体积中的SAM产量仍较低，只有28nmol/L发酵液。这样的发酵产量，一方面成本较高，另一方面后期的分离纯化工作也有一定的困难。研究发现，在对细胞内各代谢途径清楚了解的基础上，通过有目的地改造细胞的代谢途径可以使细胞成为一个微型的反应器，高效地产出一些代谢中间产物。主要的两条工艺路线一是用含有蛋氨酸的培养基培养酵母和丝状菌，积累后提取；二是用微生物培养法制备SAM合成酶，利用微生物酶源，将ATP和L-蛋氨酸作为合成底物，酶催化反应使ATP和蛋氨酸偶联合成。但因生物细胞中SAM合成酶浓度较低、分离提取困难以及ATP的原料价格高等原因，酶法大规模生产存在着较多限制因素，酶法合成目前还只适合于制备供科学研究使用的材料。目前，发酵法是工业规模生产的主要方法，在底物L-蛋氨酸存在的情况下，可以通过培养微生物细胞来获得SAM。甲醇利用型酵母/Vc力/s，Wor"是一种可以利用曱醇做唯一碳源的酵母菌。它最早是用于生产饲料用单细胞蛋白的。其大规模发酵可得到极高的细胞密度(〉130g/L干细胞重)和生物转化率(〉10g/Lh)。它有下列独特的优点强力而又严密调控的启动子，如醇氧化酶I(methanol-induciblealcoholoxidaseI,A0X1)启动子、甘油搭-3-碌酸脱氢酵(glyceraldehye-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子，曱醛脱氬酶I(formaldehydedehydrogenasesFLDl)启动子，非常适合于控制外源基因的表达；能在确定配方的基本盐培养基中高密度生长。在90年代，毕赤酵母发展成为一种流行的真核表达系统，除了作为蛋白表达系统外，还被利用来作为过氧化物酶体装配的模型生物以及一些生化物质的工业生产。这种低成本、高密度的发酵特点，使得它具备以极低的价格生产精细化学产品的潜力。用发酵法生产SAM在国内尚处于起步阶段，具体进展情况未见报道，发酵生产以及提取精制技术是规模化生产需要克服的主要难题。
发明内容本发明的目的在于提供一种利用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，所述工程菌抹是巳斯德毕赤酵母GS115-samll-208,/7/c力/s/^"or"GS115—saml1—208;典藏号为CCTCCNO:M206106。本发明的技术方案为用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，它是将工程菌林在YPD平板培养基上活化，在2532。C培养4055h,直到单菌落出现；然后，接种到YPD种子培养基，2532X:培养20~30h,再将经种子培养基接种培养的物质进行至少一级接种到发酵培养基内进行培养，即按发酵培养基重量的1.0~20.0%的上一级接种物接入到发酵培养基，在25~32。C培养30-50h后，补充发酵培养基重量5.0~35.0%的甘油做碳源，培养至高密度300~350g/L湿菌体，再补充发酵培养基量5.0~25.0%的曱醇、发酵培养基量1.0~5.5%的L-蛋氨酸在25~32°C进行诱导转化培养24~96h得到腺苷蛋氨酸；所述工程菌林是巴斯德毕赤酵母GS115-samll-208,p/c力/a;a"o".sGS115-sam11-208;典藏号为CCTCCNO:M206106。所述平板培养基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油，20g/L琼脂组成;YPD种子培养基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油组成；发酵培养基由磷酸25mL/L，硫酸钙1.Og/L，硫酸钾15.Og/L,硫酸镁18.Og/L,氢氧化钾3.0/L,甘油6.Og/L组成。对得到的腺苷蛋氨酸进行纯化对发酵液在18'C进行离心分离，收集菌体后，加入1.0~3.O倍菌体重量的去离子水，0.1~0.5倍菌体重量的乙酸乙酯，0.2~0.7倍菌体重量的0.5mol/L硫酸，搅拌l4h，再在18。C进行离心分离，收集上清液；上清液通过离子交换树脂分离纯化，用5.0~8.0%g/v丁二磺酸溶液洗脱，洗脱液通过反渗透浓缩设备进行浓缩到1/10体积，-4(TC~4(TC冷冻干燥，得到腺苷蛋氨酸丁二磺酸盐的白色结晶粉末。