专利名称：一种组成型毕赤酵母菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程菌和微生物发酵领域，具体地说，是关于一种表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母菌株及其构建方法。
背景技术：
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAO，EC 1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类，它催化D型氨基酸氧化脱氨反应，生成相应的酮酸和氨，并伴随着一分子氧还原，而释放出过氧化氢。在两步酶法生产7-氨基酸头孢烷酸(7-ACA)工艺中，DAO用于转化头孢菌素C(CPC)的第一步反应。
巴斯德毕赤酵母已经成为一种主要的真核微生物表达系统(Cregg JM.，Vedvick TS.，Raschke WC.Bio/Technology.11905-910，1993)。毕赤酵母可以高密度发酵，毕赤酵母表达系统中整合质粒常用的启动子是醇氧化酶启动子(Alcohol oxidasel promoter，PAOX1)和三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，PGAP)。
甲醇诱导型毕赤酵母菌能够表达三角酵母来源的DAO(Yu J，Yang S，Yuan ZY.J.Mol.Catal B-Enzym.18291-297，2002)，但是，诱导型毕赤酵母菌在发酵过程中需要添加甲醇诱导，且诱导过程的条件控制比较复杂，此外，发酵时间相对也比较长，酶活力达到最高点通常需要40小时左右。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有表达D-氨基酸氧化酶(DAO)的甲醇诱导型毕赤酵母菌的上述缺点和不足，从而提供一种表达DAO的组成型毕赤酵母基因工程菌株。
本发明的另一个目的在于提供一种上述表达DAO的组成型毕赤酵母表达菌株的构建方法。
本发明的表达DAO的组成型毕赤酵母表达菌株转化有重组质粒pMMZY03，该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子，并含有D-氨基酸氧化酶基因、组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素基因。
本发明的组成型毕赤酵母重组菌株的构建方法包括以下步骤A、酶切质粒质粒pPIC3.5k，回收含有卡那霉素基因和组氨醇脱氢酶基因的片段；酶切质粒pGAPZA，回收含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因的片段；连接酶连接上述两片段得到重组质粒pPICGAP；B、重组质粒pPICGAP酶切线性化后与带有组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO)片段用T4连接酶相连接，得到重组质粒pMMZY03；C、将重组质粒pMMZY03电击转化入毕赤酵母宿主菌中，构建成表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株。
与现有技术中已知的DAO生产菌株相比，本发明的带组氨酸纯化标签的重组DAO的表达菌株达到相同发酵单位所需的发酵时间大为缩短(约为1/3)，并且不需要甲醇诱导。因此在生产中具有非常明显的优势，例如时间短、能耗低、发酵过程控制相对简单等。
新构建的整合载体启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因。与商品化的相同类型载体相比较，载体中含有组氨醇脱氢酶基因(HIS4)，同时避免了高价格抗生素Zeocin使用。
图1为在组成型毕赤酵母中表达重组三角酵母DAO的整合质粒pMMZY03的构建流程图。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
以下实施例中，DNA片段连接、质粒的制备，化学转化导入宿主菌，克隆均参照《分子克隆》(Sambrook，J.，Fritsch，E.P.，Maniatis，T.(2001)“Molecular CloningA LaboratoryManual 3rd ed，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本发明所构建的表达DAO的组成型巴斯德毕赤酵母菌株MMZY03已于2005年8月9日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 205088。
实施例1、质粒构建1、材料质粒pPIC3.5kInvitrogen公司产品，大小为9.0kb，含有卡那霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，组氨醇脱氢酶基因，启动子是醇氧化酶基因，并具有多个限制性酶切位点。
质粒pGAPZAInvitrogen公司产品，大小为2.9kb，含有Zeocin抗性基因，启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因，并具有多个限制性酶切位点。
质粒pLHB-3按照Liu HB等(Liu HB.，Jiang WH.，Yang YL.Cloning，Sequencing andExpression of D-amino acid oxidase gene.Chinese Journal of Biotechnology 15337-342，1999)的方法构建，大小为6.4kb，含有带组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO)，卡那霉素抗性基因，启动子是T7lac。
2、方法如图1所示，质粒pPIC3.5k用EcoRI单酶切，再用BglII部分酶切，割胶回收大小约8.0kb的基因片段，该片段含有卡那霉素基因和组氨醇脱氢酶基因；质粒pGAPZA用EcoRI和BglII双酶切后胶回收约0.5kb的基因片段，该片段含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因；T4连接酶连接上述两片段得到重组质粒pPICGAP，该重组质粒启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因，含有组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素抗性基因。
质粒pPICGAP用EcoRI线性化后再用Klenow补平，胶回收得到约8.5kb大小的片段；质粒pLHB-3用NcoI和HindIII双酶切后再用Klenow补平，得到约1.2kb的HDAO基因片段；T4连接酶连接两个基因片段，得到重组质粒pMMZY03，该重组质粒启动子是三磷酸甘油醛脱氢酶基因，含有重组D-氨基酸氧化酶基因，组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素抗性基因。
