药物-聚合物的结合物的制作方法

专利名称：药物-聚合物的结合物的制作方法
药物-聚合物的结合物相关申请的交叉引用根据35U.S.C. § 119 (e)的规定本申请要求于2005年12月30日递交的 美国临时专利申请系列号No.6(V755， 459的优先权，其内容在此被引用作为 参考。
背景技术：
己经研究了两种主要的药物递送方法可以提高治疗药物分子的药效学和 药物动力学特性。 一种是修饰药物分子自身(例如，通过聚乙二醇化)而另一 种是改变药物制剂(例如，通过使用脂质体制剂)。在每种情况下，期望开发 一种能够提供药理学活性延长、副作用降低、患者依从性提高和患者生命质量 提高的药物递送机制。发明内容本发明基于一治疗多肽分子可以被偶联至一聚合物分子以形成一具有增 强功效的单个药物体(即，多肽-聚合物的结合物)的观念。一方面，本发明的特征在于一种多肽-聚合物的结合物，其包括多肽部分、 聚环氧烷部分、将多肽部分与聚环氧烷部分连接的接头(linker)、多肽部分和 该接头间的第一联接；以及聚环氧烷部分和该接头间的第二联接。多肽部分可 以含有人干扰素-a部分(g卩，保留干扰素-a活性的天然或修饰部分)和1-6(例如1-4)个在人干扰素-ci部分的N-末端的其它氨基酸残基。实例包括 國Ser-Gly-IFN 、 -Gly-Ser-IFN 、 -Met画Met-IFN 、 -Met-His-IFN 、 -Pro-IFN和 -Gly-Met-IFN，其中IFN是人干扰素-a 2b部分。干扰素-a部分可以在N-末端 包括一半胱氨酸残基。多肽部分也可包括干扰素-P部分或粒细胞集落刺激因 子。聚环氧垸部分可以含有1-20,000 Cr"Q环氧垸重复单元。聚环氧垸部分的 实例包括含有5-10,000个重复单元的聚环氧乙烷部分，例如具有数均分子量 20,000道尔顿的聚环氧乙烷部分。接头可以是CH^亚烃基、C广C8杂亚烃基、CH^环亚烃基、C3-Cs杂环亚烃基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳垸基(aralkylene) 或-Ar-X-(CH2)n-，其中Ar可以是亚芳基(例如亚苯基)或杂亚芳基，X可以 是O、 S或N(R)， R是H或C广Cuj烷基，和n可以是l-10。第一联接和第二 联接的每个可以独立地是羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸盐、尿素、 醚、硫基、磺酰基、亚磺酰基、氨基、亚氨基、羟基氨基、膦酸酯、或磷酸酯 基团。是甲氧基封端的聚环氧乙垸部分。聚环氧烷部分指线性、分支或星形部分。其是饱和或不饱和的以及是取代 的或未取代的。聚环氧垸部分的实例包括聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚环氧异 丙垸、聚环氧丁烷、及其共聚物。其它聚合物例如葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯 酰胺或碳水化合物基的聚合物也可以用来代替聚环氧烷部分，只要其不是抗原 性的、有毒的或者引发免疫反应。接头从聚环氧垸部分伸出并促进多肽部分偶联至聚环氧烷部分。 多肽部分可以包括修饰的多肽药物，只要其药学活性中至少一些被保留。 该治疗多肽部分的实例包括在N-末端含有一种或多种其它氨基酸残基的修饰 多肽分子或在其一级蛋白序列中含有对其氨基酸残基一个或多个取代的修饰 多肽分子。在酶促作用下通过切开多肽部分和接头间的联接或聚环氧垸部分和接头 间的联接可以在体内释放多肽部分(例如，通过水解)。涉及体内切开联接的 酶的实例包括氧化酶(例如，过氧化酶、胺氧化酶或脱氢酶)、还原酶(例如， 酮类还原酶)和水解酶(例如，蛋白酶、酯酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶)。无需 从多肽-聚合物结合物上切下治疗多肽部分，本发明的多肽-聚合物结合物也可 以在体内是有效的。术语"垸基"指单价、饱和、线性或分支的、非芳香碳氢化合物部分，例 如-CH3或-CH(CH3)2。术语"烯基"指含有至少一个双键的线性或分支的碳氢 化合物部分，例如-CH-CH-CH3。术语"炔基"指含有至少一个三键的线性或上述药物-聚合物的结合物的一个实例是 o，其中mPEG7分支的碳氢化合物部分，例如-C^C-CH3。术语"环垸基"指饱和的、环状的 碳氢化合物部分，例如环丙基。