利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK03提高植物耐冷能力的制作方法

专利名称：利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK03提高植物耐冷能力的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及-种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所 述的基因与植物耐冷有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与烟草花叶病毒的组成型启动子 (CaMV35S)结合后直接转入一般植物体，转基因植株的耐冷能力显著提高。
背景技术：
植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，千旱、盐害和低温往往导致农作物的大规模减产，在 许多地区是农业发展的瓶颈。为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种 途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干早、高盐、低温等胁迫伤害的功 能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出裙应的反应(Xiong 等Cell signaling during cold, drought and salt stress. Plant Cell. 14 (s,l), S165-S183， 2002)。 而那些功能基因的表达对植株对环境做出反应，最终使其存活起着重要的作用。而目前在许多植物中发现 CDPK、 CIPK、 MAPK等蛋白激酶家族在植株逆境信号的传递、逆境的适应性方面起着重要的作用。这些蛋白激 酶基因在不同的逆境胁迫下，可诱导表达或被抑制，因而认为这些蛋白激酶基因在植物对逆境的应答过稈中 起着非常重要的作用。因此分离和鉴定这类能提高植物应对逆境的功能基因对于作物抗逆境的遗传改良，对 育种有着重要的意义。目前人们已在植物抗性改良方面作了尝试，利用DREB1A和DREB2A培育的转基因拟南 芥植株，其低温耐性和干旱，高盐耐性都比野生型强(LiuQ等Two transcription factors, DREB1 and DREB2， with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought - and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell. 1998, 10: 1391-1406.)。美国Michigan州立大学的Thomashow MF研究小组利用拟南芥627=7基因，进行遗传转化，也 培育出耐寒性增强的植株。
水稻是最重要的粮食作物之一，耐冷的水稻对我们来说具有重要的意义，因而找出与抗冷的功能基因， 培育耐冷和耐寒的品种对提高水稻产量具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含有耐冷相关基因完整编码区段的DNA片段，利用这个基因改 良水稻或其它植物的抗逆性，特别是通过转基因，提高转基因植物的耐冷性。对这个基因进行结构分析其属 于植物CIPK蛋白激酶家族，而且是跟逆境相关的，将该克隆的基因被命名为&C/ rft 。
本发明涉及分离和应用一种包含&C/尸,ft 基因的DNA片段，该片段赋予植物在低温等逆境条件下，增强 耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 1所不，或者基本上相当于SEQ ID NO: 1所不的高度同源 DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO: 1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的te6Y尸AW 基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源某fel 。 同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明fls^/尸仰3 基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含^a7YO 基因的 序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得对低温胁迫耐受
力得到增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何-种 强启动子或诱导型启动于。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可 以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。 携带有本发明&^/尸,0 基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射， 电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach， 1998， Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp. 411-463; Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2"'1 Edition)。 可使用包括本发明的ttsC/尸,ft 基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗寒的植物品种。 本发明基因是受逆境诱导表达的，因此其启动子是诱导型启动子，将本发明的启动子区段与任何感兴趣 的基因同时连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物对逆境的耐受 能力。
卜面结合具体实施例对本发明做进一步说明。


序列表SEQ ID NO: 1显示的是本发明分离克隆的包含有fe"尸JO 基因编码区DNA片段序列。 图1: feCffift"基因分离和鉴定流程图。
图2:用Northern杂交检测&^//￥03基因在干旱，高盐，低温，PEG和ABA等逆境胁迫不同时间点的表 达水平。