本发明成功地建立了在毕赤酵母细胞内表达SAM合成酶基因的技术路线，通过将外源SAM合成酶基因置于强启动子FLD1的调控下，通过强化表达SAM合成酶，使工程菌在培养基中蛋氨酸的存在下，在细胞内合成并大量积累SAM。利用甘油为碳源培养毕赤酵母至高密度，到培养物菌体密度达到一定程度时，改用曱醇为单一碳源诱导SAM合成酶表达。当酶活最高时，开始添加蛋氨酸，通过具有高酶活的酵母在胞内将蛋氨酸转化为SAM。发酵培养基选择比较廉价的高盐培养基，主要成分硫酸钾、硫酸钓、硫酸镁、磷酸、氢氧化钾、甘油及微量元素等，具有价格便宜、不易污染的优点。本发明方法简单、周期短、高产、低成本。附图双酶切示意图。具体实施例方式本发明根据Genebank中的S.cerevisiae来源的SAM合成酶2基因(登录M23368)，设计两条专一引物，PCR扩增得到此酶基因。将克隆得到的来源于酿酒酵母的SAM合成酶2基因装配到甲醇酵母的表达载体pPIC9k中,得到表达质粒pPIC9k-SAM2,使S認合成酶2基因置于启动子FLD1的控制下。以上得到质粒经过线性化后，通过原生质体或电转化的方法转入曱醇酵母？/c力/s"Wor/s宿主细胞C57i乂该表达质粒中的启动子系列或3'末端序列提高与尸/c力//^Wor/s染色体DNA同源重组，使得外源的SAM合成酶2基因整合入酵母染色体中，并在重组细胞内稳定地得到表达。这种整合于染色体的重组表达方式比单独复制的质粒表达形式的稳定性强。实验表明此类重组菌即使经过100代的连续传代后，染色体组型和蛋白表达量都没有明显的变化(H0hi，yeast，1998,14:895~903)。由于整合如酵母中的表达质粒含有卡那霉素抗性基因，使得重组酵母细胞能够在含有一定卡那霉素浓度的抗性培养基上生长。这样就很方便的利用抗性筛选得到阳性克隆细胞。为了得到高产SAM的工程菌抹，将利用抗性筛选得到的不同菌株在含有L-蛋氨酸的发酵培养基中培养，同时补充一定量的碳源(甘油和曱醇)，菌抹利用培养基中的L-蛋氨酸作为底屋，在SAM合成酶的催化下，可以在细胞内合成并积累SAM。根据积累量的高低筛选得到一抹高产SAM的菌抹。该菌抹已经于2006年10月在典型培养物保藏中心进行了典藏，典藏号为CCTCCNO:M206106，分类命名号为//c力/s戸"。r"。利用此工程菌抹进行扩大发酵培养，对温度、pH、溶解氧等发酵条件进行优化控制，同时在发酵过程中补充一定量的甘油、曱醇、蛋氨酸和微量元素，SAM产量达到4.0~7.Og/L。具体实施工程为1、菌抹和试剂/c力/，"oW^宿主菌C57i乂抗性标记为氨千青霉素和卡那霉素，酵母表达质粒pPIC9k，均为Invitrogen公司产品。载体为Ppic9k，宿主菌为E.coliDH5a用于进行克隆步骤。T4DNAPolymase，T4DNALigase，和限制性内切酶均来源于宝生物公司。胶回收试剂盒购于上海正谷生物公司。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。2、培养基种子培养基YPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油)；平板培养基YPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油，20g/L琼脂)；大肠杆菌LB培养基LB(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，pH7，0);LB固体培养基(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，20g/L琼脂粉，pH7.0);选择培养基MD(1.34%YNB，0.00004%生物素，2°/。葡萄糖,1.5%琼脂);诱导培养基BMGY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，13.4g/LYNB,0.0004g/L生物素，10g/L甘油，0.lmol/L磷酸緩冲液，pH6.0);转化培养基BMMY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨,13.4g/LYNB，0.0004g/L生物素，10g/L曱醇，O.lmol/L磷酸緩沖液，pH6.0)。发酵培养基(磷酸25mL/L,硫酸钙1.0g/L，疏酸钾15.Og/L,硫酸镁18.Og/L，氢氧化钾3.0/L，甘油6.Og/L)。