术语"环烯基"指含有至少一个环双键的非芳 香的、环状的碳氢化合物部分，例如环己烯基。术语"杂环烷基"指具有至少一个环上杂原子(例如N， O或S)的饱和环部分，例如4-四氢吡喃基。术语 "杂环烯基"指具有至少一个环上杂原子(例如N， O或S)和至少一个环双键的非芳香的环部分，例如吡喃基。术语"芳基"指具有一个或多个芳香环的 碳氢化合物部分。芳基部分的实例包括苯基(Ph)、萘基、芘基、蒽基和菲基。 术语"杂芳基"指具有一个或多个芳香环的部分，其含有至少一个环上杂原子(例如，N， O或S)。杂芳基部分的实例包括呋喃基、芴基、吡咯基、噻吩基、 恶唑基(oxazolyl)、咪唑基、噻唑基、卩比啶基、嘧啶基、喹唑啉基、喹啉基、 异喹啉基和吲哚基。术语"亚烃基"指二价、饱和、线性或分支的非芳香碳氢 化合物部分，例如-CH2-。术语"杂亚烃基"指具有至少一个杂原子(例如，N， O或S)的亚烃基部分，例如-CH20CH2-。术语"环亚烃基"指二价、饱和环 的碳氢化合物部分，例如环亚己基。术语"杂环亚烃基"指具有至少一个环上 杂原子的二价、饱和的非芳香环部分，例如4-四氢亚吡喃基。术语"亚芳基" 指具有一个或多个芳香环的二价碳氢化合物部分。芳基部分的实例包括亚苯基 和亚萘基。术语"杂亚芳基"指具有一个或多个含有至少一个环上杂原子的芳 香环的二价部分。杂亚芳基部分的实例包括亚呋喃基和亚吡咯基。术语"亚芳 烷基"指被芳基或杂芳基取代的二价垸基部分，其中一个电子位于垸基部分而 另一个电子位于芳基或杂芳基。亚芳烷基部分的实例包括亚苄基或吡啶亚甲 基。本文提及的垸基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、 芳基、杂芳基、亚烃基、杂亚烃基、环亚烃基、杂环亚烃基、亚芳基、杂亚芳 基和亚芳烷基包括取代和不取代的部分。环亚烃基、杂环亚烃基、亚芳基、杂 亚芳基和亚芳垸基的取代基的实例包括d Cu)烷基、C2 Cu)烯基、C2 C1() 炔基、C3 C8环烷基、C5 C8环烯基、d do垸氧基，芳基，芳氧基，杂 芳基，杂芳氧基，氨基、C, Cu)烷氨基、d C2o二烷氨基、芳氨基、二芳氨 基、羟氨基、垸氧基氨基、Q Cu)烷基磺酰胺，芳基磺酰胺，羟基，卤素， 硫基、d Cu)垸硫基，芳硫基，腈，氮，酰基，酰氧基，羧基和羧酸酯。烷 基、亚烃基和杂亚烃基的取代基的实例包括除d do烷基以外的所有上述取代基。环亚烃基、杂环亚烃基、亚芳基、杂亚芳基也可以与环烷基、杂环烷基、 芳基或杂芳基稠合。另一方面，本发明的特征在于一种多肽-聚合物的结合物，其包括多肽部 分、聚环氧垸部分、将多肽部分与聚环氧烷部分连接的接头、多肽部分和该接 头间的第一联接；以及聚环氧烷部分和该接头间的第二联接。聚环氧垸部分可以含有1-20,000 CI-C8环氧烷重复单元。接头可以是-Ar-X-(CH2)n-，其中Ar可以是亚芳基或杂亚芳基，X可以是O、 S或N(R)， R是H或C1^C10烷基，和n可以是l-10。第一联接和第二联接的每个可以独立地是羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸盐、尿素、醚、硫基、磺酰基、亚磺酰基、氨基、亚氨基、羟基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基团。另一方面，本发明的特征在于通式(I)的化合物通式(I)中，mPEG是甲氧基封端的聚环氧乙烷部分；Rp R2， R3和R4之一 是CHO取代的d Cu)烷基；其它的Rp R2， R3和R4每个独立地是H、 d Cu)烷基、C2 do烯基、C2 do炔基、C3 C2。环垸基、C3 C2Q环烯基、d C20杂环垸基、d C2。杂环烯基，芳基或杂芳基。通式(I)的化合物的子集是那些化合物，其中R2或R3是CHO取代的丙基或CHO取代的丁基。另一方面，本发明的特征在于包括干扰素-a部分(例如，人干扰素-ci2b 部分)和1-6个在干扰素-a部分的N-末端的其它氨基酸残基的多肽。实例包 括Ser-Gly-IFN、 Gly國Ser画IFN 、 Met画Met-IFN 、 Met-His-IFN 、 Pro-IFN和 Gly-Met-IFN，其中IFN是人干扰素-a 2b部分。干扰素-a部分也可以是野生型 干扰素-a部分(例如，野生型人干扰素-a2b部分)。另一方面，本发明的特征在于治疗诸如乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒 感染、和癌症(例如，毛细胞白血病或卡波西氏肉瘤)之类的各种疾病的方法。 