图3:用于水稻遗传转化的载体。将目标基因&0/^0 序列通过1^重组反应替换图屮attRl-attR2部 分即得到fl CT/^氾超量表达载体。
图4:在水稻中超量表达基因能提高植株耐低温的能力。A, ft C77Wtt 基因在转基因植株中 的表达情况，最后一道为对照，其余为转基因独立转基因植株。B，转基因家系和野生型对照正常情况下的生 长情况；C,转基因家系和野生型对照低温胁迫(4'C胁迫5天，正常生长5天)后的生长情况；D，转基因家 系和野生型对照低温胁迫(4'C胁迫4天，止常生长7天)后的存活率统计。
图5:超表达基因使得植株体内的脯氨酸含量增加。待植株生K到四叶期吋对其进行4'C低温 胁迫，分别在0、 1、 3、 6天的时候取样用于脯氨酸含量的测定。
图6:脯氨酸合成和转运相关基因在to67/^Oy超表达植株中表达量的检测。
具体实施例方式
本发明的前期丄作获得了来源于水稻品种明恢63 (—种中国普遍推广应用的个水稻品种)的cDNA克 隆EI101L12。该cDNA是fls6YMH 基因的全长cDNA,是一个抗逆境相关基因。主要依据有以下几个方面(1) 采用cDNA芯片技术分析发现cDNA克隆EI101L12在水稻品祌"中旱5号"(由中国上海农科院提供的 -个公 开使用的 一个水稻品种)干旱胁迫处理15天表达量增加2. 5倍。对其进行测序，分析发现该基因就是ft 乙'/尸Jft
(Genebank登录号为AK111929)。鉴于该克隆表达量在千旱处理后的明显差异和其功能特征，认为EI101L12 克隆所代表的基因在逆境下参与调控基因的表达。(2)对其进行逆境条件下的表达谱分析(图2)，发现在胁 迫处理的过程中，表达量有明显的提高。(3),将其全长基因在植株中超量表达，转基因植株的耐冷性能力大 大增强(图4)。这些结果都表明ttsd尸A"05基肉是-个逆境相关调控基冈，参与植物对逆境的调控。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有feC/尸Att 基因完整编码区段的DNA片段以及验证flsC7尸,0 基因功能的方法(发明流程如图l所示)。根据以下的描述和这些 实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本 发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例l :分离克隆包含有&C/Z^a 基因区段的DNA片段
通过水稻品种"屮旱5号"(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)的干旱诱导基因 表达谱分析，发现了--个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高2.5倍以上)的EST (表达序列签)，经 序列分析发现，该基因为CIPK蛋白激酶家族的一个成员，并且是全长序列，其对应日本水稻全长数据库 (http:〃cdna01. dna. affrc. go. jp)中的cDNA克隆001-015-H02。根据该克隆序列，设计引物OsCIPK03F (5' -CACCATGTATAGGGCTMGAGGGCT-3'， 序列特异引物外加接头CACC位点)和 0sCIPK03R (5'-TTGMACTCACAAACTGTCA-3')，将该克隆的l-1653bp序列从"中旱5号"品种中反转录扩增出来。扩增产 物就是本发明的序列l-1653bp (图3)。具体步骤为采用TRIZ0L试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫 处理的水稻品种"中旱5号"中提取叶片总RNA (提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购 自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链。根据cDNA克隆001-015-H02的序列设计的巢式引物将其 从反转录产物屮扩增出来，反应条件为94'C预变性2min; 94°C 30sec， 55'C 30sec， 72°C 2min， 30个循 环；72°C延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序， 获得所需的全长基因。该克隆命名为PGEM-0sCIPK03。
实施例2:检测水稻内源基因^(7//Yft 的诱导表达
以水稻品种"中旱5号"为材料，在3叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及脱落酸(ABA)，聚乙二 醇(PEG)处理。干旱处理是将水稻幼苗断水，并在0 h， 3 h， 6 h， 12 h， 24 h后取样。冷害处理是将水稻 幼苗置于4°C生长箱，O h， 3 h, 6 h, 12 h， 24h后取样。高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200 mM/L NaCl溶 液中并在0h， 5h, 14h, 24h后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100 W/L ABA溶液巾并在0 h, 3h, 6h， 12h和24h后取样。PEG处理是将幼苗根部浸泡在20X的PEG6000溶液中并在0 h， 3h, 5h, 12h后取样。提 取叶片的总RNA (Trizol试剂，购自InvUrogen公司)后按《分子克隆》(J.萨姆布鲁克，科学出版社，北 京，1999年版)有关实验操作方法进行RNA转膜，并以toC/^ra 为探针做Northern杂交。结果表明，本发 明克隆的基因flsa7^0 能被干旱、冷害、高盐和ABA、 PEG诱导表达(如图2所示)，是一个与逆境相关的蛋 白激酶。
实施例3， fl C7fiKU基因超量表达载体的构建，转化
