产生粗糙型菌株的方法及其用途的制作方法

专利名称：产生粗糙型菌株的方法及其用途的制作方法
专利说明产生粗糙型菌株的方法及其用途 发明领域 本发明涉及细菌的粗糙型菌株，例如来自分枝杆菌属(genusMycobacterium)的粗糙型菌株。本发明特别涉及获得细菌粗糙型菌株的方法。本发明进一步涉及一种新颖的奥布分枝杆菌(Mycobacterium obuense)的粗糙型菌株及其用途。

背景技术：
本领域已知的获得细菌粗糙型菌株例如来自分枝杆菌属的粗糙型菌株的方法，包括平板接种(plate out)细菌，例如来自分枝杆菌属的细菌，和寻找任何粗糙型菌落。然而，以这种方法鉴定的任何粗糙型菌株通常不稳定。
其他方法包括在含有吐温或甘油的培养基中平板接种分枝杆菌，并激发菌膜生长。这种方法对于某些种类的分枝杆菌粗糙型菌株的诱导是成功的。然而，这种方法尚不能诱导所有的分枝杆菌粗糙型变体。
至今没有方法能够诱导奥布分枝杆菌的粗糙型菌株。
因此，需要一种能够产生分枝杆菌粗糙型菌株，特别是稳定的粗糙型菌株的改进方法。这样的方法能够很好地(advantageously)用于首次产生分枝杆菌属的某些菌种例如奥布分枝杆菌的粗糙型菌株。
本发明很好地提供了这样一种改进方法，首次诱导了奥布分枝杆菌的粗糙型菌株，特别是稳定的粗糙型菌株。
生长迅速的分枝杆菌粗糙型菌株具有许多优点: -稳定的粗糙型菌株不会回复成光滑型菌株； -粗糙型菌株与光滑型菌株相比具有不同的抗原呈递，并趋向于具有更低的致病毒性； -由粗糙型菌株制备的皮肤测试试剂比由光滑型菌株制备的更有效； -粗糙型菌株在体外细胞介导免疫试验中使用时非常有效；并且 -一些杆菌(bacilli)的小菌落(small clump)或颗粒可能比光滑型菌株的单生物更有效地激发吞噬细胞。
此外，本发明有益地发现了奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞可以用于调节受试者的免疫应答。
尽管已知母牛分枝杆菌(M.vaccae)可以调节受试者的免疫应答，但是将奥布分枝杆菌作为免疫调节剂使用的适用性此前从未考虑过。
疫苗和其他免疫调节剂对于减少疾病的发病率和死亡率具有重大意义。由大部分现有疫苗引发的首次免疫似乎由体液免疫应答介导。对于可能需要细胞免疫应答的疾病，例如结核病和利什曼病，目前没有统一有效的可用疫苗。
疫苗中通常加有佐剂。佐剂的作用是增强机体对于疫苗中特殊抗原的免疫应答。常用的佐剂通常产生体液免疫应答而非细胞介导免疫应答。此外，比方说铝佐剂，可造成消极副作用，例如无菌脓肿、红斑、肿胀、皮下结节、肉芽肿性炎症和接触性超敏反应。
现正寻找这样的一种疫苗或其他免疫调节剂，其可以修饰细胞免疫应答并且尤其是T辅助细胞应答，例如T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)应答。
有许多种不同的自身免疫性疾病，并且它们各自能以不同的方式影响机体。很多自身免疫性疾病都是罕见的。然而，自身免疫性疾病作为一组疾病折磨着数百万民众。
一些自身免疫性疾病已知是由特定的诱发物例如病毒感染、寄生性感染或慢性细菌感染引发或恶化的。影响免疫系统和自身免疫性疾病过程的其它知之甚少的作用包括老化、慢性应激、激素和妊娠。
自身免疫性疾病通常是慢性的，需要终身的护理和监测，即使是在病人可能看上去或感觉良好时。目前，几乎没有自身免疫性疾病可以用治疗来治愈或者使其开始缓解。
医生通常帮助病人控制由自身免疫性疾病导致的炎症后果。对于某些人，有限数量的免疫抑制药可以导致疾病缓解。然而，即使他们的疾病缓解了，病人很少能够中断施用。免疫抑制药的长期副作用可能是可观的(substantial)。
血管损伤的发生和发展是一个复杂的、多因素的过程，但越来越多的证据表明炎症应答起关键作用。血管损伤参与了动脉粥样硬化的发展和导致急性缺血综合症例如心肌梗塞、中风和外周动脉阻塞的血栓形成过程。
免疫机理可以在动脉粥样硬化和肌内膜增生(myointimal hyperplasia；MIH)的发展和维持中起重要作用。
肌内膜增生(MIH)可以认为是一种对于损伤的过度愈合反应，所述损伤例如球囊血管成形术(balloon angioplasty)。一连串的事件导致了:基底膜的缺损，血管平滑肌细胞(VSMC)从基质(media)迁移至内膜中，VSMC的增殖和向更加分泌型成纤维细胞类型的表型转化，以及细胞外基质的产量增加，其最终导致血管的狭窄或阻塞。它发生在旁路移植术和球囊血管成形术之后，并影响了临床实践中约30％这样的病例。它是该方法失败的主要原因，对所产生的血管/移植物的狭窄或阻塞的治疗也存在问题。造成MIH的根本细胞机制还不太清楚，而且至今没有发展出能够有效预防它的疗法。本专利的临床意义涉及每年在英国和全球实施的非常大量的冠状动脉血管成形术。虽然目前药物洗脱支架产生了良好(promising)的结果，但它们不太可能完全防止血管再狭窄(restenosis)。任何安全的、相对廉价的辅助治疗，例如本专利提出的免疫疗法，都将产生重大的临床意义。
针对再狭窄的免疫疗法中涉及的机制是复杂且不完全清楚的。由血管成形术造成的内皮损伤可以因宿主对hsp’s的免疫应答而加重。Hsp’s是应激细胞(stressed cell)产生的蛋白质，该蛋白显示与包含动脉粥样硬化在内的多种免疫病症发病机制和病理生理学相关(Xu Q et al.Arterioscler Thromb 1992；12:789-799)。它们很有可能存在于血管成形术区域中的内皮细胞和平滑肌细胞。Hsp在功能上作为一种自身抗原而可能受到免疫系统的攻击。这种情况可以以实验诱导，即通过用导致兔和小鼠内皮损伤的交叉反应分枝杆菌hsp(hsp65)来进行免疫(Xu Q，et al.Arterioscler Thromb 1992；12:789-799 and George J，etal.Circ.Res.2000；86:1203-1210)。该作用似乎依赖于Th2淋巴细胞分泌的IL-4，并可能由抗体介导(George J，et al.Circ.Res.2000；86:1203-1210和Schett G，et al.J.Clin.Invest.1995；96:2569-2577)。这些观察到的现象与人类的相关性是通过hsp65柱洗脱出的亲和纯化人抗体能够在体外损害人类内皮细胞来揭示的。该发现显示，抗体与作为hsp65的人类同源物(homologue)的hsp60交叉反应，当hsp60表达于应激内皮细胞膜上时，使抗体可以接近。经显示，这些抗体与应激内皮细胞的结合可能是心脏移植后产生冠状动脉疾病的因素(Crisp SJ et al.J Heart Lung Transplant 1994；81-91)。Mukherjee等(Thromb Haemost 1996；75:258-60)揭示，手术前的hsp65抗体水平与冠状动脉再狭窄没有关联，但确实揭示了血管成形术后该抗体水平下降的病人发生血管再狭窄的可能性更低。事实上hsp抗体的作用可以是复杂的，因为患有血管疾病的病人不仅具有增高的抗体水平，其hsp自身水平也是增高的(WrightBH，et al Heart Vessels 2000；15:18-22)。因此抗体水平的显著下降可能仅仅反映了蛋白水平的增长。此外，hsp具有调节功效，并与动脉平滑肌细胞结合，导致存活率的提高而不需要内化(Johnson AD et al.Atherosclerosis 1990；84:111-119)。
WO2004/022093和UK申请第0404102.6号(两者均通过引用结合到本文中)公开了一种免疫调节剂组合物或者一种药物组合物，其包括源自红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、冢村氏菌属(Tsukamurella)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)的细菌的全细胞。
此外，US申请第10/893,524号(通过引用结合到本文中)公开了利用源自红球菌属、戈登氏菌属、诺卡氏菌属、迪茨氏菌属、冢村氏菌属和类诺卡氏菌属(Nocardioides)的细菌的全细胞来制备药物，所述药物用于治疗或防止断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)和/或猪皮炎和肾病综合征(PDNS)。
然而，这些文献无一教导或提出利用奥布分枝杆菌的粗糙型菌株的全细胞，优选稳定粗糙型菌株的全细胞，来调节细胞免疫应答。
发明概述 本发明由以下惊人发现而预测，即细菌的粗糙型菌株，例如分枝杆菌属的细菌的粗糙型菌株，可以通过暴露于(expose to)砜和/或磺胺(sulfonamide)而诱导。
免疫系统自诞生至死亡都在通过接触环境而经受训练、持续性地被刺激以及调节。现代城市化和用以预防传染病的公共卫生措施已切实地减少了这种暴露，导致了前所未有的疾病增长，例如过敏和肿瘤性疾病。通过利用无害的有益环境细菌的已灭菌悬浮液(killed suspension)来恢复环境中的有益影响，可以恢复免疫系统的正常平衡状态，因而在疾病治疗中和/或在建立(promote)健康的免疫系统中起到治疗性和/或预防性的作用。
因此，除了诱导细菌(例如分枝杆菌属，例如奥布分枝杆菌)粗糙型菌株的方法之外或者作为其替代方法，本发明的预测是基于以下惊人发现，即以奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞对受试者施用，对于引发对免疫系统的修饰尤其有效，特别是该受试者的细胞免疫系统。
“细胞免疫系统”用于此处，包括了依赖于T淋巴细胞存在的细胞介导免疫应答。术语“T淋巴细胞”包括细胞毒性T淋巴细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和调节性T细胞。例如，对细胞介导免疫应答的修饰可以用于克服细胞介导的免疫病症，包括例如免疫系统失衡(immune system imbalance)和免疫过敏性(immune hypersensitivity)。
术语“调节”、“修饰”及其他它们的衍生词用于此处，指的是下调、抑制、诱导、刺激、上调、改变或以其它方式影响细胞免疫系统的一种或多种成分。
本发明的预测是基于以下惊人发现，即对受试者施用的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞对引发对免疫系统的修饰尤其有效，特别是对该受试者的细胞免疫系统的修饰，它对于自身免疫疾病或自身免疫病症产生了预防和/或治疗的效果，尤其是例如那些包括了血管内膜炎症的疾病。
利用包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞的组合物来有效治疗和/或预防自身免疫疾病和自身免疫病症，尤其是例如那些包括了血管内膜炎症的疾病的一个优点，可以是这种治疗和/或预防方法在有效的同时，与现在常规使用的化疗即免疫抑制药疗法相比产生较少的长期副作用。
发明详述 一方面，本发明涉及产生细菌粗糙型菌株的方法，所述方法包括将所述细菌暴露于砜和/或磺胺。
适当地，在根据本发明产生细菌粗糙型菌株的方法中可以分离粗糙型菌株。
优选地，在根据本发明产生细菌粗糙型菌株的方法中，将细菌在培养基中培养，砜和/或磺胺的浓度为每1ml培养基大于等于5μg砜和/或磺胺。
适当地，在根据本发明产生细菌粗糙型菌株的方法中，所述细菌可以来自分枝杆菌属。优选地来自奥布分枝杆菌。
另一方面，本发明涉及通过本发明所述方法可以产生的，优选产生出的分枝杆菌属细菌粗糙型菌株。
另一方面，本发明涉及通过本发明所述方法可以产生的，优选产生出的奥布分枝杆菌粗糙型菌株。
另一方面，本发明涉及的奥布分枝杆菌粗糙型菌株，由BioEos Limited of67 Lakers Rise，Woodmansterne，Surrey，SM7 3L按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》(Budapest Treaty on the International Recognitionof the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Procedure)在国立典型培养物保藏中心(National Collection of Type Cultures(NCTC))的中央公众健康实验室(Central Public Health Laboratory，(61 Colindale Avenue，London，NW9 5HT))，以保藏号NCTC13365于2005年7月14号保藏。
一方面，本发明提供免疫调节剂组合物，其包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞。
术语“免疫调节剂”用于此处，表示一种调节个体细胞免疫系统的物质。
术语“全细胞”用于此处，表示完整的或基本完整的细菌。术语“完整的”用于此处，特别表示含有全细胞中存在的所有组分的细菌，尤其是一个完整的活细胞，和/或没有经过特意处理而从中将一个或多个组分去除的细菌。术语“基本完整的”用于此处表示，尽管获得该细菌所用的分离和/或纯化方法有可能导致比方说对细胞的细微修饰和/或细胞一个或多个组分的去除，这样的修饰和/或去除发生的程度是无关重要的。特别地，本发明所述的基本完整的细胞没有经过特意处理而将一个或多个组分从中去除。
在本发明之前，未曾设想过利用奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞来调节细胞免疫应答。令人惊讶的是，发现通过利用奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞，可以实现对细胞免疫系统的调节。通过所述粗糙型菌株的所述全细胞的施用而引起的对细胞免疫应答的调节，比细菌单一组分施用引起的应答更为有利持久。
优选地，本发明的组合物包含不止一个全细胞，并且优选地包含多个全细胞。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞的免疫调节剂组合物，该免疫调节剂组合物在使用中修饰细胞免疫应答。
另一方面，本发明提供了包含抗原和佐剂的免疫调节剂组合物，其中所述佐剂包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞以及任选的可药用的载体、稀释剂或赋形剂，该免疫调节剂组合物在使用中修饰细胞免疫应答。