该方法包括给予需要的受试者有效量的一种或多种上述多肽-聚合物结合物。 术语"处理"或"治疗"指给予具有上述提及的疾病、其症状、或者倾向于该病症 的受试者施用一种或多种肽-聚合物结合物，其目的在于赋予治疗效果，例如 治愈、减轻、改变、影响、改善或预防上述提及的疾病、其症状、或者该病症的倾向。本发明还包括一药物组合物，其含有有效量的至少一种上述提及的多肽-聚合物结合物和药学可接受的载体。上述多肽-聚合物结合物包括化合物自身，以及如果可适用的话，包括其 盐、前药、和溶剂化物。例如，可以在阴离子和多肽-聚合物结合物上的正电 荷基团(例如氨基)之间形成盐。适宜的阴离子包括氯化物、溴化物、碘化物、 硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐和乙酸盐。同样， 也可以在阳离子和多肽-聚合物结合物上的负电荷基团(例如羧酸酯)之间形 成盐。适宜的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子，例如四 甲基铵离子。前药的实例包括酯和其它药学可接受衍生物，其在给药于受试者 时，能够提供活性多肽-聚合物的结合物。溶剂化物是指形成于活性多肽-聚合 物的结合物与药学可接受的溶剂之间的一复合物。药学可接受的溶剂的实例包 括水、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。一种用于治疗各种上述提及的疾病的、含有一种或多种上述的多肽-聚合 物结合物的组合物，和该组合物在制造用于上述提及的治疗的药物中的应用， 也在本发明的范围内。发明的一个或多个实施方式的细节将在下述说明中提出。发明的其它特 征，目的和优点将从说明书和权利要求中显而易见。
具体实施方式
本发明涉及多肽-聚合物结合物，其中治疗多肽部分被连接至至少一种聚 合物分子。通过化学领域众所周知的合成方法可以制备多肽-聚合物结合物。例如， 可以将含有官能团(例如，苯氨基)的接头分子首先通过氨基甲酸酯联接偶联至含有羟端基的甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)聚合物上以形成一接头-聚合 物结合物。随后，在接头-聚合物结合物上的另一端基转变成醛基后，可将含 有另一官能团(例如，氨基)的治疗多肽分子(例如，人干扰素-a2b)偶联至 上述接头-聚合物结合物。为了偶联接头分子，mPEG聚合物可以用诸如琥珀 酰亚胺酯、"肖基苯酚、琥珀酰亚胺碳酸酯、三氟乙基磺酸单甲氧基(tresylate)、 马来酰亚胺、乙烯基砜、碘代乙酰胺、生物素、磷脂或荧光素的基团官能团化。作为另一实例，治疗多肽分子(例如，人干扰素-a2b)可以首先利用在其N-末端通过重组技术引入1-6个其它氨基酸残基而被修饰。修饰的人干扰素-a 2b分子可以随后被偶联至一端含有接头的甲氧基封端的聚乙二醇部分。可以通过 修饰接头以形成适当的官能团(例如，醛基)，然后将接头上的该官能团与修饰的人干扰素-Cl2b分子上的官能团(例如，末端氨基)反应而完成偶联反应。路线1上述路线1说明了制备一种上述多肽-聚合物结合物的实例。以4个化学 转变将4-硝基苯酚1首先转变成接头分子2: (a)羟基与3-氯丙-l-醇的烷基化； (b)末端羟基氧化成醛基；(c)通过形成二甲基乙縮醛保护醛基；(d)将硝 基还原成氨基。然后通过使用N， N- 二琥珀酰亚胺基碳酸酯将甲氧基封端的 聚乙二醇(mPEG)聚合物偶联至接头分子2以产生接头-聚合物的结合物3。 随后除去接头-聚合物的结合物3中的二甲基縮醛保护基团以得到含有醛基的 接头-聚合物的结合物4，其然后与修饰的人干扰素-a2b分子，Ser-Gly-IFN 偶联以形成多肽-聚合物结合物5。上述合成路线使用的化学品可包括例如溶剂、反应剂、催化剂、保护基团 和去保护基团反应剂。上述方法在本文具体描述的步骤前或步骤后可另外包括 步骤，以为了最终允许合成多肽-聚合物结合物而添加或移除适宜的保护基团。 另外，各种合成步骤可以改变的顺序或次序进行以得到目的多肽-聚合物结合 物。在合成适用的多肽-聚合物结合物中有用的合成化学转变以及保护基团方 法学(保护和去保护)是本领域已知的并且包括例如，于下面所述的R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene禾口 RG.