根据实施例2的结果，知道本发明基因foCJ/m J是能被干旱、冷害、高盐，脱落酸(ABA)和聚乙二醇 (PEG)诱导表达的，为了能更好地阐明此基丙的功能，申请人将其在水稻中超量表达，从转基因植株的表型 来验证。方法是旨先以实施例1屮得到的阳性克隆pGEM-0sCIPK03质粒为模板，以实施例1中的引物和条 件做PCR扩增外源片段，并将外源片段导入中间载体pENTR/D-T0P0 (载体购向Invitrogen公司，具体步骤见 试剂盒说明书)，进一步通过LR重组反应(参照Invitrogen公司的LR反应重组试剂盒使用说明书)将目标 基因重组到携带烟草花叶病毒启动子(CaM35S)的遗传转化载体pCB2004H。转化大肠杆菌DH10P (菌株购 自Invitrogen公司)。筛选阳性克隆，获得转化载体。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11 (中国农业科学院作物科学研究所提供 的-个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生 根、练苗移栽，得到转基因植株。将获得的转基因水稻植株命名为T35。本发明总共获得独立转基因水稻植株 23株。
农杆菌介导的水稻(粳稻业种)遗传转化体系采用申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室建立的转化 体系。该体系的具体步骤如下
(1) 试剂和溶液縮写
本发明中培养基所用到的植物激素的縮写表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine, 6-苄基腺嘌呤)； CN (Carbenicillin，羧节青霉素)；KT (Kinetin，激动素)；NAA (Napthalene acetic acid，萘 乙酸)；IAA (Indole-3-acetic acid， B引哚乙酸)；2, 4-D (2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid， 2,4-二氯苯氧乙酸);AS (Acetosringone，乙酰丁香酮);CH (Casein Enzymatic Hydrolysate, 水解酪蛋白)；HN (Hygromycin B，潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚砜)；N6max (N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSraix (MS微量成分 溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培养基大量元素母液[IO倍浓缩液(10X)]的配制 硝酸钾(KNO:i) 28.3 g 磷酸二氢钾(KH2P04) 4. 0 g
硫酸铵((NH4)2S04 ) 4.63 g
硫酸镁'(MgSO,7H20) 1. 85 g
氯化钙(CaCh2H20) 1. 6fi g
逐'溶解，然后室温下定容至1000 ml。
2) N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制 碘化钾(KI) 0. 08 g
硼酸(H3B03) 0. 16 g
硫酸锰(MnS04 4H刀) 0. 44 g
硫酸锌(ZnS04 7H刀) 0. 15 g
室温下溶解并定容至IOOO ml。
3) 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制
准备800 ml双蒸水并加热至70'C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na必DTA 2H20) 3.73克，充分溶 解后在70'C水浴中保持2小时，定容至1000 ml， 4'C保存备用。
4) 维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinic acid) 0. 1 g
维生素Bl (Thiamine HQ) 0. 1 g
维生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. 1 g
甘氨酸(Glycine) 0. 2 g
肌醇(Inositol) 10 g
加水定容至1000 ml, 4"C保存备用。
5) MS培养基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸铵(NH4N03) 16. 5 g
硝酸钾 19.0 g
磷酸二氢钾 1.7 g
硫酸镁 3. 7 g
氯化钙 4. 4 g
室温下溶解并定容至1000 ml。 6) MS培养基微量元素母液(IOOX)的配制
碘化钾 0.083 g
硼酸 0.62 g
硫酸锰 0. 86 g
钼酸钠(Na2Mo04 2H20) 0. 025 g
硫酸铜(CuS04 5H20) 0. 0025 g
室温卜—溶解并定容至IOOO ml。
7) 2,4-D贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取2,4-D 100 mg，用l nil 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO ml蒸馏水溶解完全后定容 至IOO ml,于室温下保存。
8) 6-BA贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取6-BA100 mg,用l ml 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO ml蒸馏水溶解完全后 定容至100 ml,室温保存。
9) 萘乙酸(NAA)贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取NAA100 mg,用l ml 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO ml蒸馏水溶解完全后定容至 100 ml, 4'C保存备用。
10) 吲哚乙酸(IAA )贮存液(1 mg/ml)的配制
秤取IAA 100 mg，用l tnl 1 N氢氧化钾溶解5分钟，然后加IO nil蒸馏水溶解完全后定容至 100 ml, 4'C保存备在一个大二角瓶中加入300 ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO, 7H20) 2. 78g。在另一 个大三角瓶中加入300 ml蒸馏水用。
11) 葡萄糖IC存液(0.5 g/ml)的配制
秤取葡萄糖125 g，然后用蒸馏水溶解定容至250 ml,灭菌后4'C保存备用。
12) AS贮存液的配制
秤取AS 0.392 g , DMSO 10 ml,分装至l. 5 ml离心管内，4'C保存备用。
13) IN氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6 g，并用蒸馏水溶解定容至100 ml,室温保存备用。 (3)用于水稻遗传转化的培养基配方 1)诱导培养基