3、常规分子生物学操作S.cerevisiae基因组DNA抽提，基因克隆按照奥斯伯等的方法(奥斯伯等，1995，精编分子生物学实验指南，第三版)进行。工程菌抹巴斯德毕赤酵母GS115-samII-208，//c力/a声"o"、GS115-samll-208的制备曱醇酵母重组表达SAM合成酶2基因质粒pPIC9k-SAM2的构建1、引物设计和PCR反应根据Genebank中的S.cerevisiae来源的SAM合成酶2基因(登录M23368)，设计两条专一引物primer1:5'-gCggCgAATTCATgTCCAAgAgCAAAACTTTC-3'primer2:5'-ATTgCggCCgCTggTTTTTCCCATgAgTACTC-3'在设计时，基因5，-端引物引入了一个EcoRI酶切位点，3，端引物引入了一个NotI酶切位点。如附图所示。抽提酿酒酵母基因组染色体总DNA,以酿酒酵母染色DNA为模板，加入25微克的引物、TaqDNA聚合酶及dNTP混合物，进行PCR扩增，PCR反应条件如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、PCR产物的克隆PCR产物经1%琼脂糖电泳后，采用DNAM^回收试剂盒回收1.2kb大小的PCR扩增片段。将回收的PCR产物经过EcoRI和NotI双酶切后与经过EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k质粒连接，装配得到表达质粒pPIC9k-SAM2。将获得的表达质粒pPIC9k-SAM2经过EcoRI和NotI双酶切与PCR扩增均能够得到1.2kb左右的片段，与理论SAM合成酶2基因一致。测定序列后表明其与Genebank中发表的SAM合成酶2基因序列完全相同。表达外源SAM合成酶2基因的重组细胞的构建1、电转化曱醇酵母细胞的制备接种6"i7W于50mLYPD培养基，30。C培养，A,關为1.5,4。C4000rpmx10min离心，菌体沉淀分别用50mL、25mL冷冻无菌水和2mL冷冻山梨醇各洗一次，每次洗后均4。C4000rpmxlOmin离心，并收集菌体，最后将离心的菌体细胞用100uLlmol/L水冻的山梨醇悬浮，即获得电击感受态细胞。2、重组表达质粒pPIC9k-SAM2电转化感受态酵母细胞。将构建好的重组表达质粒pPIC9k-SAM2约20ug用BglII酶切线性化，乙醇沉淀回收线性DNA并溶解于10uL无菌水中，同时将空载体pPIC9k用相同BglII的酶切线性化，并回收作为对照。将上述线性化DNA分别与100ul感受态细胞混合，采用电转化仪电击转化。电转化条件为电压1600V,电击时间5ms。立即向电转化杯中加入lmLlmol/L冰浴预冷的山梨醇，并将电转化产物分别转移到无菌管中，3(TC保温lh，加入0.5mLYPD培养基，30。C保温1.5h，4。C4000rpmx5min离心，取200uL菌液涂布于MD平板上。3(TC培养直到出现单菌落。3、抗性菌4朱筛选挑取平板上的生长菌落于细胞培养板的孔中培养，取10ul孔中液体加入含O.5~4.Omg/mL的G418浓度的YPD平板上以筛选多拷贝阳性转化子。由于Ppic9k载体含有一个卡那霉素的抗性基因，它能使酵母细胞对卡那霉素产生抗性，如果转入的外源基因拷贝数越多，转化的酵母菌耐受卡那霉素的浓度就越高，其分泌的蛋白量也会增加。细胞SAM快速抽提将上述发酵液4。C4000rpmx5min离心收集，加入等体积的20°/。高氯酸于4'C抽提lh,4'C12000rpmx5min离心，将上清液用0.2um滤膜过滤，取20uL用HPLC测定SAM含量。SAM的HPLC含量测定色i普柱为C,8反相柱(250mmx4.6mm);流动相为2mmol/L庚坑磺酸钠，40mmol/L磷酸二氢铵，20°/。曱醇；流速为1.Oml/min;枱r测波长254nm;进样体积20uL。采用外标方法，根据样品峰面积与已知浓度SAM标准品峰面积的比值来定量。发酵液SAM含量达到4.0~7.Og/L。SAM酶活力测定发酵液离心(5000rpmxlOmin)收集菌体加入裂解緩沖液，清洗1次。去上清后加入与菌体等量的玻璃珠和4倍的裂解緩冲液，0~4'C超声处理10min裂解细胞。离心(10000rpmx5min)除去玻璃珠和细胞残片，上清再离心(12000rpmx60min)，得到上清粗酶液。