专利名称：一种氧化葡萄糖杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物转化技术领域，具体涉及一种氧化葡萄糖杆菌突变株CGMCC No.1184，以及该菌种在6-(2-羟乙基)-氨基-6-脱氧-α-L-山梨呋喃糖制备中的应用。
背景技术：
米格列醇作为α-糖苷酶抑制剂类药物之一已被应用于II型糖尿病的治疗。根据文献资料，米格列醇的制备可通过化学全合成或生物转化结合化学合成的手段来实现。其中化学全合成法由于合成路线长、涉及试剂材料繁多、成本高、工艺复杂而难以控制、分离提纯困难等诸多不利因素而使其应用受到极大限制。相比之下，生物技术的引入，使米格列醇的制备从根本上变得现实可行。从已见报道的几条化学合成结合生物转化的制备线路来看，以先从葡萄糖化学合成得到N-(2-羟乙基)-葡萄糖胺(I)、再生物氧化获取关键中间体6-(2-羟乙基)-氨基-6-脱氧-α-L-山梨呋喃糖(II)、最后经氢化还原得到米格列醇(III)的方法最为理想(参见EP 0 477 160 A1)，实用性较强。该制备过程的反应线路如下 I II III转化底物 中间体 终产物(转化产物) (米格列醇)作为以上制备线路的关键中间体，6-(2-羟乙基)-氨基-6-脱氧-α-L-山梨呋喃糖(II)系来自于以N-(2-羟乙基)-葡萄糖胺(I)为底物的生物转化过程，而此步生物转化典型的方案是采用氧化葡萄糖杆菌属的细菌来进行生物催化。
本发明所要解决的技术问题是通过菌种选育手段改善菌种性能，达到优化培养和转化环节的目的，从而比现有技术更好地适应工业生产的需要。
发明内容
本发明公开的突变菌株其亲株系分离自我国江西省井冈山地区土壤的一株野生菌株，属于葡萄糖杆菌属。从亲株出发，通过运用一系列的物理、化学诱变和自然选育等处理手段，得到了一株性状稳定、易培养、转化效率高的突变株。该微生物菌种已于2004年7月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会登记保藏，保藏号CGMCC No.1184，经鉴定该菌种属于一种氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)。
得到本发明的突变菌株CGMCC No.1184的过程涉及的均为微生物菌种选育领域的常规技术，其中包括出发菌株以物理、化学因子交替诱变操作，其中选用了紫外线、亚硝基胍作为诱变剂，再结合原生质体制备再生以及自然分离，在琼脂平板上选择生长较快较好的菌落用于摇瓶初筛进行液体培养考察，即定时对培养液取样测定OD600值的变化情况。生物转化过程的考察含以下步骤完成液体培养后离心培养液，收集沉淀物(菌体)；再以无菌水洗涤一遍后离心收集。在三角摇瓶中配制含底物(I)2％、MgSO40.02M的转化液50ml，高压灭菌后再加入上述湿菌体3％。在28℃摇床上孵育，对转化液定时取样，在甲醇∶氨水(2∶1)的系统中作硅胶薄层层析(TLC)，层析结束将TLC板置150℃烘烤处理，随后观察显色斑点中底物(I)和产物(II)的强度变化。
菌株CGMCC No.1184经鉴定具如下特征1.染色特征革兰氏染色阴性；抗酸染色阴性。
2.形态特征于30℃培养2天后，细胞呈椭圆形到杆状体，大小为0.6-0.8μm×1.5-2.0μm；单个、成对生长，罕见成链生长，偶有略大的不规则细胞状(退化体)出现，两端钝圆，有的端尖，不形成芽孢，无荚膜，无气生菌丝体。
3.培养特征在麦芽汁琼脂和葡萄糖碳酸钙琼脂上生长良好，乳白色到微黄色，菌落圆形，表面有突起，粘稠状。在葡萄糖碳酸钙酵母膏琼脂上生长良好，并溶解碳酸钙。
4.生理生化特征
综合该菌种的各项特征，其被鉴定为氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacteroxydans)。
连续传代、增殖培养考察结果表明，菌株CGMCC No.1184性状稳定，比亲株繁殖能力更强、增殖更快，具体表现在培养开始24小时菌体浓度即可达到峰值(参见附图1)，这样便使培养周期得以缩短。此外，在培养过程中还发现，该菌种在发酵罐中进行液体好氧培养时产生泡沫较少，即便液体繁殖培养基里少加甚至未加化学消泡剂也不易发生逃液现象。这样不仅可减少消泡剂支出，还可以进一步避免消泡剂给菌体带来的潜在毒害作用，有利于菌体以及其中所含的酶系在后续转化反应系统中更好地发挥其生物转化功能。事实上，培养繁殖后收获的菌体被用于生物转化步骤时确实显示了转化反应效率的改善，具体表现为经48小时就可完成整个转化反应过程，基本上实现底物的完全转化。由此反映出针对出发菌株所进行的一系列菌株选育工作获得了有益的效果，在现有技术基础上明显缩短了菌体培养时间和转化反应时间，同时菌体在发酵罐培养过程中产生泡沫也明显减少。