N6max母液〔IOX〕 100 ml
N6mix母液(100X)10 ml
Fe"EDTA贮存液(100X)10 ral
维生素贮存液(100X)10 ml
2， 4-D贮存液2. 5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 g
CH0. 6 g
蔗糖(Sucrose)30 g
Phytagel3 g
加蒸馏水至900 ml， IN氢氧化钾调节pH值到5.9,煮沸并定容至1000 ml，分装到50 ml三角瓶(25 ml /瓶)，封口灭菌。 2)继代培养基 N6隨母液(服) N6raix母液(100X) Fe2'EDTA贮存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2, 4-D贮存液
100 ml 10 ml 10 ml 10 ml 2. 0 ml 0. 5 g
0. 6 g 30 g
3 g
加蒸馏水至900ml， 1N氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000 ml,分装到50ml 二角瓶(25 ml /瓶)，封口灭菌。3)预培养基
12. 5 ml
1. 25 ml
2. 5 ml 2. 5 ml 0. 75 ral 0. 15 g
5 g
1. " g
加蒸馏水至250 ml, IN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5 ml葡萄糖贮存液和250 W AS贮存液，分装倒入培养皿中(25 ml/ 皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X) 12. 5 m丄
N6mix母液(100X) 1.25ml Fe"EDTA贮存液(1Q0X) 2.5 ml
CH
蔗糖
Phytagel
N6max母液(雨) N6mix母液(100X) Fe2'EDTA贝上存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2， 4-D贮存液 CH
蔗糖
琼脂粉(Agarose)
维生素贮存液(100X)
2, 4-D贮存液
CH
蔗糖
琼脂粉
2.5 ml 0. 75 ml 0.2 g
5 g 1.75 g
加蒸馏水全250 ml, IN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5 ml葡萄糖贮存液和250 W AS贮存液，分装倒入培养皿中(25 ml 每皿)。
5)悬浮培养基 恥max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2+EDTA歸液(100X) 维生素贮存液(100)0 2, 4-D贮存液 CH
蔗糖
5 ml 0. 5 ml 0. 5 nil 1 ml 0.2 ml 0.08 g
加蒸馏水至IOO ml，调节pH值到5.4，分装到两个IOO ml的三角瓶中，封口灭菌。 使用前加入l ml葡萄糖贮存液和IOO W AS贮存液。
6) 选择培养基
25 ml 2.5ml 2. 5 ml 2.5 ml 0. 625 ml
0. 15 g 7. .5 g
1. 巧g
加蒸馏水至250 ml，调节pH值到6.0，封U灭菌。
使用前溶解培养基，加入250 W丽和400 ppm CN，分装倒入培养皿中(25 ml /皿)
7) 预分化培养基
25 ml
2. 5 ml 2. 5 ml 2. 5 ml 0. 5 ml 0. 5 ml 50 W
N6raax母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe2—EDTA Pt存液(100X)
维生素贮存液(100X)
2, 4-D贮存液
CH
蔗糖
琼脂粉
N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2'EDTA IC存液(100X) 维生素贮存液(100X) 6-BA贮存液 KT贮存液 NAA C存液IAA贮存液
CH
蔗糖
琼脂粉
50 W 0. 15 g
7.5 g 1,75 g
加蒸馏水至250 ml， 1 N氢氧化钾调节pH值到5.9，封U灭菌。
使用前溶解培养基，加入250 W HN和200 ppm CN，分装倒入培养肌中(25 ml /皿)。
8) 分化培养基
N6max母液(10X) 100 ml
N6mix母液(100X) 10 ml
Fe2'EDTA贮存液(100X) 10 ml
维生素贮存液(100X) 10 ml
6-BA IC存液 2 ml
KT贮存液 2 ml
NAA贮存液 0. 2 ml
IAA lt存液 0. 2 ml
C H 1 g
蔗糖 30 g
Phytagel 3 g
加蒸馏水至900 ml, 1 N氢氧化钾调节pH值到6. 0。
煮沸并定容至IOOO ml,分装到50 ml三角瓶(50 ml /瓶)，封n灭菌。
9) 生根培养基
MSmax母液(10X) 50 ml
MSmJx母液(100X) 5 ml
Fe2EDTA !C存液(100X) 5 ml
维生素贮存液(100X) 5 ml
蔗糖 30 g
Phytagel 3 g
加蒸馏水至900 ml， 1 N氢氧化钾调节pH值到5. 8。 煮沸并定容至IOOO ml,分装到生根管中(25 ml /管)，封口灭菌。 (4)农杆菌介导的遗传转化步骤 4. 1愈伤诱导
(1) 将成熟的水稻种子(中花ll，中国农业科学院作物科学研究所)去壳，然后依次用70%的乙 醇处理1分钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟
(2) 用灭菌水洗种子4-5次；
(3) 将种子放在诱导培养基上；
(4) 将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25士rC。
4.2愈伤继代挑选亮黄色、紧实艮相对干燥的肝性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25± 1 'C 。 4. 3预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25土rc。 4. 4农杆菌培养
(1) 在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA,商用菌株)两天， 温度28'C;