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed.， John Wiley和Sons (1991); L. Fieser禾口 M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley和Sons (1994); 以及L Paquette， ed., Encyclopedia of Reagents forOrganic Synthesis, John Wiley和Sons (1995)及其后续版本。因此合成的多肽-聚合物结合物可以进一步通过诸如柱色谱或高压液相色 谱的方法而被纯化。本文提及的多肽-聚合物结合物可含有非芳香双键和一个或多个不对称中 心。因此，其可以是外消旋物、消旋混合物、单对映体、单个非对映体、非对 映体混合物和反式或顺式异构形式。所有该异构形式都被考虑。本发明的一个方面涉及一种给予有效量的一种或多种上述多肽-聚合物结 合物用于治疗各种疾病的方法。具体地，通过以赋予一受试者治疗效果所需的 量来给予一种或多种上述的肽-聚合物结合物而治疗疾病，所述的受试者具有 疾病、这种疾病的症状、或者倾向于这种疾病的病症，其目的在于赋予治疗效 果，例如治愈、减轻、改变、影响、改善或预防上述提及的疾病、其症状、或 者该病症的倾向。该受试者可以由卫生保健专业人士根据任何适当的诊断方法 的结果而鉴定。含有有效量的至少一种上述多肽-聚合物结合物以及药学可接受载体的药 物组合物也在本发明的范围内。如本领域技术人员所知，有效的剂量根据例如 多肽-聚合物结合物的水解速率、多肽-聚合物结合物中的治疗多肽部分、聚合 物分子量、待治疗的疾病类型、给药途径、赋形剂的使用以及与其它治疗学上 的治疗共同使用的可能性而变化。为了实践本发明的方法，具有一种或多种上述提及多肽-聚合物结合物的 组合物可以非经肠道、口服、鼻腔、直肠、局部或口腔给药。本文使用的术语 "非经肠道"指皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、 鞘内、病灶内、腹腔内、气管内或颅内注射以及任何适宜的注入技术。灭菌的可注射组合物可以是非毒性的非经肠道可接受的稀释剂或溶剂中 的溶液或悬液，例如l， 3-丁二醇的溶液。可以使用的可接受介载体和溶剂是 甘露醇、水、Ringer's溶液以及等渗压的氯化钠溶液。另外，不挥发的油通常 被用作溶剂或悬浮介质(例如，合成的单-或二-甘油酯)。脂肪酸(例如油酸) 及其甘油酯衍生物在制备注射剂时是有用的，其是作为天然药物可接受的油， 例如橄榄油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬液也可以 含有长链醇稀释剂或分散剂，或者羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它通常用 于制造药学可接受固体、液体或其它剂型的通常使用的表面活性剂(例如Tweens或Spans或其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂)也可以用于配制 的目的。口服给药的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括胶囊、片剂、乳液 和水悬液、分散剂和溶液。在片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米 淀粉。通常也添加润滑剂(例如硬脂酸镁)。对于胶囊形式的口服给药，有用 的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服给予水悬液或乳液时，活性成分可以 悬浮或溶解到与乳化剂或悬浮剂结合的油相中。如果需要，可以加入某些甜味 剂、调味剂或着色剂。根据药物配制领域公知的技术可以制备鼻用气雾剂或吸入组合物。例如， 该组合物可以被制备成一在盐中的溶液，其使用苯甲醇或其它适宜的防腐剂、 吸收促进剂以增强生物利用度、碳氟化合物、和/或本领域已知的其它增溶剂 或分散剂。具有一种或多种上述多肽-聚合物结合物的组合物也可以以用于直 肠给药的栓剂形式给予。药学可接受载体通常与一种或多种上述提及的多肽-聚合物结合物一起使 用。药物组合物中的载体必须是"可接受的"条件是其与组合物中的活性成分相 容(并优选能稳定该活性成分)并对待治疗的受试者无害。可以应用一种或多 种增溶剂作为用于递送上述提及的化合物的药学赋形剂。