本发明还进一步提供了本发明药物组合物的制备方法，所述方法包括将本发明的一种或多种化合物与可药用的载体、稀释剂或赋形剂混合。
另一方面，本发明提供了免疫调节剂组合物和/或药物组合物，其包括奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞和至少一种抗原或抗原决定簇。
适当地，该抗原或抗原决定簇可以为来自以下中的一种或多种的抗原或抗原决定簇:BCG(卡介苗)疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳(DTP或三联)疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、OPV(口服脊髓灰质炎疫苗)、母牛分枝杆菌或其中一部分(如GB0025694.1所教导)以及一般的疟原虫抗原(generic plasmodium antigen)，例如疟疾寄生物抗原(malaria parasite antigen)。
适当地，该免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以包含两种或更多种这样的抗原或抗原决定簇。
另一方面，本发明提供了包含抗原或抗原决定簇以及佐剂的免疫调节剂组合物，其中所述抗原或抗原决定簇包括了奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞。
当细菌的全细胞作为抗原或抗原决定簇发挥作用时，该组合物可以适当地包括至少一种，优选至少两种，更优选至少三种的其它抗原或抗原决定簇。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或者药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防以下的一种或多种:感染(例如细菌、病毒，比方说乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤(equine sarcoid)、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常，或者寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属(Eimeria species)感染和弓形虫病)和/或伴随有感染的免疫异常；自身免疫疾病(例如以闭塞性血管病为例的血管病症，和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(atheroma formation)(在它处也称为动脉硬化)的免疫方式(immunologicalaspects)，关节炎和移植物排斥反应)；应激(例如严重创伤应激(major traumastress)、心理社会应激和慢性应激)；过敏(例如包含过敏性哮喘在内的哮喘、花粉症(hayfever)、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺(stings)-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(Culicoides)(能引起马类的甜痒病(Sweet Itch))为例的蠓引起的过敏)；马气喘病(heaves)；COPD；PMWS；PDNS；SIPH；癌症(例如黑素瘤或腺癌)；免疫系统失衡(例如儿童和大龄者(elderly)的免疫系统失衡)；以及术后应激和感染。大龄者的免疫系统失衡可以认为是免疫衰老。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防一种或多种病毒感染，例如由乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常。
一方面，本发明提供了免疫调节剂组合物和/或药物组合物，其包含了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞和至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇为牛乳头瘤病毒的病毒抗原。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属感染和弓形虫病中的一种或多种。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防以下中的一种或多种:自身免疫疾病、以闭塞性血管病为例的血管病症，和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)的免疫方式，关节炎和移植物排斥反应。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防一种或多种应激，例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激和/或术后应激(包括与被施用麻醉剂相关的应激)。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防以下中的一种或多种:哮喘(包括过敏性哮喘)、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏。
优选地，利用包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，制造药物用以治疗或预防包括过敏性哮喘在内的哮喘，和被昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防一种或多种马气喘病和/或COPD，尤其是在马中。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防一种或多种PMWS和/或PDNS。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防应激诱导性肺出血(stress-induced pulmonary haemorrhage；SIPH)，优选运动诱发性肺出血(exercise-induced pulmonary haemorrhage；EIPH)。
本发明进一步提供包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防黑素瘤和/或腺癌。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防大龄者的免疫系统失衡。根据本发明这个方面的免疫调节剂组合物或药物组合物通常来说可以是免疫增强剂。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以增强免疫系统，例如其可以导致对生长的促进或者提高饲料的利用效率。根据本发明这个方面的免疫调节剂组合物或药物组合物通常来说可以是免疫增强剂。本发明的免疫调节剂组合物或药物组合物可以有利地用于替代目前使用的促进家禽生长的抗生素。适当地，本发明的免疫调节剂组合物可以单独使用或与其他治疗方法结合使用。术语“家畜”用于此处指的是任何饲养的动物(farmedanimal)。优选地，家畜为马、家禽、猪(包括仔猪(piglet))、绵羊(包括羔羊)、母牛(cow)或公牛(包括犊牛(calves))中的一种或多种。更优选地，家畜表示猪-包括仔猪。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防儿童的免疫系统失衡。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以治疗或预防对儿童期疫苗接种(childhood vaccine)的不良反应-例如百日咳疫苗接种和目前的MMR疫苗接种-和/或它们产生的后果。术语“不良反应”用于此处，表示由其疫苗或施用导致或初始引发(primed)的局部或全身不利的反应，它通常发生在很短的时间范围内，但其也可以推迟(例如推迟6个月)。“不良反应”可以包括儿童的死亡。不良反应可以为其他独立事件导致的后果，对该事件的应答由疫苗或其施用从负面引发(negatively primed)。
本发明进一步提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用以修饰细胞免疫应答。
另一方面，本发明提供了用于药物用途的包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物。
另一方面，本发明提供了在疫苗中使用或作为疫苗使用的包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物。
适当地，该疫苗可以为预防疫苗或治疗疫苗。
另一方面，本发明提供了作为免疫增强剂使用的包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或者药物组合物，其用于治疗或预防以下中的一种或多种:感染(例如细菌、病毒，比方说乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常，或者寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属感染和弓形虫病)和/或伴随有感染的免疫功能异常；自身免疫疾病(例如以闭塞性血管病为例的血管病症，和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)的免疫方式，关节炎和移植物排斥反应)；应激(例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激)；过敏(例如包含过敏性哮喘在内的哮喘、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏)；马气喘病；COPD；PMWS；PDNS；SIPH和癌症(例如黑素瘤或腺癌或以宫颈癌为例的病毒相关的癌症)；免疫系统失衡(例如儿童和大龄者的免疫系统失衡)；以及术后应激和术后感染。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防一种或多种寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽的艾美球虫属感和弓形虫病中的一种或多种。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防病毒感染，例如由乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防以下中的一种或多种:自身免疫疾病、以闭塞性血管病为例的血管病症、和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)的免疫方式、关节炎和移植物排斥反应。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株全细胞菌体的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防应激，例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激和/或术后应激中的一种或多种。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防以下中的一种或多种:哮喘(包括过敏性哮喘)、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏。优选地，所述包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物是用以治疗或预防包括过敏性哮喘在内的哮喘，和被昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防一种或多种的马气喘病和/或COPD，尤其是在马中。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防一种或多种的PMWS和/或PDNS，尤其是在猪中。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防SIPH，尤其是在鱼(例如锦鲤(koi))和/或竞赛类动物(racing animal)(例如马、骆驼、灰狗和人类)中。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防癌症(例如黑素瘤和/或腺癌和/或以宫颈癌为例的病毒性相关的癌症)。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防大龄者的免疫系统失衡，尤其是免疫衰老。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防术后感染。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以增强免疫系统，例如其可以导致对生长的促进或者提高例如家畜中的饲料利用率。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防儿童的免疫系统失衡。
另一方面，本发明提供了包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物，其用以治疗或预防对儿童期疫苗接种的不良反应-例如百日咳疫苗接种和目前的MMR疫苗接种-和/或它们产生的后果。
另一方面，本发明提供了奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞在疫苗或药物中的用途，其中所述细菌全细胞修饰细胞免疫应答。
一方面，本发明的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞可以下调Th2应答。
另一方面，本发明的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞可以上调Th1应答。