(2) 将农杆菌转移至悬浮培养基里，28'C摇床上培养2-3小时。 4. 5农杆菌侵染
(1) 将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；
(2) 调节农杆菌的悬浮液辛0D 0. 8-1. 0:
(3) 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
(4) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20'C。 4. 6愈伤洗涤和选择培养
(1) 灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
(2) 浸泡在含400 ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；
(3) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
(4) 转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400 ppm，第 二次以后为250 ppm)
4.7分化
(1) 将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；
(2) 转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，在培养室温度26"C下每天光照培养14小时(光照强度 1000-15001x)，暗培养10小时。
4.8生根
(1) 剪掉分化时产生的根；
(2) 然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，培养条件同4. 7的步骤(2)所述。 4.9移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。 实施例4: flsCZ7^ft 基因转基因T2家系苗期耐冷筛选
为了验证转基因水稻植株的耐冷性是否增强以及其增强是否与转入的ftr(7i7^("基因有关，本发明采用 Northern杂交技术对转基因水稻植株屮fl C77^0 基因的表达进行检测(图4A为Northern杂交(方法同实施 例2)的结果，并对本发明T2代楨株的部分家系进行了耐冷性筛选。具体步骤如下T2代家系的种子在含有 50mg/ml潮霉素的生根培养基发芽5天后，将发芽一致的幼苗移栽到小红桶中，并种植野生型对照植株，发现 转基因家系和野生型对照的生长发育并没有明显的差别(图4B〕。在植株长到4叶期时，对K.进行4'C低温处 理(每天处理24小时)，处理5天后，观察了转基因和对照植株的表型，似乎没有显著性差异.但将它们转 到正常条件恢复生长5天后，发现大部分对照植株已经死亡，而转基因株系大部分都能存活(图4C)。另外一 组实验中，4叶期的植株4'C低温处理5天(每天处理时间为24小时)后再恢复生长7天后，统计植株的存 活率发现，0sCIPK03的超表达家系的植株存活率(68.2 / -90.4%)同对照的(18.5%)差异极其显著(图4D)。该结果说明0 67/^ft 基因的确与耐冷相关，其超量表达能提高转基因植物的耐冷性，转基丙水稻植株的抗性增 强确实与转入的《^//^氾基因有关。
实施例5: fe"7^ft 基因转基因T2家系脯氨酸含量的测定
在逆境条件下，植物体内的脯氨酸含量显著增加。植物体内的脯氨酸含量在一定程度上反应了植物的抗 逆性。在低温条件下，植物组织中的脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性。在实验时待本发明的转基因水稻植 株生长到四叶期时对其进行4'C低温胁迫，分别在0、 1、 3、 6天的时候取样用于脯氨酸含暈的测定。实验结 果显小如图5。表明0sCIPK03超表达家系在受到冷胁迫吋积累的脯氨酸量是野生型对照的2 — 4倍。结果说明 本发明克隆的&^7/￥^ 基因的超表达引起了脯氨酸含量的增加，因向'显著提高了转基因水稻植株对低温的耐 受能力。
脯氨酸含量测定的主要原理是用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中， 然后用酸性茚二酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表 示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上査出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
脯氨酸含量测定的具体步骤如下如下 一、材料、仪器设备及试剂
( )材料待测植物为本发明的转基因水稻植株叶片和未转基因水稻植株的叶片。
(二) 仪器设备1. 722型分光光度计；2'.研钵；3. 100ml小烧杯；4.容量瓶；5.大试管；6.普通
试管；7.移液管；8.注射器；9.水浴锅；10.漏斗；11.漏斗架；12.滤纸；13剪刀。
(三) 试剂l.酸性幼-三酮溶液将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热(70 'C)溶解，贮于冰箱中；2. 3%磺基水杨酸3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml; 3.冰醋酸；4.甲 苯。
一、实验步骤
1. 标准曲线的绘制(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后 倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100iig。 (2)系列脯氨酸浓度的配制 取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀， 各瓶的脯氨酸浓度分别为1, 2, 3， 4, 5及6ug/ml。 (3)取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸 溶液及2ml冰醋酸和2ral酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 (4)冷却后各试管准确加入4ml甲苯， 振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中， 以甲苯溶液为空A对照，于520nra波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓 度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量(ug/加l)。