反应体系20mmol/LL-蛋氨酸，20mmol/LATP,8mmol/L还原性谷胱甘肽，2Gmmol/L氯化镁，10Gmmol/L氯化钾，150mmol/LTris-HCl(pH7.4),适量的细胞裂解液。37。C恒温60min，加入20°/。高氯酸终止反应，离心去除沉淀，上清过滤后用HPLC测定含量。每活力达到3.5~4.8mg/L.h。上述得到的工程菌抹巴斯德毕赤酵母GS115-samll-208，;/c力/a/a"or/sGS115-samII-208的藏号为CCTCCN0:M206106。用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸将工程菌抹在YPD平板培养基上活化，在(25-32。C如25°C、27°C、28°C、29°C)培养40~55h(如40h、42h、45h、48h、53h)，直到单菌落出现；然后，接种到YPD种子培养基，25~32°C(如25。C、27。C、28°C、29°C)培养20~30h(如20h、22h、24h、28h、30h)，再将经种子培养基接种培养的物质进行至少一级接种到发酵培养基内进行培养，即按发酵培养基重量的1.0~20.0°/。(如1%、5%、10%、15%、20%)的上一级接种物接入到发酵培养基，在2532。C(如25。C、27°C、28°C、29°C、32°C)培养30~50h(如30h、36h、48h、50h)后，补充发酵培养基重量5.0~35.0%的甘油做碳源，培养至高密度300~350g/L湿菌体，再补充发酵培养基量5.0~25.0%的曱醇、发酵培养基量1.0~5.5%的L-蛋氨酸在25~32°C(如25°C、27。C、28°C、29°C、32°C)进行诱导转化培养24~96h得到腺苷蛋氨酸；在上述发酵过程中利用氨水控制PH在4.0-7.0,同时溶解氧不低于25%，通过对发酵容器中补充压缩空气来实现。经过发酵培养工程菌抹SAM产量达到4.0~7.0g/L。与宿主菌抹相比SAM产量提高了100倍。SAM的分离纯化发酵液，4。C3000rpmx10min离心，收集菌体，加入1.0~3.0倍菌体量的去离子水，0.1-0.5倍菌体量的乙酸乙酯，0.2-0.7倍菌体量的0.5mol/L石克酸，搅拌l-4h,4°C3000rpmx1Omin离心，收集上清液。沉淀弃去。上清液通过D113弱酸型阳离子交换树脂和D201弱碱型阴离子交换树脂分离纯化，用5.0-8.0%(g/v)丁二磺酸溶液洗脱，洗脱液通过反渗透浓缩设备进行浓缩到1/10体积，-40°C4(TC冷冻干燥，得到腺苷蛋氨酸丁二磺酸盐的白色结晶粉末。收率40-60%。本发明纯化方法狄用絮凝方法除去部分杂质，通过弱酸性阳离子交换树脂吸附和弱碱性阴离子交换树脂脱盐后，再经过树脂脱色、反渗透浓缩及冷冻干燥等步骤得到符合质量要求的产品。与传统方法比较，该生产工艺具有IM乍简单、^M咏肯M毛低等优点。权利要求1、一种用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，它是将工程菌株在YPD平板培养基上活化，在25～32℃培养40～55h，直到单菌落出现；然后，接种到YPD种子培养基，25～32℃培养20～30h，再将经种子培养基接种培养的物质进行至少一级接种到发酵培养基内进行培养，即按发酵培养基重量的1.0～20.0％的上一级接种物接入到发酵培养基，在25～32℃培养30～50h后，补充发酵培养基重量5.0～35.0％的甘油做碳源，培养至高密度300～350g/L湿菌体，再补充发酵培养基量5.0～25.0％的甲醇、发酵培养基量1.0～5.5％的L-蛋氨酸在25～32℃进行诱导转化培养24～96h得到腺苷蛋氨酸；所述工程菌株是巴斯德毕赤酵母GS115-samII-208，pichiapastorisGS115-samII-208；典藏号为CCTCCN0M206106。2、如权利要求1所述用基因工程菌发酵生产腺苦蛋氨酸的方法，其特征在于发酵过程中利用氨水控制PH在4.0-7.0,同时溶解氧不低于25%。3、如权利要求1所述用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于对得到的腺苷蛋氨酸进行纯化对发酵液在1~8"C进行离心分离，收集菌体后，加入1.0~3.O倍菌体重量的去离子水，0.1~0.5倍菌体重量的乙酸乙酯，0.2~0.7倍菌体重量的0.5mol/L疏酸，搅拌l~4h,再在l-8。