适当地，本发明的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞可以下调Th2应答和上调Th1应答。
或者，本发明的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞可以在上调Th1应答的同时不影响Th2应答。
或者，本发明的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞可以在下调Th2应答的同时，同样下调Th1应答。
或者，本发明的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞可以在上调Th2应答的同时，同样上调Th1应答。
另一方面，本发明提供了治疗或预防受试者中病症的方法，包括向受试者施用有效量的药物组合物和/或免疫调节剂组合物，其中所述组合物调节细胞免疫应答。
适当地，可将所述有效量的药物组合物和/或免疫调节剂组合物作为单剂量施用。或者，可将所述有效量的药物组合物和/或免疫调节剂组合物作为多次(重复)剂量施用，例如两次或更多次，三次或更多次，四次或更多次，五次或更多次，十次或更多次，或者二十次或更多次的重复施用。
另一方面，本发明提供对受试者进行免疫的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的药物组合物和/或免疫调节剂组合物。
在本发明的另一方面，提供了包括免疫在内的保护受试者方法，包括向受试者施用有效量的本发明的药物组合物和/或免疫调节剂组合物。
优选地，针对以下中的一种或多种对受试者进行保护，例如进行免疫:感染(例如细菌、病毒，比方说乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常，或者寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属感染和弓形虫病)和/或伴随有感染的免疫功能异常；自身免疫疾病(例如以闭塞性血管病为例的血管病症，和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)的免疫方式，关节炎和移植物排斥反应)；应激(例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激)；过敏(例如包含过敏性哮喘在内的哮喘、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏)；马气喘病；COPD；PMWS；PDNS；癌症(例如黑素瘤或腺癌或以宫颈癌为例的病毒性相关癌症)；免疫系统失衡(例如儿童和大龄者的免疫系统失衡)；以及术后应激和术后感染。
优选地，针对以下中的一种或多种对受试者进行免疫:疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属感染和弓形虫病。
优选地，针对病毒感染，例如针对乳头瘤病毒引起的感染，包括针对马肉样瘤、生殖器疣或发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常对受试者进行免疫。
优选地，针对以下中的一种或多种对受试者进行免疫:自身免疫疾病、以闭塞性血管病为例的血管病症和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)的免疫方式，关节炎和移植物排斥反应。
优选地，针对应激，例如一种或多种严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激和/或术后应激对受试者进行保护。
优选地，针对以下中的一种或多种对受试者进行保护(包括免疫):哮喘(包含过敏性哮喘)、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏。更优选地，针对例如包含过敏性哮喘在内的哮喘，和被昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏对受试者进行免疫。
优选地，针对一种或多种的COPD和/或马气喘病对受试者进行保护(包括免疫)，尤其当受试者为马时。
优选地，针对一种或多种的PMWS和/或PDNS对受试者进行保护(包括免疫)，尤其当受试者为猪时。
优选地，针对SIPH对受试者进行保护(包括免疫)，尤其当个体为鱼(例如锦鲤)时，包括针对EIPH，尤其其中所述受试者为竞赛类动物(例如人类、马、骆驼或灰狗)。
优选地，针对术后应激和感染对受试者进行保护(包括免疫)。
优选地，针对癌症的发生和/或发展，例如黑素瘤和/或腺癌和/或以宫颈癌为例的病毒性相关的癌症对受试者进行保护。
优选地，针对大龄者的免疫系统失衡对受试者进行保护(包括免疫)。尤其是可以利用本发明的组合物调节受试者的免疫系统。
优选地，针对儿童的免疫系统失衡对受试者进行保护(包括免疫)。尤其是可以利用本发明的组合物调节受试者的免疫系统，特别是儿童的免疫系统。
优选地，针对对儿童期疫苗接种的不良反应和/或其后果对受试者进行保护(包括免疫)。特别是在施用儿童期的疫苗之前和/或期间和/或之后，对受试者的免疫系统，尤其是儿童免疫系统进行调节。
术语“保护”用于此处，指的是与未以本发明组合物治疗或施用的受试者相比，该受试者对所述疾病/病症更不易感，和/或与未以本发明组合物治疗或施用的受试者相比，该受试者更能够抵御或克服所述疾病/病症。
另一方面，本发明提供了向受试者施用有效剂量的本发明药物组合物和/或免疫调节剂组合物，其中将所述组合物是与抗原或抗原决定簇共同施用的。
当该组合物与抗原或抗原决定簇依照本发明共同施用时，该抗原或抗原决定簇可以适当地为以下的一种或多种抗原或抗原决定簇:BCG(卡介苗)疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳(DTP或三联)疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、OPV(口服脊髓灰质炎疫苗)、母牛分枝杆菌或其中一部分(如GB0025694.1所教导)以及一般的疟原虫抗原，例如疟疾寄生物抗原。可以讲两种或更多，或者三种或更多的此类抗原或抗原决定簇适当地与本发明的药物组合物或免疫抑制剂组合物共同施用。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防以下中的一种或多种:感染(例如细菌、病毒，比方说乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常，或者寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属感染和弓形虫病)和/或伴随有感染的免疫功能异常；自身免疫疾病(例如以闭塞性血管病为例的血管病症、关节炎和移植物排斥反应)；应激(例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激)；过敏(例如包含过敏性哮喘在内的哮喘、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏)；马气喘病；COPD；PMWS；PDNS；SIPH和癌症(例如黑素瘤或腺癌或以宫颈癌为例的病毒性相关的癌症)；免疫系统失衡(例如儿童和大龄者的免疫系统失衡)；以及术后应激和术后感染。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属感染和弓形虫病中的一种或多种。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防病毒感染，例如乳头瘤病毒感染，包括例如马肉样瘤、生殖器疣或发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防自身免疫疾病、闭塞性血管病和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)的免疫方式，关节炎和移植物排斥反应中的一种或多种。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防应激，例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防以下中的一种或多种:哮喘(包括过敏性哮喘)、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏。更优选地，将本发明的药物用以治疗或预防包括过敏性哮喘在内的哮喘和被昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防一种或多种的COPD和马气喘病。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防一种或多种的PMWS和PDNS。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防SIPH。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防癌症(例如黑素瘤和/或腺癌和/或以宫颈癌为例的病毒性相关的癌症)。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防大龄者的免疫系统失衡。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防术后应激或感染。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防儿童的免疫系统失衡。
优选地，将本发明的药物用以治疗或预防对儿童期疫苗接种的不良反应和/或其后果。
在本发明的另一方面，根据本发明的药物组合物或免疫调节剂组合物可以包含来自奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌。该组合物可以适当地包括两种或更多种，或者三种或更多种来自奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌。
符合本发明用途的细菌可以适当地与其它增强免疫的细菌联合应用，其它增强免疫的细菌为例如选自以下菌属中任意菌属的细菌:红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、冢村氏菌属(Tsukamurella)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)，包括选自以下这些属的任意菌属的任意菌种:例如支气管戈登氏菌(Gordoniabronchialis)、沟戈登氏菌(G.amarae)、痰戈登氏菌(G.sputti)、土生戈登氏菌(G.terrae)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、海洋迪茨氏菌(Dietzia maris)、微代谢冢村氏菌(Tsukamurella paurometabola)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)、嗜粪红球菌(R.coprophilus)、白色类诺卡氏菌(Nocardioides albus)和Tsukamurella inchonensis。
适当地，使用的选自各个具体菌属的菌种是可以在低抗原培养基，优选无抗原培养基中生长的菌种。仅举例来说，合适的无抗原培养基为苏通培养基(Sauton’s medium)。
更优选地，与依照本发明应用的细菌共同应用的细菌选自红球菌属，包括赤红球菌(以前名为红色诺卡氏菌)、玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodocrous)、椿象红球菌、嗜粪红球菌、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)。
更优选地，与依照本发明应用的细菌共同应用的细菌为赤红球菌。
仅举例来说，将一种或多种选自支气管戈登氏菌、赤红球菌、玫瑰色红球菌、椿象红球菌、海洋迪茨氏菌和土生戈登氏菌的生物，与本发明应用的细菌联合应用，可以有效治疗和/或预防寄生虫感染。
仅举例来说，将一种或多种选自Tsukamurella inchonensis、沟戈登氏菌和星状诺卡氏菌的生物，与本发明应用的细菌联合应用，可以特别有效地治疗和/或预防过敏，例如以蠓为例的由昆虫所咬引起的过敏，和/或治疗和/或预防癌症，例如以马肉样瘤为例的皮肤肿瘤(skin neoplasm)。
仅举例来说，将嗜粪红球菌与本发明应用的细菌联合应用，可以特别有效地调节感染，特别是寄生虫感染，和/或促进家畜的生长。
在本发明的一个实施方式中，可以将细菌的全细胞与嗜粪红球菌联合应用以预防或治疗PMWS和/或PDNS。
在本发明的一个实施方式中，可以将奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌全细胞与Tsukamurella inchonensis联合应用以预防或治疗SIPH。
优选地，本发明的细菌在应用之前经过了灭杀。
优选地，本发明的细菌通过热处理而灭杀，例如，在高压灭菌器中以121℃热处理15分钟。其他合适的灭杀细菌的处理方法可以包括紫外线或电离辐射或用化学品处理，例如用酚、醇或福尔马林的处理。电离辐射可以适当地通过暴露于来自Co60源的2.5Mrads来进行。
优选地，本发明的细菌是经纯化和/或分离的。
优选地，将本发明的细菌悬浮于水或缓冲盐水中，适当地为pH8的硼酸缓冲液。
术语“受试者”用于此处表示动物。优选地，所述受试者为哺乳动物、鸟、鱼或甲壳类，包括例如家畜和人类。在本发明的某些方面，所述受试者适当地是人类。
在本发明的一方面中，例如治疗PMWS和/或PDNS时，所述受试者可以为猪。
在本发明的另一方面中，例如治疗COPD、马气喘病和/或库蠓属时，所述受试者可以为马。
在本发明的另一方面中，例如治疗SIPH时，所述受试者可以为鱼(例如锦鲤)或竞赛类动物(例如人、马、骆驼或灰狗)。优选所述受试者为竞赛类动物。
术语“免疫调节剂”用于此处包括了疫苗。
在本发明的一些实施例中，术语“粗糙型菌株”指稳定的粗糙型菌株。术语“稳定的”表示该粗糙型菌株在连续培养20代或以上时仍保有其粗糙的菌落形态。