实施例2、质粒扩增质粒pMMZY03采用常规的化学转化法《参考分子克隆》转化至至大肠杆菌宿主菌DH5α(Takara)，挑取单个转化子接种到LB液体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠)中，在37℃培养扩增pMMZY03质粒。
实施例3、质粒转化参考《分子克隆》，采用碱裂解法从实施例2的大肠杆菌抽提扩增的质粒pMMZY03，抽提的质粒选用BspEI单酶切线性化，乙醇沉淀回收线性化质粒约10μg，与毕赤酵母宿主菌GS115(his-mut+)感受态细胞80μl混合后转入电转化杯中，冰浴中放置5min，同时准备一份不添加线性化质粒pMMZY03的感受态细胞作为阴性对照。采用Bio-Rad电转化仪器，电转化参数设置是1.5KV、25μF、200Ω，电击时间4.6ms，电击转化后立即加入1ml冰浴的山梨醇。电击转化产物涂在MD平板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，2％琼脂糖)上，放置28℃培养，2-3天后MD平板上长出转化子。
实施例4、转化子筛选从MD平板上挑取10个转化子接种至YPD培养基(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖)中，培养温度为30℃，摇床转速为280rpm，培养至24h时取样测定DAO活力。
一个酶活力单位(U)的DAO定义37℃，pH8.5条件下，每分钟氧化脱氨生成1μmol酮酸所需的酶量。
采用比色法测定DAO活力(Nilsson.K.，Mosbach.K.，Appl.Biochem.Biotechnol.，6293-308，1981)，具体如下待测样品中加入用0.1mol/L、pH8.0的焦磷酸钠缓冲液配制的50mmol/L DL-甲硫氨酸溶液，在37℃浴中振荡反应30min，加入10％的三氯乙酸终止反应。将终止液稀释10倍后加入0.2％的2，4-二硝基苯肼饱和溶液，混匀静置10min。加入3mol/L的NaOH溶液，混匀后静置15min，离心后测定A550值。
按照上述方法测定10个转化子在24h的DAO活力，结果如下表1所示表1、DAO活力测定
通过上述测定DAO活力的方法筛选出DAO表达最高的重组菌株，命名为MMZY03。该菌株并已于2005年8月9日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 205088。
实施例5、表达DAO活力的比较以本发明的组成型重组毕赤酵母菌株MMZY03与诱导型重组毕赤酵母菌株在同等条件下进行表达DAO活力的比较，发酵采用YPD培养基(同实施例4)，接种量为5％，发酵温度为30℃，溶氧维持在30％左右，发酵过程中用氨水调节pH6.0，从接种时刻算起，每隔1小时取样测定DAO活力，结果如表2所示
表2、表达DAO活力比较
由以上表2的结果可见，本发明的组成型重组毕赤酵母菌株MMZY03(组成型)从接种时间起约13h时发酵单位达到最高，约为6321U/L，相比之下，现有技术中使用的诱导型重组毕赤酵母中DAO发酵单位达到最高需要约40h，所用时间约为本发明的菌株的3倍。可见以本发明的组成型毕赤酵母重组菌株表达D-氨基酸氧化酶，不但可以避免发酵过程中甲醇诱导的难控制因素，而且酶活力达到最高点仅需约13h左右，约为现有甲醇诱导型菌株的1/3，从而大大缩短了发酵时间，减少了能耗，进而降低了生产成本。
权利要求
1.一种表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述菌株转化有重组质粒pMMZY03，该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子，并含有D-氨基酸氧化酶基因、组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素基因。
2.如权利要求1所述的组成型毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述重组质粒pMMZY03还具有组氨酸标签。
3.如权利要求1所述的组成型毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述菌株的保藏号CCTCC M 205088。
4.一种组成型毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤A、酶切质粒pPIC3.5k，回收含有卡那霉素基因和组氨醇脱氢酶基因的片段；酶切质粒pGAPZA，回收含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因的片段；连接酶连接上述两片段得到重组质粒pPICGAP；B、重组质粒pPICGAP酶切线性化后用连接酶与带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶基因片段相连接，得到重组质粒pMMZY03；C、将重组质粒pMMZY03电击转化入毕赤酵母宿主菌中，构建成表达D-氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A和B中所使用的连接酶为T4连接酶。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B中所述线性化的重组质粒pPICGAP以及带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶基因片段在用连接酶连接前先以Klenow补平。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在将重组质粒pMMZY03电击转化入毕赤酵母宿主菌前还包括将重组质粒pMMZY03导入大肠杆菌进行扩增的步骤。
8.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子，并含有D-氨基酸氧化酶基因、组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素基因。
9.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒带有组氨酸标签。
全文摘要
本发明公开了一种表达D－氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株，该菌株转化有重组质粒pMMZY03，该重组质粒以三磷酸甘油醛脱氢酶基因为启动子，并含有D－氨基酸氧化酶基因，组氨醇脱氢酶基因和卡那霉素抗性基因。本发明还公开了所述表达D－氨基酸氧化酶的组成型毕赤酵母重组菌株的构建方法。与现有已知的D－氨基酸氧化酶生产菌株相比较，本发明的菌株具有生产时间缩短的优势，且避免了发酵过程中甲醇诱导的难控制因素。
文档编号C12N15/53GK1737112SQ20051002875
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者杨晟, 郑华宝, 陈军, 杨蕴刘, 姜卫红 申请人:中国科学院上海生命科学研究院