C进行离心分离，收集上清液；上清液通过离子交换树脂分离纯化，用5.0~8.0%g/v丁二磺酸溶液洗脱，洗脱液通过反渗透浓缩设备进行浓缩到1/10体积，-40°C~40。C冷冻干燥，得到腺苷蛋氨酸丁二磺酸盐的白色结晶粉末。4、如权利要求1所述用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于所述平板培养基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油，20g/L琼脂组成；YPD种子培养基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油组成；发酵培养基由磷酸25mL/L，硫酸钾l.0g/L，石危酸钾15.0g/L，硫酸镁18.0g/L，氲氧化钾3.0/L，甘油6.Og/L组成。5、如权利要求1所述用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于所述工程菌抹它是这样得到的(1)PCR反应抽提酿酒酵母基因组染色体总DNA，以酿酒酵母染色DNA为模板，加入2~5微克的引物、TaqDM聚合酶及dNTP混合物，进行PCR扩增；所述引物为引物l:5'-gCggCgAATTCATgTCCAAgAgCAAAACTTTC-3'引物2:5'-ATTgCggCCgCTggTTTTTCCCATgAgTACTC-3'基因5'-端引物引入了一个EcoRI酶切位点，3'端引物引入了一个NotI酶切位点；(2)PCR产物的克隆PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳后，采用DNA胶回收试剂盒回收1.2kb大小的PCR扩增片段；将回收的PCR产物经过EcoRI和NotI双酶切后与经过EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k质粒连接，装配得到表达质粒pPIC9k-SAM2;将获得的表达质粒pPIC9k-SAM2经过EcoRI和NotI双酶切与PCR扩增均能够得到1.2kb的片段；(3)电转化曱醇酵母细胞的制备接种C57"于50mLYPD培养基，30匸培养，A,詣为1.5，1~8'C离心分离，菌体沉淀分别用50mL、25mL冷冻无菌水和2mL冷冻山梨醇各洗一次，每次洗后均1-8。C离心分离，并收集菌体，最后将离心的菌体细胞用100uLlmol/L水冻的山梨醇悬浮，即获得电击感受态细胞；(4)重组表达质粒pPIC9k-SAM2电转化感受态酵母细胞将构建好的重组表达质粒pPIC9k-SAM2约20ug用BglII酶切线性化，乙醇沉淀回收线性DNA并溶解于10uL无菌水中，同时将空载体pPIC9k用相同Bgin的酶切线性化，并回收作为对照；将上述线性化DNA分别与100ul感受态细胞混合，采用电转化仪电击转化；转化后立即向电转化杯中加入lmLlmol/L冰浴预冷的山梨醇，并将电转化产物分别转移到无菌管中，30。C保温lh,加入0.5mLYPD培养基，30。C保温1.5h，18。C离心分离，取200uL菌液涂布于MD平板上，30。C培养直到出现单菌落；(5)抗性菌抹筛选挑取平板上的生长菌落于细胞培养板的孔中培养，取10ul孔中液体加入含0.5~4.Omg/mL的G418浓度的YPD平板上以筛选多拷贝阳性转化子；(6)细胞SAM快速抽提将经筛选的发酵液离心分离，加入等体积的20%高氯酸于418XTC抽提后，再离心分离，将上清液过滤得到工程菌株。全文摘要本发明公开了一种用基因工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，它是将工程菌株在平板培养基上活化后，接种到种子培养基培养，再将经种子培养基接种培养的物质进行至少一级接种到发酵培养基内进行培养，补充甘油做碳源，培养至高密度300～350g/L湿菌体，再补充甲醇和L-蛋氨酸进行诱导转化培养，得到腺苷蛋氨酸；所述工程菌株是巴斯德毕赤酵母GS115-samII-208，pichiapastorisGS115-samII-208；典藏号为CCTCCNOM206106。方法简单、周期短、高产、低成本。文档编号C12P19/00GK101173308SQ200710052338公开日2008年5月7日申请日期2007年5月31日优先权日2007年5月31日发明者刘胜祥申请人:武汉武大弘元股份有限公司