术语“菌落的形态”或“菌落形态”用于此处表示该细菌在琼脂平板上的培养特征。
术语“粗糙的”用于此处表示其区别于光滑。术语“粗糙的”用于此处可以包括以不规则菌落形态为例的特征，还可以包括例如波状(undulate)和/或叶状(lobate)形态。
本发明的另一方面，术语“粗糙的”用于此处表示该菌株不能和/或基本不能产生O-多糖。
产生粗糙型菌株 本发明的某些方面涉及生产细菌粗糙型菌株的方法，该方法是通过将细菌暴露于砜和/或磺胺或利用砜和/或磺胺而产生粗糙型菌株。
这样的方法和用途是基于以下惊人发现而预测的，即将细菌(例如分枝杆菌的光滑型变体)暴露于砜和/或磺胺导致粗糙型变体的产生。
优选地，本发明方法所用的细菌来自放线菌目(Actinomycetales)中的好氧生物的菌属。优选地，所述细菌来自分枝杆菌属。适当地，所述细菌来自奥布分枝杆菌。
适当地，本发明方法所用的细菌可以在任何适合的培养基中生长，例如Middlebrook 7H11培养基。
优选将本发明方法所用的细菌暴露于一定浓度的砜和/或磺胺，其浓度为每1ml培养基大于或等于一份砜和/或一份磺胺。优选地，浓度大于或等于7.5μg/ml。优选的浓度大于或等于10μg/ml。优选的浓度小于30μg/ml。优选的浓度等于或小于20μg/ml。优选的浓度为大约12μg/ml。
适当地，砜和/或磺胺可以与适当的培养基混合，且细菌可以在其中生长。
由本发明方法产生的细菌粗糙型菌落可以进一步分离。
适当地，由本发明方法产生的细菌粗糙型菌落可以为稳定的。
在本发明的某些实施方案中，术语“粗糙型菌株”指的是在不含砜和/或其磺胺时继代培养(repeated culture)至少3代而能够保持其粗糙形态的细菌菌株。
砜 术语砜指的是式(I)的化合物:
其中 R1为烃基， R2为烃基。
优选地，R1选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基(heteroaryl)和取代杂芳基。
优选地，R1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
优选地，R1为取代苯基。
优选地，R1为4-氨基苯基。
优选地，R2选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基 优选地，R2选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
优选地，R2为取代苯基。
优选地，R2为4-氨基苯基。
R1和R2可以相同或不同。
在一个优选的实施方式中，砜为4，4′-二氨基二苯砜和/或其类似物。
4，4′-二氨基二苯砜通常以DapsoneTM的商品名由Sigma销售。
4，4′-二氨基二苯砜的同物异名包括N，N′-二苯砜二胺(N，N′-Diphenylsulfondiamide)、4，4′-磺酰基二苯胺(4，4′-Sulfonyldianiline)、二(对氨基苯)砜(Di(p-aminophenyl)sulfone)、氨苯砜(Novophone)、氨苯砜(Diaphenylsulfon)、氨苯砜(Dumitone)、4，4′-二氨基二苯砜(Diphone)、4-氨基苯砜(4-Aminophenylsulfone)、双(对氨基苯)砜(Bis(p-aminophenyl)sulfone)、WR 448、F1 358、氨苯砜(Croysulfone)、氨苯砜(Diphenasone)、代谢物C(Metabolite C)、氨苯砜(Dapsone(USAN))、1，1′-双(4-苯胺)砜(1，1′-Sulfonylbis[4-aminobenzene])、二氨基二苯砜(Diaminodiphenyl sulfone)、二(4-氨基苯)砜(Di(4-aminophenyl)sulfone)、p，p′-磺酰基二苯胺(p，p′-Sulfonyldianiline)、双(4-氨基苯)砜(Bis(4-aminophenyl)sulfone)、4，4′-磺酰基双苯胺(4，4′-Sulfonylbisbenzamine)、氨苯砜(Eporal)、DADPS、氨苯砜(diaphenylsulfone)、氨苯砜(dapsone)、氨苯砜(Avlosulfon)、4，4′-砜二苯胺(Benzenamine，4，4′-sulfonylbis-)、4，4′-砜二苯胺(Aniline，4，4′-sulfonyldi-)、氨苯砜(Udolac)、药用DDS(DDS，pharmaceutical)、DSS、DDS、p，p′-二氨基二苯砜(p，p′-Diaminodiphenyl sulfone)、氨苯砜(Sulfadione)、氨苯砜(Disulone)、氨苯砜(Avlosulfone)、p-氨苯砜(p-Aminophenyl sulfone)、氨苯砜(Dapson)、舒砜那(Sulfona)、NSC 6091D、和二氨基二苯砜(Diaminodiphenylsulfone)。
术语“氨苯砜TM”(“DapsoneTM”)用于此处指的是4，4′-二氨基二苯砜且涉及任何具有以下化学式的化合物:
磺胺 术语磺胺指的是式(II)的化合物:
其中 R1为烃基， R3为氢或烃基， R4为氢或烃基。
优选地，R1选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
优选地，R1选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
优选地，R1为取代苯基。
优选地，R1为4-氨基苯基。
优选地，R3选自氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
优选地，R3选自芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
优选地，R3为取代苯基。
优选地，R3为4-氨基苯基。
优选地，R4选自氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
在一个实施方式中，R3和R4中至少一个为氢。
在另一实施方式中，R3和R4中至少一个为烷基或取代烷基。
定义 术语“烃基”用于此处表示含有至少C和H且可以任选地含有一种或多种其它合适取代基的基团。这些取代基的例子可以包括卤代-、烷氧基-、硝基-、氨基、烃基、N-酰基、环形基团(cyclic group)等等。除了取代基可能为环形基团之外，取代基的组合也可以形成环形基团。如果烃基含有多于一个C，则这些碳并不一定需要彼此连接。例如，至少其中的两个碳可以通过合适的元素或基团连接。因此，该烃基可以包含杂原子。合适的杂原子对本领域技术人员是显而易见的，包括比方说硫、氮和氧。
在本发明的一个优选实施方式中，烃基选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基和取代杂芳基。
术语“烷基”指的是具有1至12个碳原子的直链、支链或环形烃基，优选1至8个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。低级烷基，即具有1至6个碳原子的烷基，是最优选的。
术语“取代烷基”指的是具有1个、2个或3个取代基团的烷基，其取代基团选自卤素、硝基、氰基、羟基、卤代烷基、卤代烷氧基、—ORx、—NRxRy、—SRx、—C(＝O)Rx、—OC(＝O)Rx、—S(＝O)Rx、—SO2Rx、—SO3Rx、—CO2Rx、—NRxC(＝O)Ry、—NRxCO2Ry、—NRxSO2Ry、——SO2NRxRy或者—C(＝O)NRxRy，其中各个(the or each)Rx独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、芳基、杂芳基和苄基；其中各个Ry独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、芳基、杂芳基和苄基。
术语“芳基”指的是苯基、1-萘基和2-萘基，优选苯基，以及这些环状基团与环烷基、环烯基、杂环基或杂芳基融合成的稠环。
术语“杂芳基”指的是芳香的5元或6元单环基团、9元或10元双环基团，以及11元至14元三环基团，且该三环基团中的至少一个环含有至少一个杂原子(O、S或N)。杂芳基中包含杂原子的每个环可以包含一或两个氧原子或者硫原子和/或一至四个氮原子，条件是每个环中杂原子的总合为四或更少，且每个环含有至少一个碳原子。组成双环或三环基团的稠环可以只包含碳原子，且可以为饱和的、部分饱和的或者不饱和的。氮原子和硫原子可以任选地被氧化，且氮原子可以任选地被季铵化。双环或三环的杂芳基必须包含至少一个的全芳香环(fully aromatic ring)，但其它的一个或多个稠环可以为芳香或非芳香的。杂芳基可以附接在任何环中任何可用的氮原子或碳原子上。杂芳环的例子包括且不限于:呋喃、噻吩、吡咯、噁唑、噻唑、咪唑、异噁唑、吡唑、异噻唑和吡啶。
术语“杂原子”应包括氧、硫和氮。
术语“取代芳基”和“取代杂芳基”包括具有一、二或三个合适取代基的环。
术语“4，4′-二氨基二苯砜的类似物”表示具有基本的4，4′-二氨基二苯砜结构的化合物，其中附接于苯环的一至六个氢原子和/或氨基由合适的取代基所取代，且任意一个苯环上不出现多于三个的合适取代基。4，4′-二氨基二苯砜类似物的合适取代基可以包括以一个氢取代氨基。
优选地，各个合适的取代基选自C1-6烷基、C2-6烯基、苯基、苄基、卤素、硝基、氰基、羟基、卤代烷基、卤代烷氧基、—ORx、—NRxRy、—SRx、—C(＝O)Rx、—OC(＝O)Rx、—S(＝O)Rx、—SO2Rx、—SO3Rx、—CO2Rx、—NRxC(＝O)Ry、—NRxCO2Ry、—NRxSO2Ry、——SO2NRxRy或者—C(＝O)NRxRy，其中各个Rx独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、芳基、杂芳基和苄基；其中各个Ry独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、芳基、杂芳基和苄基。
优选地，各个合适的取代基为—NRxRy，其中Rx和Ry定义如上。
优选地，各个合适的取代基为—NH2。
当下标与基团联合使用时，例如C1-4烷基，该下标指的是该基团含有的除杂原子之外的碳原子数目。因此，术语羟基C1-4烷基或C1-4羟烷基指的是含有一至四个碳原子且在其中一个碳原子上具有一个OH取代基的烷基。
术语“烯基”指的是具有至少一个双键的直链、支链或环形的烃基。具有2至6个碳原子和一个双键的烯基为最优选。
术语“卤代”或“卤素”指的是氯代、溴代、氟代和碘代。
术语“卤代烷基”指的是具有一个或多个卤素取代基的烷基。因此，它包括，比如三氟甲基。术语“全氟代甲基”表示含有两个或三个氟取代基的甲基。
术语“卤代烷氧基”表示具有一个或多个卤素取代基的烷氧基。例如，“卤代烷氧基”包括—OCF3。
治疗用途 本发明的免疫调节剂可以用于治疗。这样的化合物尤其可以用于调节体内的T淋巴细胞应答和/或体内免疫应答中包括的其它细胞。
能够调节，尤其是阻断T细胞增殖和/或分化和/或活性的免疫调节剂/药物组合物，可以用于抵御容易通过调节获得性免疫应答(即细胞免疫应答)而预防或治疗的任何疾病。
适当地，将本发明的组合物用于调节细胞免疫应答以治疗或预防以下中的一种或多种:传染病(例如以耐甲氧西林(methycillin-resistant)金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为例的细菌感染；结核，包括多抗药性肺结核和麻风病；慢性病毒感染，例如肝炎、HIV和乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常；潜伏病毒感染，例如带状胞疹(Herpes zoster)或感冒疮(cold sores)(单纯性胞疹(Herpes simplex))；或者寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽的艾美球虫属感染和弓形虫病；过敏(例如变应性皮炎或过敏性哮喘)；自身免疫疾病(例如以闭塞性血管病为例的血管病症，关节炎和移植物排斥反应)；应激(例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激)；PMWS、PDNS、SIPH和癌症(例如，该组合物可以贯穿成年生活地规律施用以抵消烟草的作用)。
范围更广的疾病列表由WO-A-98/09985提供。为了易于借鉴，现将该列表的部分内容提供如下:与超敏反应有关的炎症、过敏反应、哮喘、与口疮性溃疡相关的炎症(inflammation associated with aphthus ulceration)、溃疡性结肠炎、肝纤维化、肝硬化或其它肝病、皮炎、特别是以湿疹为例的遗传过敏性皮炎、牙周病或其它口腔疾病(dental disease)，以治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病，例如白血病、其它癌症。
传染病 能够调节特别是激发(即诱导或增强)T细胞增殖和/或分化，或者能够防止或逆转T细胞无反应性的组合物可以普遍地用于促进或诱导T细胞免疫应答。事实上所有的获得性免疫应答都需要T细胞的活化以及它们向细胞因子生成细胞的分化。因此，这些组合物可以普遍地用于预防和/或治疗传染病-例如病毒或细菌性传染病。适当地，这些组合物可以用于预防和治疗寄生虫感染，例如疟疾、利什曼病、弓形虫病和锥虫病。适当地，这些组合物可以用于预防或治疗病毒感染，例如乳头瘤病毒引起的感染，包括马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常。
在本发明的一方面，该感染优选为锥虫病。
在本发明的另一方面，该感染优选为乳头瘤病毒引起的感染，特别是牛乳头瘤病毒1和2。在本发明的另一方面，该感染优选为一种或多种马肉样瘤、生殖器疣和发生于宫颈癌之前的宫颈发育异常。
马肉样瘤 本发明的组合物还可以用于预防和治疗马肉样瘤。
马肉样瘤是马类最常见的皮肤肿瘤，并且与牛乳头瘤病毒1和2的感染相关联(Chambers et al J.Gen.Virol.2003:84:1055-1062)。该病症目前没有有效的治疗方法，尽管手术、非特异性免疫治疗和细胞毒药物(cytotoxic drug)均可以有一些效果。