构成CGMCC No.1184菌种液体繁殖培养基的组分可选自于葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、复合氨基酸和磷酸盐等，其中碳源含量4％-7％，氮源含量1.5％-3.5％，pH6.0-6.8。该菌株的培养过程条件温和易控，菌体繁殖旺盛，在28℃环境培养24小时即可达到菌浓度峰值，而且在发酵罐中进行液体培养时因产生泡沫较少故可以减少使用甚至不用化学消泡剂；收获的菌体用于后续生物转化中转化周期也较短，48小时就可结束转化反应。
图1CGMCC No.1184菌种在液体培养基中的生长曲线。其中以OD600值反映菌体相对浓度。
具体实施例方式
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。其中，百分比为重量与体积之比，除非另有说明外。
实施例1菌种的自然分离和NTG诱变处理培养基斜面/平板培养基葡萄糖10.0％，酵母膏1.0％，CaCO32.0％，琼脂2.4％，pH6.8。此培养基用于出发菌株的培养、菌种的自然分离、菌种常规传代等目的。
自然分离取菌种的新鲜斜面一支加入少量无菌水，轻轻刮下菌苔倒入装有无菌玻璃珠和无菌水的三角瓶中，充分振摇10分钟，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，得到菌悬液。菌悬液梯度稀释后涂布于平板培养基上，于28℃培养到长出单菌落。
NTG诱变以灭过菌的磷酸缓冲液替代上述的无菌水，按以上自然分离的方法，在菌悬液系统中加入NTG于28℃摇床上培养处理30秒-10分钟，取样梯度稀释涂布于平板培养基上，28℃培养。
自然分离或诱变处理后，在长成的菌落中选择出现得较早或长得较大较丰满者进行进一步的选育，或者进入摇瓶初筛。
实施例2培养基斜面培养基同实施例1液体培养基D-山梨醇4.5％，葡萄糖2.0％，牛肉浸膏1.5％，酵母粉1.5％，KH2PO42.4％，pH 6.5菌种斜面于28℃培养成熟后，挖块接种到含液体培养基的摇瓶中于28℃进行液体繁殖培养，以测定培养液的OD600值来反映菌种的繁殖状况。
实施例3按实施例2程序培养好的菌液作为种子液，接种于100L发酵罐(罐内培养液配方D-山梨醇5.0％，葡萄糖0.5％，酵母浸膏2.4％，KH2PO43.0％，pH6.0)。控制温度28℃、通气量1∶1-1.5，搅拌转速300rpm。培养24小时离心收集菌体。
实施例4在三角摇瓶中配制含底物(I)2％、MgSO40.02M的转化液50ml，高压灭菌后再加入实施例3中所述的湿菌体(经无菌水洗涤后再次离心收集)3％。在28℃摇床上孵育，对转化液取样，在甲醇∶氨水(2∶1)的系统中作硅胶薄层层析(TLC)。层析结束将TLC板置150℃烘烤处理，观察显色斑点中底物(I)和产物(II)的强度变化。结果如下
权利要求
1.一种氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No.1184。
2.权利要求1所述氧化葡萄糖杆菌CGMCC No.1184在6-(2-羟乙基)-氨基-6-脱氧-α-L-山梨呋喃糖制备中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种氧化葡萄糖杆菌突变株CGMCCNo.1184及其在微生物转化制备6－(2－羟乙基)－氨基－6－脱氧－α－L－山梨呋喃糖中的应用。该菌株具有性状稳定、培养条件温和易控、繁殖较快、转化时间短等优点。
文档编号C12P19/26GK1916158SQ20051002882
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月16日 优先权日2005年8月16日
发明者陈代杰, 戈梅, 李治川, 陶正利, 陈泉 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司, 浙江医药股份有限公司新昌制药厂