2. 样品的测定(1)脯氨酸的提取准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向 各管分别加入5ml3X的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于 十净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。(2)吸取2ml提取液于另.千净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋 酸及2mi酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。(3)冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静 置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。 (4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液 于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波L〈处比色，求得吸光度值。
三、结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上査出)2ml测定液中脯氨酸的含量(Xyg/2ml)，然后计
算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下
脯氨酸含量(Ug/g) 二[XX5/2]/样重(g)。 本实施例的效果如附图5所示。
实施例6:脯氨酸合成、转运相关基因在野生型与tt C7/Yft 基因转基因家系中的表达量检测
脯氨酸含量增加可能是由于脯氨酸合成、转运相关基因的表达量发生了变化，我们用RealUrae-PCR方法 检测了两个脯氨酸合成和两个脯氨酸转运基因在野生型与OsC7P/TOJ基因转基因家系中的表达量。实验结果显 示这四个基因的表达量在0sCIPK03超表达植株中都有不同程度的升高(5—10倍)。实验结果(图6)说明 OsCIPK03的超表达提高了脯氨酸合成与转运相关基闪的表达，引起脯氨酸含量的增加，从而提高了转基因植 株的耐冷性。实验是在ABI7500 Realtime—PCR仪上进行的。反应体系为10 u 1 2X SYBR Green Master Mix Reagent (Applied Biosystems) ， 1.0 ul cDNA模板、200 nM基因特异性引物，总体积20 ul。反应条件 为第'步95°C， 3分钟；第步(40个循环)95°C， 30秒，6(TC, 30秒，72°C， 1分钟。这四个基闪的 GenBank编号分别是:AK102633、 AK101230、 AK067U8、 AK0666298。用于Realtime--PCR检测的引物分别是 AK102633(5'-CTCAMTCMGGCGTCMCTAAGA- 和 5'-TTTGTCAATATATACGTGGCATATACCA-3') ， AK101230 (5'-CGCCCCTCCCCGTATCT-3' 和 5'-AGGAATGCGGCAACAAGTG-3')， AK067118
(5'-AGGGACGATGGAGTTCTAAAGCT-3' 和 5'-GGGATTCCAAAGGCAMAAGA-3') ， AK0666298
(5'-GAGGAGGCTACCTGACTGTCAAC-3'禾口 5'- GCTCATGMGTCGCCAAGGA -3')。水稻的看家基因Actinel (GenBank 编号为 XI6280)用于 PCR 时的内对照，其引物为 5'-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3 和 5' -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3'。 本实施例的效果如附图6所示。
序歹'J 表
<110〉华中农业大学
<120〉利用水稻蛋白激酶基因0sCIPK03提高植物耐冷能力 <130>
<丄41〉 2007-05-31
〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 1707
<212> DNA
<213> 水稻(0ryza sativa) <220〉
<221〉 gene
<222〉 (1). . (1707)
<223〉
<400〉 1
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ccgtcaactataggcgg兆tttgattc170权利要求
1、OsCIPK03基因介导的赋予植物对低温胁迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-1707位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
2、 合适启动子连接的权利要求1所述的DNA序列。
3、 权利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。
4、 权利要求1-3任一项所述的DNA序列在增加水稻对低温胁迫耐受能力中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及耐冷有关的水稻DNA片段OsCIPK03的分离克隆、功能验证及应用。具体步骤是，将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与烟草花叶病毒的组成型启动子(CaM 35S)结合后直接转入水稻，使转基因水稻植株的耐冷能力显著提高。克隆的OsCIPK03基因具有如序列表SEQ ID NO1中第1-1707位所示的DNA序列，或者编码与SEQ ID NO1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
文档编号C12N15/29GK101200724SQ20071005235
公开日2008年6月18日 申请日期2007年6月1日 优先权日2007年6月1日
发明者勇 向, 熊立仲, 黄越敏 申请人:华中农业大学