本发明的组合物优选地在与病症或肿瘤相同的淋巴结引流区施用。
PMWS和PDNS 断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome；PMWS)影响着4至16周龄(15-50kg)的断奶后的仔猪。PMWS通常影响着断奶后一至两周的仔猪，并且非常不同于断奶后未能充分进食或饮水的衰弱/不良(poor)断奶仔猪。患有PMWS的仔猪是开始生长之后快速虚脱且通常对抗生素反应极差的断奶仔猪。
猪皮炎和肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome；PDNS)影响着8至18周龄的猪，并且最明显的标志是皮肤上的紫红色斑点，其在几日后转变为褐色并结痂。猪表现为嗜睡，并可能有它们的肾病导致的腿部肿胀。该综合征同样对抗生素反应很差。
导致PMWS和PDNS两者的原因(agent)目前均未知。在两种综合征中最有嫌疑的病原体为猪圆环病毒“II型”，其与广泛分布的常规不致病猪圆环病毒“I型”在抗原性上截然不同。猪圆环病毒II型(PCV II)在英国农场中已经由血清学鉴定。被认为是免疫复合物介导性疾病的PDNS，在其病原学上还可能包括细菌，虽然细菌所起的作用尚不清楚。
本发明的组合物可以适当地用于制备药物，所述药物用以治疗或预防PMWS和/或PDNS。
SIPH(应激诱导性肺出血) 本发明的组合物还可以用于预防和治疗SIPH。本发明的组合物还可以用于治疗高原性肺水肿(HAPE)。
应激诱导性肺出血(SIPH)是一种在动物受到应激时引起肺内血管出血的病症。术语“SIPH”用于此处可以包含病症HAPE(高原性肺水肿)，该病症由肺毛细血管的应激衰竭而使得液体摄入肺内而导致(也叫湿肺(wet-lung))。此外，术语“SIPH”用于此处还可以包含运动诱发性肺出血(EIPH)，其是在剧烈运动时引起肺内血管出血的病症。
HAPE是潜在的致命病症，其通常在上升到海拔3000m之上2至4天后发生。按照通常的上升速率，发生率为大约1％至2％，但迅速上升至4500m的人中多达10％发生了该病症。在HAPE发生之前可能发生急性高山病，但并不总是如此。其主要症状为呼吸困难，伴有运动耐力下降。通常先发生干咳，但这可以发展成为产生泡沫、带血痰的咳嗽。在检测中通常有呼吸急促和心动过速。
已知EIPH影响哺乳动物，尤其是竞赛类哺乳动物，例如马、灰狗、骆驼和人类。已知EIPH在剧烈运动后影响哺乳动物，尤其是竞赛类哺乳动物。
EIPH最常见于纯种马(thoroughbred horse)中，认为其会导致性能丧失，但也发现其存在于标准种竞赛型马(standardbred racing horse)(快步马(trottinghorse)或溜蹄马(pacing horse))、马球马、跳跃表演赛马(show jumping horse)、越野赛马(cross country horse)和障碍赛马(barrel racing horse)中。EIPH被认为是困扰着多达85％的比赛用马的普遍病症。
EIPH的症状多变，从观察通过纤维镜(by fibroscopy)获得的支气管肺泡液中的红细胞而检测出的轻度出血，到比赛后鼻孔附近粘液泡沫中出现的血液。虽然在最严重的情况下，EIPH表现为鼻孔出血(鼻出血)，但很多马没有表现出任何病征。内窥镜检查的使用表明，40％至75％的纯种马竞赛后在其气管内确有出血。诊断还能够通过气管的清洗和支气管肺泡灌洗(BAL)而达到。
过敏 本发明的组合物还可以用于预防和治疗过敏(例如包括过敏性哮喘在内的哮喘、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏)。
甜痒病是一种马类最常见的皮肤病，尤其是在野马和/或小型马中。在英国大约3％的马均在某种程度上受到感染。大多数马在1岁至4岁之间表现出病征，且该病症在夏天恶化。特定的品种尤其有患该疾病的倾向。夏尔马(Shires)、哈克尼马(Hackneys)、威尔士小型马和冰岛小型马(Welsh and Icelandicponies)均显示为易受感染的品种。甜痒病是由于对小飞虫库蠓属所咬的超敏反应而引起的。在英国，这种飞虫于四月至十月存在，而其数量在五月至九月间达到高峰。这种飞虫以马类的特殊部位为食，通常在尾根(tail head)附近或鬃毛以下。在英国存在20个库蠓属的种，且部分以马类腹部下面为食。
仅举例来说，本发明的组合物还可以通过向受试者施用本发明的组合物而预防和/或治疗过敏性休克，所述受试者容易患有(predisposition to suffer)过敏性休克(例如，已知具有过敏症的受试者，比方说对花生过敏)，因而降低该受试者在(意外地)接触到可令他们产生不良反应的抗原比方说花生时，患发过敏性休克的可能性。
马气喘病/COPD 本发明的组合物还可以用于预防和治疗马气喘病和/或COPD(慢性阻塞性肺病)。
马气喘病是马类的肺病，与人类的哮喘和COPD具有相似性。其在马中的临床病征是通过对于存在于肺部的干草尘(hay dust)中的颗粒的过敏反应而引发的，所述肺部已被一定程度的纤维化所损坏。马气喘病最常见于老年马(超过6岁)中，其在冬天的月份中保持稳定。干草包含有微生物-例如细菌和真菌以及来自饲用谷物、植物、排泄物、皮屑和花粉的微型颗粒。这些微型颗粒在干草尘中成为气溶胶，并在它们被患有马气喘病的马匹吸入时引发过敏反应和纤维化。认为与马气喘病病原学相关的主要微生物有烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、普遍高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)和直枝干草菌(Faenia rectivirgula)。哮喘中支气管痉挛的减少和COPD中纤维化的减少，均在本专利的范围内。
自身免疫性疾病 本发明的组合物可以用于治疗和/或预防自身免疫性疾病，所述疾病在机理上(mechanistically)与T细胞调节不良和/或T细胞调节异常相关联。自身免疫性疾病的例子包括以下中的一种或多种:不良免疫反应和包括关节炎在内的炎症，包括类风湿关节炎、银屑病(psoriasis)、银屑病性关节炎(psoriaticarthritis)、血管病症尤其是血管内膜存在炎症的血管病症，血管疾病的例子有动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)、前葡萄膜炎(anterior uveitis)和血管成形术后的肌内膜增生；甲状腺炎、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏传导障碍(cardiac conduction disturbance)、心肌梗死、习惯性流产、视网膜色素变性、退化性眼底病的免疫和炎症成分(immune and inflammatorycomponents of degenerative fundus disease)、与自身免疫性疾病或症状或病症相关联发生在中枢神经系统(CNS)或其他器官的炎症(其中免疫和/或炎症为抑制为有益的)、帕金森病、治疗帕金森病引起的并发症和/或不良反应、格林-巴利综合征(Guillaim-Barre syndrome)、重症肌无力、由天然或人造细胞、组织和器官移植引起的移植物排斥，例如移植角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人造皮肤组织。
更详细地:器官特异性自身免疫性疾病包括例如多发性硬化和炎症性肠病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)。
系统性自身免疫病包括:类风湿关节炎。
血管病症包括血管内膜存在炎症的血管病症。
适当地，本发明的血管病症可以包括任何包含有自身免疫元素的血管疾病或血管病症，例如由自身免疫应答引起的病症。
适当地，本发明的血管病症可以包括一种或多种雷诺病和现象、前葡萄膜炎、闭塞性血管病、动脉粥样化形成(在它处也称为动脉硬化)、动脉炎、肌内膜增生(天然性或血管成形术后的)、导致血管内膜和/或肌肉层增厚的炎症和自身免疫、炎症性血管损伤、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏传导障碍、心肌梗死。
适当地，本发明的移植物排斥可以为慢性移植物排斥，尤其是在缺乏免疫抑制剂时。因此，本发明的组合物可以用于替代在移植之前、移植时和/或移植之后施用的传统免疫抑制剂。本发明的组合物可以应用在移植天然或人造细胞、组织和器官时，例如以下中的一种或多种:角膜、骨髓、器官(例如肾、肝)、晶状体、起搏器、天然或人造皮肤组织、胰岛细胞。
优选地，本发明的组合物可以用于治疗以下自身免疫性疾病:血管病症、关节炎、移植物排斥以及导致肌内膜增生和动脉粥样化形成的免疫方式。
应激 应激通常作为一种现代生活、高压执行生活方式(highpressure executivelifestyle)的症状而呈现，其后果被广泛认知，即导致重大的病理状况，例如胃溃疡、高血压、心脏病和中风。其他生活中主要的应激性事件例如离婚、丧亲和搬家被认为是导致心脏病的高风险因素。
这些不是误解，农业生产充分了解到了施与家畜重大压力而导致的经济损失，所述重大压力为例如过分拥挤、禁闭(confinement)和运输，其导致易感染性增加和潜在病状的积累(precipitation of underlying pathology)。医生和科学家的研究产生了越来越多的公开成果，表明以禁闭为例的可定义的应激能够导致内分泌(激素)活性的重大变化，其继而能够影响机体的免疫功能。这可以通过严重创伤应激(包括手术应激)而得到显著证明，在该应激中其细胞介导免疫应答明显瘫痪(Faist，1996)。
Elenkov IJ(1999)报道了近来的证据，显示作为应激系统终产物的糖皮质激素和儿茶酚胺和作为活化肥大细胞产物的组胺，可以选择性地抑制细胞免疫，并利于体液免疫应答。该现象是由应激激素和组胺对于Th1/Th2模式和1型/2型细胞因子生成的不同作用而介导的。因此，应激可以全身性地引发Th2移位(shift)，而在特定情况下，其可以局部地通过外周促肾上腺皮质激素释放因子-肥大细胞-组胺轴(the peripheral corticotrophin-releasing factor-mastcell-histamine axis)的神经活化而引发促炎活性。
Paik(2000)和Kay(2001)在关于学业压力的独立研究中，检测了学生在非考试和考试期间的免疫水平(immunological profile)。他们报道了IL-2和干扰素γ生成的显著减少以及IL-6的增长。
这表明了机体免疫系统通过下调Th1细胞因子和选择性上调Th2细胞因子而对应激事件进行应答。
Iwakabe(1998)，运用束缚应激的小鼠模型报道了将免疫应答偏向Th2优势免疫(Th2 dominant immunity)。
这种应激激素引发的向Th2免疫失衡的转换还在非主要、慢性应激情境中被报道过，所述情境例如在澳洲国家南极科学研究署(Australian NationalAntarctic Research Expedition)过冬的工人们的心理社会应激(Mehta(2000))。他们还报道了潜在病毒再激活的相关增加。
相似的应激激素和免疫变化报道于痴呆病人照顾者(care giver)的慢性应激(Bauer(2000))以及欧洲和平95任务(Euromir 95 mission)期间宇航员的慢性应激(Norbiato(1998))。尤为令人关注的是这些宇航员对感染的易感染性增高。
机体的设计是为了从应激中恢复，在急性应激中机体显然如此，因为随着病人在严重创伤中的恢复其感染的风险在减退。
然而慢性应激似乎维持了Th2优势免疫失衡。这是非常严重的后果，因为所有以上引用的作者都暗示了通过上述机制的应激，可能影响了传染性、炎症性、过敏性和肿瘤疾病的发病和/或进程。
该后果由Lawrence(2000)进一步支持。
本发明的免疫调节剂，优选口服免疫调节剂，激发了Th1应答并下调Th2应答，可以恢复免疫系统的健康均衡，并因此降低了与慢性应激相关的严重疾病的增长风险。
优选地，本发明的组合物用于治疗和/或预防应激，尤其是严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激。
优选地，本发明的组合物用于治疗和/或预防动物中的应激，适用于人类和/或家畜。
免疫系统失衡 免疫系统失衡-例如上调、下调或不适当调节的细胞免疫应答-可以发生在个体生命中的任何时间。该组合物可以适当地用于调节免疫系统失衡。也就是说，本发明的组合物可以用于治疗和/或预防免疫系统失衡。
(a)在儿童中 适当地，该免疫调节剂组合物或药物组合物可以用于调节儿童的免疫系统失衡，包括婴儿、幼儿和少年。免疫系统失衡-例如上调、下调或不适当调节的细胞免疫应答-可以发生于接种疫苗之后的儿童中，例如儿童期疫苗接种之后。这样的免疫系统失衡可以导致以发生过敏即变应性皮炎和过敏性哮喘为例的病症。
为了保护儿童不受感染，为他们重复注射以抵御白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、流行性腮腺炎和风疹。所有这些均为必须的，且卫生主管部门也施加了压力以保证儿童在适当的时间接受免疫接种。然而，大部分在生命早期给与的疫苗接种含有明矾佐剂，其具有重要的免疫后果。明矾是Th2类型应答的强效刺激物，随之发生的免疫调节异常导致了儿童变得容易发生过敏且有可能发生例如癌症。
有可能通过对免疫系统进行再训练而达到对自身和外界更好的识别、调节和应答。
该免疫调节剂组合物或药物组合物还可以适当地用于治疗或预防对儿童期疫苗-例如百日咳疫苗接种和目前的MMR疫苗接种-不良反应和/或其产生的后果。
(b)大龄者的免疫系统失衡 免疫系统失衡-例如上调、下调或不适当调节的细胞免疫应答，尤其是下调，例如免疫功能的退化(deterioration)-可能发生在大龄者中，通常在高于60岁的老人中。在大龄者中细胞免疫应答的下调通常指的是免疫衰老。免疫功能的退化通常可以造成例如对传染病和瘤形成的易感性的增加。作为人口一定比例的大龄者的数量在急剧增长，老年医学正在成为临床实践中的一个重要方面。因此，专注于免疫衰老机制和免疫系统健康与长寿之间关系的研究是不足为奇的。Goronzy(2001)检测了大龄者中流感疫苗接种的不同疗效。在这项研究中，仅有17％的受试者在疫苗接种1个月后的全部3种血细胞凝集素的效价中表现出了增高(成功的疫苗接种)，而46％的人没有表现出任何明显的应答。他们提出了这样一个观点:对流感疫苗接种的反应性是免疫衰老的一项重要生物学指标。许多研究人员研究了大龄者免疫功能的各个方面。例如，Lio(2000)研究了细胞因子反应，Solana(2000)研究了NK和NKt细胞，且Ginaldi(1999)指出了Th1向Th2细胞因子生成的转移和促炎细胞因子的增加产生能够解释与年龄相关的病理事件的很多方面，所述病理事件例如动脉粥样硬化和骨质疏松。因此，需要一种对免疫系统的非致病性刺激，所述刺激能够促使细胞因子反应不由促炎Th2向Th1转换。优选地，这样的免疫调节剂降低了急性感染的发病率，逆转了(counter)与年龄相关的自身免疫性疾病的发病并降低了其发病率，并可能减少瘤形成疾病的比率，这些疾病都是与免疫衰老相关的。
根据本发明这个方面的免疫调节剂组合物或药物组合物通常可以是免疫增强剂。
研究了共生肠道益生菌(probiotic commensal gut)和乳品细菌在本领域的潜在作用。例如，据报道，连续3周每日服用每剂量加有5 x 109或5 x 1010乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的乳制品，能够增加外周血NK、CD4和CD25的数量且通常会促进大龄者的全身细胞免疫(Gill，(2001))。
目前，许多含有大量乳酸杆菌(Lactobacilli)和其他肠道共生菌群的产品正被作为“生命增强剂”而积极推广。Sanders(2001)的一篇综述根据其主张的自1950年以来就用作药物的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的益生功效，指出需要对其作用机理进行进一步验证和阐明以证明其功效。尽管在腹泻病之后替换肠道菌群和在抗生素治疗后抵御念珠菌病具有有益作用，免疫刺激似乎是不可靠且短暂的。然而，该研究清晰地确定了强效的口服免疫调节剂的作用，优选为灭杀的免疫调节剂以避免活产品保存带来的困难。
口服疫苗接种具有历史悠久的行之有效的成功机制，其能够引发局部保护免疫以抵御口腔/排泄物病原体-例如骨髓灰质炎。然而，口服疫苗还显示能引起细胞介导和体液的全身性保护免疫应答。Sharpe(2002)运用包含麻疹病毒抗原的口服腺病毒构建体，引发了麻疹抗原的全身性抗体和脾淋巴细胞应答。Manube(2002)开发了一模型，显示口服减毒田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicroti)与传统的皮下注射BCG相比，针对结核病的气溶胶攻击(aerosolchallenge with tuberculosis)提供了更高水平的保护。
Kim(2001)揭示，服用日本雪松(Japanese cedar)花粉对特定性过敏产生了口服耐受，所述过敏由服用花粉后注射由油配制的花粉而引发。与此相关联的是降低的特异性免疫球蛋白水平和白细胞介素-4生成的大量减少，即，将Th2应答下调。
因此，全身性免疫应答可以由合适的免疫调节剂的施用-例如口服施用而激发和调节。
适当地，在本发明的一方面，设想本发明的细菌全细胞可以包含在食物制备物中和/或可以作为一种“药物(remedy)”类型而提供，优选口服提供。
增强免疫系统 本发明的组合物可以用于制造药物，所述药物用于增强动物免疫系统，优选哺乳动物，更优选家畜和/或竞赛类动物，其可以导致受试者中例如对生长的促进(例如增进)和/或饲料利用效率的提高和/或健康(well-being)的普遍提升(即受试者的总体健康得到改善)。受试者的总体健康可以通过例如以下一种或多种参数而确定:体重数据(以体重上升为正决定因素)、机警性(以高度机警(full alert)为正决定因素)、运动(以相对于迟缓运动的活力运动为正决定因素)和疾病(以疾病数量降低为正决定因素)。根据本发明这个方面的免疫调节剂组合物或药物组合物通常可以是免疫增强剂。
本发明的免疫调节剂组合物或药物组合物可以很好地用于替代目前用于促进家畜生长的抗生素。
术语“家畜”用于此处表示任何饲养的动物(farmed animal)。优选地，家畜为家禽(包括鸡)、猪(包括仔猪)、绵羊(包括羔羊)、母牛或公牛(包括犊牛)中的一种或多种。更优选地，家畜代表猪-包括仔猪。
本发明还设想将本发明的菌属与已知的益生细菌联用以修饰细胞免疫应答。
目前商业上普遍使用抗生素作为饮食强化饲料添加剂(dietary enhancingfeed additive)(或生长促进剂)加入到动物饲料中。然而，欧盟预计将完全禁止在畜牧业中非临床性地使用抗生素。因此，市场需要有效的替代品。
本发明的一个优点是，它可以用作(优选地与良好的畜牧业实践共同用作)饮食强化饲料添加剂(或生长促进剂)的替代品。
本发明的免疫调节剂组合物或药物组合物可以用作增强免疫系统的食品添加剂。
癌症 本发明的组合物可以适当地用于调节细胞免疫应答以治疗和/或预防癌症。特别设想了本发明的组合物可以用于保护受试者以防止癌症的发生和/或发展。特别地，具有调节过的细胞免疫应答的受试者可能更加不易患发癌症。
特别地，在癌生长时观察到了Th2未受调节的增长。
癌症是影响着很多人的疾病，其65％的病例发生在65岁以上的人群中。由于英国的平均期望寿命自19世纪中期以来增长近一倍，具有患癌症风险的人口数量也随之增长。其他原因致死的死亡率，例如心脏病，近几年有所下降，然而癌症的死亡率基本保持稳定。结论就是，每3人中就有1人会在其一生中被诊断患有癌症，且每4人中就有1人将死于癌症。
癌症的例子包括膀胱肿瘤、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、节直肠癌、腺癌、子宫内膜癌、食管癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、软组织癌和胃癌。
此外，持续吸食烟草以及在较小程度上的被动吸烟，均与直接接触烟雾部分的癌症相关，包括口咽部、气管、肺、食管和胃。不仅这些部位，远距离的肿瘤，例如肾、膀胱、胰腺、肝的肿瘤和髓细胞性白血病，也可以因吸食烟草而增加。本发明中，设想了能够向烟草吸食者施用本发明的组合物，以尝试降低吸烟者发生与吸食烟草相关的癌症的风险。
适当地，该癌症可以为腺癌或黑素瘤。
适当地，该癌症可以为病毒性相关的癌症，例如宫颈癌。不希望受理论的束缚，在一些例子中，发现由乳头瘤病毒引起的感染比方说宫颈发育异常，发展成了子宫颈的癌症。因此，此处的宫颈癌被认为是“病毒性相关的癌症”。然而，术语“病毒性相关的癌症”用于此处表示任何可以由病毒感染引发或与病毒感染相关的癌症。
术后恢复、应激和感染 任何大型手术之后，均会潜在性地产生许多状况: 与外科手术相关的应激包括以下中的一种或多种:手术前的恐惧、手术过程引起的组织应激、通常与恢复相伴随的疼痛、对手术结果重大性的担忧。
这些类型的应激是与T细胞功能向Th2偏斜相关的。
术前用药和麻醉药物的免疫抑制作用，其可以在手术之后持续数日或数周。
为了避免疑义，术语“术后应激”用于此处包括了与麻醉相关的应激。
此外，手术时所切开肌肉暴露于直接的感染，和恢复室及出院前病房中使伤口暴露于感染也是个问题。
这些因素联合起来，使病人暴露于一些列潜在的细菌感染，其: 由于病人住院，包括了众所皆知的与医院相关的感染，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染。肠道手术使病人暴露于革兰阴性感染，其原因是所切开的组织与肠内容物相接触。下肢手术也易受肠道菌群中正常成分的感染。
伤口的小感染使愈合延缓，并增加了发生更严重感染的机会。
为了抵消这些影响，向Th1进行免疫调节和下调Th2，本发明的应用结果应该做到下列中的一种或多种:增加对术后细菌感染的非特异性抵抗力；帮助伤口愈合和/或减少应激。
T辅助细胞 术语“Th1”用于此处指的是T辅助细胞1型(Th1)。该术语还可用于此处表示由该细胞类型介导或经由该细胞类型介导(mediated by or through such acell type)的应答。这样的应答可以包含以下中的一种或多种:白细胞介素-2(IL-2)的分泌、干扰素-γ(IFN-γ)的分泌、巨噬细胞的活化、细胞毒性T细胞的活化，或与Th1相关的其他任何事件。因此，术语“Th1”可以包含Th1细胞和由该细胞产生的免疫应答。
术语“Th2”用于此处指的是T辅助细胞2型(Th2)。该术语还可用于此处表示由该细胞类型介导或经由该细胞类型介导的反应。这样的反应可以包含以下中的一种或多种:白细胞介素-4(IL-4)的分泌、白细胞介素IL-4δ2剪接变体的分泌、白细胞介素-5(IL-5)的分泌、淋巴细胞上细胞决定簇30(CD30)的水平的增高、血液中免疫球蛋白-E(IgE)或血液中嗜酸性粒细胞的水平增高，或与Th2相关的其他任何事件。因此，术语“Th2”可以包含Th2细胞和由该细胞产生的免疫应答。
已知各种不同的状况均可能导致或来自细胞免疫应答的上调或不当调节，尤其是Th1和/或Th2的活化和/或增殖，发现若放任其处于未调节或不当调节，则导致对受试者的不良影响。
特别地，发现这样未调节或被不当调节的细胞免疫应答发生于疫苗接种之后，例如，在儿童期疫苗接种之后，并认为其导致了例如过敏的发病等症状，即变应性皮炎和过敏性哮喘。举例来说，Lewis D Curr Opin Immunol 2002；14:644报道了由IL-4、IL-5和IL-13的分泌介导的Th2免疫应答，在特应性疾病(atopic disorders)的发病中起了关键作用，所述疾病包括过敏引起的哮喘、鼻结膜炎(rhinoconjuctivitis)和过敏反应(anaphylaxis)。虽然这类应答由常规的特异性免疫治疗进行了一定程度的下调，该方法仅部分有效，且具有发生不良反应的重大危险。用于免疫治疗性预防和用于治疗特应性疾病的许多策略以小鼠过敏模型为基础而设计，包括由诱导调节性T细胞活性来下调Th2应答、Th2向Th1的免疫偏斜、Th1对于Th2免疫应答的交互调节(crossregulation)、无反应性及免疫抑制细胞因子。Choi & Koh Ann AllergyAsthma Immunol 2002；88:584-91检测了BCG疫苗接种对于患有哮喘(Th2相关的过敏性疾病)的成年病人在临床上是否有效。结果表明，BCG疫苗接种改善了肺功能，并减少了患中度至重度哮喘病人的药物使用。这种改善伴随有Th2型免疫应答的抑制，表明BCG疫苗接种可以是有效的哮喘治疗方法。vonHertzen J Allergy Clin Immunol 2002；109:923-8简要叙述了以下事件的可能性，即与持续过量的皮质醇分泌相关的延长的母体内应激(maternal stress)能够影响发育中的免疫系统-特别是Th1/Th2细胞分化，其可以进一步增加遗传易感受试者对哮喘和遗传性过敏症(atopy)的易感性。
此外，在疾病发展期间观察到了未调节或不当调节的细胞免疫应答。特别是在癌症生长时，观察到了Th2的未受调节的增长。举例而言，Maraveyas etal.Ann Oncol 1999；10:817-24研究了SRL 172疫苗在患有癌症，即晚期IV(AJCC)恶性黑素瘤的病人中的功效。检测了来自这些病人的外周血淋巴细胞(PBLC)中细胞内细胞因子(IL-2和INF-γ)的诱导，并将其与临床疗效相联系。已证明，在大量患有IV期(AJCC)黑素瘤的病人中，SRL172对于诱导细胞内IL-2应答是有效的。据Stanford et al.International Journal of PharmaceuticalMedicine 1999；13:191-195报道，越来越多的证据显示有效的抗肿瘤免疫应答很有可能是由1型细胞因子介导的。近来的研究显示，热灭活母牛分枝杆菌是可靠的Th1佐剂，且初步临床试验显示其对于黑素瘤以及前列腺癌和肺癌具有有益作用。更多方面的设有对照的研究正在开展以证实这些发现。
未调节或不当调节的细胞免疫应答还发现于感染、特别是慢性感染的过程中，例如，在进行性结核病、瘤型麻风、内脏利什曼病和HIV感染过程中，以及过敏的过程中。举例来说，Clerici & Shearer GM Immunol Today 1993；14:107-11提出，Th1向Th2的转换在HIV感染的病因学中是个关键的步骤。Clerici& Shearer Immunol Lett 1996；51:69-73揭示，HIV-特异性细胞介导的免疫在抵御HIV感染和HIV感染向AIDS的发展中，可能是重要的相关因素(correlator)。Abbot NC et al.European Journal of Vascular and Endovascular Surgery 200224:202-8通过热灭活母牛分枝杆菌的施用评估了作为一种改善慢性麻风病人外周血流的方法的免疫治疗。结果表明，18个月前实施的该免疫治疗，极大地改善了经充分治疗的慢性麻风患者的血流和温度觉。
因此，本发明的目的是促进和建立对细胞免疫应答的调节，包括对Th1和/或Th2的调节或调整，通过这种方法来克服未调节或不当调节的细胞免疫应答的负面影响。
适当地应用本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物，可调节Th1或Th2应答，即能导致例如组织损伤的Th1或Th2应答。
未调节或不当调节的免疫应答可以在疾病的形成(establishment)中起一定作用，原因是一些疾病导致了Th1和/或Th2应答的漂移。伴随这些非典型Th1和Th2反应的是一系列非正常的炎症反应，其可能在组织病理的潜在发病机制中发挥了作用。
仅举例来说，本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以抵消伴随着现代生活的与环境影响(例如，抗原)的接触减少而带来的不利，可以抵消由治疗以下状况带来的影响:感染(例如寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形虫病)和/或伴随有感染的免疫异常、应激(例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激)、过敏(例如包含过敏性哮喘在内的哮喘、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬引起的过敏-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏)、马气喘病、COPD和癌症(例如黑素瘤或腺癌)、免疫系统失衡(例如儿童和大龄者的免疫系统失衡，比如对儿童期疫苗接种的不良反应)，以及术后应激和术后感染。
疫苗 制备包含一种或多种物质作为活性组分的疫苗，是本领域技术人员所知的。这样的疫苗通常制备成可注射的形式，即液体溶液或悬浮液；也可以制备成适合在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。也可以将该制备物乳化，或将活性组分包裹于脂质体中。该活性组分通常与可药用且与该活性组分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为，例如水、盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇等及它们的组合。或者，该疫苗可以制备为，例如能够口服摄取和/或能够吸入的疫苗。
此外，若需要，该疫苗可以包含少量的助剂(auxiliary substance)，例如湿润剂或乳化剂和pH缓冲剂。
施用 通常医生将决定疫苗、免疫调节剂组合物和药物组合物对每个受试者最适合的实际用量，且该用量是随特定病人的年龄、体重和反应而变化的。以下剂量以平均情况为例。当然，可以有个别例子应该具有更高或更低的剂量范围。
优选地，实际所用剂量应对受试者产生最小的毒性。
本发明的组合物可以由直接注射而施用。该组合物可以配制成肠胃外、粘膜、肌内、静脉内、皮下、眼内、皮内或经皮施用的制剂。
适当地，本发明的组合物可以以103-1011生物体(organisms)的剂量施用，优选104-1010生物体，更优选106-10-5 x 109生物体，且更进一步优选106-109生物体。本发明的组合物通常可以以108-109细菌的剂量对人或动物施用。
若将本发明组合物的施用作为免疫增强剂，则可以以每剂量103-1011生物体、优选每剂量104-1010生物体，更优选每剂量106-10-5x109生物体，且更加优选每剂量106-109生物体，且更加优选每剂量108-109细菌以固定间隔对人或动物施用。
技术人员应容易地了解到，施用的剂量将取决于被施用该剂量的生物体。
术语“施用”包括了由包含注射、脂质介导的转染、脂质体(liposomes)、免疫脂质体、脂质转染剂(lipofectin)、阳离子面两性分子(cationic facialamphiphiles(CFAs))及其组合在内的递送机制介导的递送，或者甚至是病毒递送。这类递送机制的路径包括但不限于粘膜、鼻腔、口腔、肠胃外、胃肠、局部(topical)或舌下途径。
术语“施用”包括但不限于通过粘膜途径的递送，例如作为鼻腔喷雾剂或吸入用气溶胶或可摄取溶液；肠胃外途径，其中通过可注射形式来进行递送，例如静脉内、肌内、皮内或皮下途径。
术语“共同施用(co-administered)”表示本发明各个佐剂、抗原和/或抗原决定簇的施用部位和时间令免疫系统得到了必要的调节。因此，尽管抗原和佐剂可以在同一部位同时施用，但将抗原和/或抗原决定簇在异于佐剂的时间和部位施用也可能是有利的。抗原和/或抗原决定簇与佐剂甚至可以在同一递送运载体上进行递送---且抗原和/或抗原决定簇与佐剂可以为偶联的和/或未偶联的和/或遗传偶联的和/或遗传未偶联的。仅举例来说，本发明的免疫调节剂组合物可以在一种或多种或更多抗原施用的之前、同时或之后施用。
抗原、抗原决定簇、肽或其同源物或模拟物(mimetic)，可以作为单独剂量或多重剂量对宿主进行单独施用或共同施用。
本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以以很多不同途径进行施用，例如注射(其包括肠胃外、皮下、皮内和肌内注射)、鼻内施用、粘膜施用、口服、阴道内施用、尿道施用或眼施用。
在本发明中优选以注射施用。更优选所述注射为皮内注射。
在本发明中优选通过可口服的组合物施用。
对于免疫接种，可以提供该组合物0.1至0.2ml的水溶液，优选缓冲生理盐水，并进行肠胃外施用，例如皮内接种。本发明的疫苗优选皮内注射。注射部位可能有轻微的肿胀和发红，有时候伴随瘙痒。施用的方式、剂量和施用的次数可以由本领域技术人员以已知方式进行优化。
抗原 “抗原”用于此处表示一种实体(entity)，即当将其引入具有免疫活性的宿主时，能修饰特异性抗体或者能与该实体结合的抗体的产生，和/或修饰相关的Th应答，例如Th2和/或Th1。抗原可以为纯物质、物质的混合物或者可溶性材料或颗粒性材料(包括细胞或细胞碎片或细胞超声粉碎物(cellsonicate))。从这个意义上说，该术语包括了任何合适的抗原决定簇、交叉反应抗原、同种异体抗原、异种抗原、耐受原、变应原、半抗原和免疫原，或它们的部分，以及它们的任意组合，且这些术语在全文中可互相替换使用。
术语“抗原决定簇或表位”用于此处指的是抗原上的一个部位，其由抗体或T细胞受体识别，或者负责T辅助细胞应答的引发。其优选为源自蛋白抗原的短肽或作为蛋白抗原的部分的短肽。然而，该术语还意欲包括糖肽和碳水化合物表位。该术语还包括了氨基酸或碳水化合物的经修饰序列，其刺激了识别整个生物体的应答。
若该抗原决定簇为导致传染病的传染原的抗原决定簇，则这种情况是很有利的。
“预防的(preventative)”或“预防性(prophylactic)”的疫苗是指施用给未接触过抗原的个体(naive individuals)来防止病症发展的疫苗，例如通过激发保护性免疫。
“治疗性”的疫苗是指施用给已经患有病症的个体，以使病症减轻或减至最小或消除该病症的免疫病理后果的疫苗。
佐剂 术语“佐剂”用于此处表示一种实体，其能够增大或参与对免疫应答的影响。佐剂可为任何物质或物质的混合物，其协助、增加、下调、修饰或多样化对抗原的免疫应答。
本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以包含一种或多种增强该免疫调节剂组合物和/或药物组合物效力的佐剂。可能有效的附加佐剂的例子包括但不限于:选自以下菌属中的一种或多种的细菌的全细胞，冢村氏菌属、红球菌属、戈登氏菌属、诺卡氏菌属、迪茨氏菌属、分枝杆菌属；氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、二氧化硅(silica)、高岭土(kaolin)、石墨(carbon)、油包水型乳化剂、水包油型乳化剂、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂质X(Lipid X)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)(痤疮丙酸杆菌(Propionobacterium acnes))、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、母牛分枝杆菌、奥布分枝杆菌、聚核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、以白细胞介素-2和白细胞介素-12为例的白细胞介素、皂苷、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)、嵌段共聚物或其他合成佐剂。这样的佐剂可从多种来源通过商业途径获得，例如默克佐剂65(Merck Adjuvant 65)(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Freund′s Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant)(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。仅有氢氧化铝批准用于人。一些其他的佐剂，例如母牛分枝杆菌，批准为临床试验所用。
该佐剂可以适当地为奥布分枝杆菌粗糙型菌株的细菌的全细胞。
在本领域中，已知DNA疫苗为有效的疫苗递送系统，所述DNA疫苗本质上为附着在金颗粒上的DNA序列且由氦枪打入皮肤内。不同于常规疫苗的是，这些DNA疫苗不需要传统的佐剂组分。依照本发明的另一方面，此处定义的免疫调节剂组合物可以适当地与这样的DNA疫苗联用，以增大或参与对免疫应答的影响。
药物组合物 本发明还提供了包含治疗上有效量的奥布分枝杆菌粗糙型菌株细菌全细胞的药物组合物，以及任选地包含可药用载体、稀释剂或赋形剂(包括它们的组合)。
该药物组合物可以包含两种组分-第一种组分包含抗原，第二种组分包含其佐剂。第一和第二组分可以顺序递送、同时递送或共同递送，甚至可由不同的施用途径递送。
适当地，该抗原甚至可以作为疾病过程的一部分在宿主组织内产生。因此，抗原可以来自细菌、宿主或寄生物入侵，或者可以为组织释放的物质，例如应激蛋白或肿瘤抗原。
该药物组合物可以在人类医学或兽医学上为人类或动物所应用，其通常包括可药用的稀释剂、载体或赋形剂中的任意一种或多种。用作治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药技术领域中众所周知，并由例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)所描述。药物载体、赋形剂或稀释剂可以根据设定的施用途径和标准药学实践而进行选择。该药物组合物可以包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂覆剂(coating agent)、增溶剂作为载体、赋形剂或稀释剂，或者在载体、赋形剂或稀释剂之外包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂覆剂、增溶剂。
防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂均可以加入到该药物组合物中。防腐剂的例子包括苯酸钠、山梨酸和对-羟基苯甲酸之酯类。抗氧化剂和悬浮剂也可以应用。
根据不同的递送系统，可以有不同的组合物/制剂需求。举例而言，本发明的药物组合物可以制成利用微量泵或通过粘膜途径递送的制剂，例如，作为鼻腔喷雾剂或吸入用气溶胶或可摄取溶液；或将该组合物配制成可注射的形式以肠胃外途径递送，用于例如通过静脉内、肌内、皮内或皮下途径的递送。或者，可以将制剂设计为通过以上两种途径递送。
本发明的制剂优选为可注射形式。更优选地，该制剂由皮内注射。
本发明的制剂优选为口服可接受的组合物。
当所述作用剂(agent)通过胃肠粘膜而进行粘膜递送时，它应该能在穿透胃肠道时保持稳定；例如，它应该能抵抗蛋白酶的降解，在酸性pH中稳定并抵抗胆汁的清洁作用。
该药物组合物能够在合适的时候如下施用:通过吸入施用，以栓剂或阴道栓(pessary)的形式施用，以乳液、溶液、乳霜(cream)、药膏(ointment)或扑粉(dusting powder)的形式局部施用，通过皮肤贴片的使用来施用，以包含赋形剂(例如淀粉或乳糖)的片剂形式口服施用，或者在胶囊或囊珠(ovules)中单独施用或与赋形剂混合施用，或者以包含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式施用，或者它们可以通过肠胃外(例如静脉内、肌内、皮内或皮下)注射施用。对于肠胃外施用，该组合物最好可以以无菌水溶液的方式应用，该无菌水溶液可以包含其他物质，例如含有充足的盐或单糖以使溶液与血液等渗。对于颊部施用或舌下施用，该组合物可以以能够通过常规方法制成的片剂或锭剂的形式施用。
药物组合 本发明的作用剂可以与一种或多种其他药物活性物质共同施用。举例而言，本发明涵盖了本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物与一种或多种类固醇、止痛剂、抗病毒剂、以IL-2为例的白细胞介素、或其他药物活性物质的同时治疗或顺序治疗。
应了解，这些疗法(regime)包括了物质的顺序、同时或共同施用。
免疫增强剂 术语“免疫增强剂”用于此处表示一种或多种分离或培养的细菌，当向受试者施用所述细菌时，其有益于该受试者的健康。优选地，这种益处是通过修饰该受试者的细胞免疫应答达到的。
依照本发明，免疫增强剂可以用于，例如治疗或预防受试者的免疫系统失衡，所述受试者优选儿童或老年受试者，或者用于增强受试者的免疫系统，所述受试者例如哺乳动物，尤其是家畜或人类。
该免疫增强剂可以通过食用特别设计的食物或动物饲料而施用，例如，补充了本发明细菌的猪饲料。
该免疫增强剂还可以由其他途径施用-例如直接注射。
细菌优选为灭杀的以避免活产品保存带来的困难。
调节细胞免疫应答的细菌的确定 在另一方面，本发明涉及用于确定一种或多种调节(例如修饰)细胞免疫应答的分枝杆菌属粗糙型菌株的细菌全细胞的方法，包括了以下步骤:(a)将第一只实验动物与免疫刺激剂接触；(b)将另一只实验动物与混合了所述细菌的免疫刺激剂接触；(c)检测每只实验动物的细胞免疫应答；和(d)比较每只实验动物的细胞免疫应答，其中，混合了所述细菌的免疫刺激剂相对于单独的免疫刺激剂引发了较低的细胞免疫应答，表明该细菌对细胞免疫应答的修饰。
另一方面，本发明涉及确定选自分枝杆菌属的细菌粗糙型菌株的Th1/Th2应答的方法，所述方法包括了应用结核菌素皮肤试验。在小鼠中，结核菌素皮肤试验优选在足垫上进行。在Th1优势反应中，阳性足垫免疫应答在24小时达到最大值并在48小时减弱。然而，随着Th2反应性的增加，其后在48小时阳性足垫免疫应答也增加，甚至能够超过24小时的足垫免疫应答。
BCG疫苗接种的效果已经通过结核菌素皮肤试验很好地得到了证明。因此，该测试法可以用于评估本发明免疫调节剂组合物的引入是否调节了BCG细胞免疫应答。
术语“实验动物”用于此处指的是引发对免疫刺激剂的细胞免疫应答的任何动物。优选的实验动物为哺乳动物。更优选的实验动物为大鼠、仓鼠、兔、豚鼠或小鼠。更优选的实验动物为小鼠。
该细菌优选地修饰了T辅助细胞应答。该细菌可以适当地通过减弱Th1和Th2应答而修饰T辅助细胞应答。该细菌可以适当地通过增强Th1应答和减弱Th2应答而修饰T辅助细胞应答。该细菌可以适当地在不影响Th2应答的情况下通过增强Th1应答而修饰T辅助细胞应答。
该免疫刺激剂优选地具有已知的Th1和Th2应答。例如，运用了免疫刺激剂BCG的反应通常在24小时达到最大值并在此时作为Th1应答的指示剂；该反应通常在48小时减弱，并且包含了Th2的贡献。已知BCG主要激发Th1应答。
通过应用这样的免疫刺激剂，有可能测定实验细菌的Th1/Th2应答，因此，有可能鉴定具有理想Th1/Th2应答的一种或多种细菌以治疗和/或预防特定疾病和/或病症。
细胞免疫应答优选地通过结核菌素皮肤试验而测定。免疫刺激剂的疫苗接种-例如BCG接种-在稍后的测试中引发了对结核菌素(结核杆菌(Tuberclebacilli)的可溶性制剂)的皮肤测试的应答。局部反应在不同的时间间隔测定，例如注射结核菌素后的24小时、48小时和72小时。简要地说，免疫刺激剂(例如BCG)的应用诱导了对结核菌素的正免疫应答。在实验动物中，结核菌素皮肤试验优选地在足垫上进行。在Th1优势反应中，阳性足垫免疫反应通常在24小时达到最大值并在48小时减弱。然而，随着Th2反应性的增加，其后在48小时的阳性足垫免疫应答也增加，甚至能够超过24小时的足垫免疫应答。因此，该测试法可以用于评估本发明免疫调节剂组合物的引入是否调节了细胞免疫应答。
该免疫刺激剂优选为BCG。
本发明现通过实施例进一步阐述，所述实施例旨在协助本领域技术人员实施本发明而不是限制本发明的范围。
实施例 方法 结核菌素皮肤试验 结核菌素皮肤试验是合适的模型测试，用以评估免疫调节剂组合物，即包含本发明的已灭杀全细菌细胞的细菌组合物/悬浮液对于细胞免疫应答的效果。
BCG疫苗接种引发了对结核菌素的正免疫应答。在小鼠中，该结核菌素皮肤试验优选在足垫上进行。在Th1优势反应中，阳性足垫免疫反应通常在24小时达到最大值并在48小时减弱。然而，随着Th2反应性的增加，其后在48小时阳性足垫免疫应答也增加，甚至能够超过24小时的足垫免疫反应。
BCG疫苗接种的效果已经通过结核菌素皮肤试验很好地得到了证明。因此，该测试法可以用于评估本发明免疫调节剂组合物的引入是否调节了BCG细胞免疫应答。
细菌悬浮液的制备 可将来自分枝杆菌属粗糙型菌株的细菌在发酵罐中的无抗原培养基中培养2-28天，例如苏通培养基(Sauton’s medium)。或者，可将感兴趣的细菌菌种培养在固体斜面培养基(solid slope)上。其他的方法对于本领域技术人员应该是显而易见的。
可将产生的细菌物质(bacterial mass)收获，并且可以直接使用或在清洗后在缓冲液中制备成悬浮液后使用。将细菌细胞悬浮液制备成包含每剂量100,000至10,000,000,000的杆菌(bacilli)。将该细菌细胞在水中或盐水中进行再悬浮。该盐水优选为pH8.0的硼酸缓冲盐水。该杆菌优选为已灭活的(灭杀的)，适当地通过高压灭菌器在121oC加热15分钟而达到。产生的细菌悬浮液含有全细胞。
实施例1:奥布分枝杆菌的稳定粗糙型变体的诱导 典型菌株(ATCC 27023) 奥布分枝杆菌典型菌株(type strain)ATCC 27023在国际菌种保藏中仅由该菌株代表。该菌株具有光滑的培养特性，且已知不会产生(throw)粗糙型变体。
实验1 Middlebrook 7H11琼脂上的培养 将奥布分枝杆菌典型菌株ATCC 27023在Middlebrook 7H11琼脂上进行连续传代培养6代后，仅产生了光滑型菌落。
实验2加有不同浓度4，4′-二氨基二苯砜的Middlebrook 7H11琼脂上的培养 实验2，部分a 将奥布分枝杆菌典型菌株ATCC 27023在含有不同浓度DapsoneTM(对位二氨基二苯砜)的Middlebrook 7H11培养基上培养。结果列于表1。
表1-在含有不同DapsoneTM(对位二氨基二苯砜)浓度/ml Middlebrook7H11培养基上的生长 实验2，部分b 将奥布分枝杆菌典型菌株ATCC 27023在含有不同浓度DapsoneTM(对位二氨基二苯砜)的Middlebrook 7H11培养基上培养。结果列于表2。
表2-在含有不同DapsoneTM(对位二氨基二苯砜)浓度/ml Middlebrook7H11培养基上的生长 实验2，部分c 将奥布分枝杆菌典型菌株ATCC 27023在含有不同浓度DapsoneTM(对位二氨基二苯砜)的Middlebrook 7H11培养基上培养。结果列于表3。
表3-在含有不同DapsoneTM(对位二氨基二苯砜)浓度/ml Middlebrook7H11培养基上的生长 从12μg DapsoneTM/ml培养基中小心挑取粗糙型菌落，并在不添加DapsoneTM的Middlebrook 7H11培养基中重复地传代培养。
重复的传代培养(例如，连续培养)20代后只有粗糙型菌落生长。
将使用本试验分离的粗糙型菌株按照布达佩斯条约规定以登录号NCTC13365保藏在NCTC。
实施例2:以奥布分枝杆菌治疗过的受BCG攻击小鼠中对结核菌素的DTH反应 在出生时和21日后(断奶时)，向实验组给药107杆菌/0.1ml的免疫调节剂。对照组小鼠在相同的时间接受硼酸缓冲液。
最后一次免疫接种之后的30天，在小鼠颈背部皮下接种BCG(Merieux)105杆菌/0.1ml。
28日后，以结核菌素(右后肢足垫)或盐水(左后肢足垫)0.02ml攻击(chanllege)动物。
或者，足垫的厚度也可以在实验前测定，以取代注射左后肢足垫。
DTH反应在攻击后24、48和72小时测定。
受试者数据 数值为平均值±sem 当无应答组和应答组以该方式汇总分析(pooled)时，结果无显著差异。
然而，当单独分析应答组时，显示出了显著差异。
以硼酸引发(borate-primed)的对照组和以奥布分枝杆菌粗糙型菌引发(priming)的实验结果在24h对结核菌素的+ve应答大小具有统计学上的显著性差异(p<0.005)，虽然显著性在48和72h时消失，其仍具有下降趋势。
对结核菌素的正应答表示效应细胞已被吸引至注射部位，且已释放炎性细胞因子。因此，在细胞被募集(recruit)至该部位但未释放细胞因子的负应答中，尽管感受态细胞已被召集至该部位，但肿胀可能不明显，所述肿胀主要是由对释放的细胞因子的应答引起的。
在已使用包含与实验试剂所共有的抗原的试剂免疫的动物中，应答的缺乏不代表不存在应答，而只是该实验没有检测到它。负免疫应答有可能发生，其原因是因为不能够应答或者存在应答但为负面的方式(negative sense)应答。后一种情况有可能在受BCG攻击的动物的DTH反应中出现。不希望受理论的束缚，现已相信，敏化细胞可以保持在淋巴结而不是迁移至真皮，或者它们可以到达真皮但产生了下调的细胞因子、诱导无反应性的细胞。有时，另外的试验例如淋巴细胞转化试验，能够证明对试验抗原应答的感受态循环细胞(competent circulating cells)的存在，皮肤测试的显著阴性部位的钻取活组织检查将显示这些细胞的浸润，尽管所述细胞不产生明显的肿胀。皮肤测试或足垫测试中测试阴性的受试者的比例，随着遗传和与初始引发、攻击相关的时间而改变。有大量公开证据是关于人类中这些现象的。
因此，为了分析这些试验数据，需要察看产生正应答的比例及正应答的平均大小(mean diameter)，正如我们已经做的。在两组中不存在百分比应答差异，但在应答者的应答大小中存在差异。
结论 奥布分枝杆菌(粗糙型菌株NCTC 13365)具有免疫调节的效果。
以上说明书中提到的所有刊物均通过引用结合到本文中。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，各种所描述的方法以及本发明的系统的修饰和变化对本领域的技术人员都是显而易见的。虽然本发明的描述结合了具体的优选实施例，应该理解本发明的权利要求不应过分局限于这些具体实施例。事实上，对于生物化学、免疫学或相关领域的技术人员显而易见的实施本发明所描述方法的各种修饰，均希望包含在以下权利要求的范围中。
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1.产生细菌粗糙型菌株的方法，所述方法包括将所述细菌暴露于砜和/或磺胺。
2.根据权利要求1的方法，其中所述砜和/或磺胺为4，4′-二氨基二苯砜或其类似物。
3.根据权利要求2的方法，其中所述粗糙型菌株是分离的。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述细菌在含有砜和/或磺胺的培养基中培养，砜和/或磺胺的浓度为每1ml培养基大于或等于5μg砜和/或磺胺。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细菌来自需氧分枝杆菌属。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细菌为奥布分枝杆菌。
7.通过根据权利要求1至6中任一项的方法产生的分枝杆菌属的粗糙型菌株。
8.可以通过根据权利要求1至6中任一项的方法产生的奥布分枝杆菌的粗糙型菌株。
9.奥布分枝杆菌的粗糙型菌株，其按照布达佩斯条约以登录号NCTC13365保藏在NCTC。
10.免疫调节剂组合物，其包含根据权利要求8或权利要求9的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞，其中所述免疫调节剂组合物在使用中对细胞免疫应答进行修饰。
11.根据权利要求10的免疫调节剂组合物，其中所述组合物包含抗原和佐剂，其中所述佐剂包含奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞。
12.药物组合物，其包含来自奥布分枝杆菌粗糙型菌株的全细胞和任选的可药用载体、稀释剂或赋形剂，所述药物组合物在使用中对细胞免疫应答进行修饰。
13.根据权利要求10至12中任一项的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备下述药物中的用途，所述药物用以治疗或预防以下中的一种或多种:感染(例如细菌、病毒或寄生虫感染，例如疟疾、锥虫病、利什曼病、家禽中的艾美球虫属感染和弓形虫病)和/或伴随有感染的免疫功能异常；自身免疫疾病(例如以闭塞性血管病为例的血管病症，和导致肌内膜增生和/或动脉粥样化形成(另外也称为动脉硬化)的免疫方式，关节炎和移植物排斥反应)；应激(例如严重创伤应激、心理社会应激和慢性应激)；过敏(例如包含过敏性哮喘在内的哮喘、花粉症、变应性皮炎(湿疹)、过敏性休克、由于接触或摄食植物引起的过敏、叮或刺-例如为荨麻所刺或昆虫所叮，以及昆虫所咬-例如以库蠓属(能引起马类的甜痒病)为例的蠓引起的过敏)；马气喘病，COPD和癌症(例如黑素瘤或腺癌)以及免疫系统失衡(例如儿童和大龄者的免疫系统失衡)。
14.根据权利要求10至12中任一项的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备下述药物中的用途，所述药物用以治疗或预防感染、自身免疫疾病、应激、过敏、马气喘病、COPD、癌症和免疫系统失衡中的一种或多种。
15.根据权利要求10至12中任一项的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备下述药物中的用途，所述药物用以治疗或预防对儿童期疫苗的不良反应和/或其后果。
16.根据权利要求10至12中任一项的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备下述药物中的用途，所述药物用以修饰细胞免疫应答。
17.作为药物使用的根据权利要求10至12中任一项的免疫调节剂组合物或药物组合物。
18.用于疫苗中或者作为疫苗使用的根据权利要求10至12中任一项的免疫调节剂组合物或药物组合物。
19.根据权利要求18的免疫调节剂组合物，其中所述疫苗为预防性疫苗或治疗性疫苗。
20.根据权利要求18或权利要求19的免疫调节剂组合物，其中所述组合物修饰细胞免疫应答。
21.根据前述权利要求中任一项的免疫调节剂组合物和/或药物组合物，其中所述组合物进一步包含抗原或抗原决定簇。
22.根据权利要求21的免疫调节剂组合物和/或药物组合物，其中所述抗原或抗原决定簇为选自以下中的一种或多种的抗原或抗原决定簇:BCG(卡介苗)疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、OPV(口服脊髓灰质炎疫苗)和母牛分枝杆菌，或其部分。
23.根据权利要求21或权利要求22的免疫调节剂组合物和/或药物组合物，其中所述组合物包含两种或更多种这样的抗原或抗原决定簇。
24.根据权利要求10至12和17至23中任一项的免疫调节剂组合物和/或药物组合物，其中所述细菌为杀灭的。
25.用于治疗或预防受试者体内病症的方法，包括向受试者施用有效量的根据权利要求10至12和17至23中任一项的药物组合物和/或免疫调节剂组合物，其中所述组合物调节细胞免疫应答。
26.用于免疫受试者的方法，包括施用根据权利要求10至12和17至23中任一项的药物组合物和/或免疫调节剂组合物。
27.根据权利要求25或权利要求26的方法，其中所述药物组合物和/或免疫调节剂组合物与抗原或抗原决定簇共同施用。
28.根据权利要求27的方法，其中所述抗原或抗原决定簇为选自以下中的一种或多种的抗原或抗原决定簇:BCG(卡介苗)疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、OPV(口服脊髓灰质炎疫苗)和母牛分枝杆菌，或其部分。
29.根据权利要求27或权利要求28的方法，其中所述药物组合物和/或免疫调节剂组合物与两种或更多种这样的抗原或抗原决定簇共同施用。
30.砜和/或磺胺用以产生细菌的粗糙型菌株的用途。
31.参考实施例基本上如本文所描述的方法。
32.参考实施例基本上如本文所描述的免疫调节剂或药物组合物。
33.参考实施例基本上如本文所描述的用途。
全文摘要
本发明涉及产生细菌粗糙型菌株的方法，例如奥布分枝杆菌(Mycobacterium obuense)，所述方法包括将所述细菌暴露于砜和/或磺胺(例如4，4′-二氨基二苯砜或其类似物)。由所述方法产生的奥布分枝杆菌粗糙型菌株及其应用。尤其是按照布达佩斯条约以登陆号NCTC 13365保藏在NCTC的奥布分枝杆菌粗糙型菌株的用途。
文档编号A61P37/02GK101384699SQ200680053186
公开日2009年3月11日 申请日期2006年12月19日 优先权日2005年12月21日
发明者约翰·L·斯坦福, 辛西娅·A·斯坦福, 格雷厄姆·麦金太尔, 奥斯卡·A·博塔索 申请人:生物埃欧斯有限公司