其它载体的实例包括 胶状氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠和D&C黄色# 10。下面的实施例被认为仅仅是说明性的并且不以任何方式限制公开文本的 其余内容。不需要进一步详细阐述，相信本领域技术人员可以基于本文的说明， 利用本发明至其最大限度。本文引用的所有文献通过引用整体被引入本文。实施例1、制备mPEG醛A -D制备mPEG醛A:步骤A:制备3- (4-硝基苯氧基)丙-l-醇将3-氯丙-l-醇(160 g, 1.69 mol)加入到含有4-硝基苯酚(329 g, 2.37 mol)) 和KOH(151 g，2.70mol)的1.4L的1: 1的乙醇-水混合物的溶液中。将该混合A. R2 = CH2CH2CHO, R3 = HB. R2 = CH2CH2CH2CHO, R3 = HC. R2 = H, R3 = CH2CH2CHO13物加热回流60h，冷却至室温，将其倒入到1N的NaOH水溶液(2.0L)中，并 用二氯甲烷(2 x 1.2 L)提取。合并有机提取物，用1N的NaOH水溶液(l.O L) 和用盐水洗涤，用无水MgS04干燥并在真空中浓縮以得到作为黄色固体的3-(4-硝基苯氧基)丙-1-醇(273 g, 82%)。 !HNMR(400固z, CDC13) 5 8.16 (d, /= 9.2 Hz, 2 H), 6.94 (d, J= 9.2 Hz, 2 H), 4.20 (t, 6.0 Hz, 2 H), 3.87—3.83 (m， 2 H): 2.10—2.04 (m， 2 H), 1.87 (t,4.0 Hz， 1 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) S 163.9: 141.2, 125.8, 114.3, 65.8， 59.1, 31.7; GC—MS (m/z)以C9HuN04: 197.2计算，发 现197, 139, 123, 109。步骤B:制备3- (4-硝基苯氧基)丙醛在0°C下，超过30 min的时间，将NaBr (18.6 g, 181.2 mmol)和TEMPO (0.85 g, 5.4 mmol)和二氯甲垸(290 mL)的混合物加入到3~(4~石肖基苯氧基)丙 一1-醇(35.7 g, 181.2 mmol)的NaOCl (240 mL,按照水和13 wt% NaOCl水溶液的1: 1的混合物)冷溶液中。当完成添加，混合物变成淡黄色并在0°C搅拌lh。分出生成的混合物后，有机层用水(300 mL)洗涤，用无水MgS04干燥并 在真空中浓縮以得到作为淡黄色液体的3- (4-硝基苯氧基)丙醛(31§,87%)。 !H NMR (400 MHz, CDC13) S 9.93 (s, 1 H), 8.24 (d, /= 9.2 Hz, 2 H)， 7.01 (d, / = 9.2 Hz, 2 H), 4.45 (t, J= 6.0 Hz， 2 H), 3.05 (t, /= 6.0 Hz, 2 H); GC—MS (m/z)以 C9H9N04: 195.2计算，发现195, 167, 139， 109, 93, 65。步骤C:制备3- (4-硝基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛将AMBERLITE lra~400 (CI)离子交换树脂(30 g)加入到3-(4-硝基苯氧基) 丙醛的甲醇(300mL)溶液中。生成混合物在室温搅拌16h并通过Celite过滤。 滤出物在真空浓縮以得到作为淡黄色固体的3- (4-硝基苯氧基)丙醛二甲基乙 縮醛(30 g, 80%)。 & NMR (400 MHz, CDC13) 5 8.17 (d, J= 9.2 Hz， 2 H), 6.94 (d, J= 9.2 Hz， 2 H)， 4.61 (t, J= 6.0 Hz, 1 H)， 4.13 (t， J= 6.4 Hz， 2 H)， 3.62 (s, 6 H)， 2.09—2.14 (m， 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 163.8, 141.4, 125.8, 114.3， 101.6， 64.8, 53.3， 32.4; GC—MS (m/z)以CuH15N03: 241.2计算，发现241, 178， 152, 75。步骤D:制备3- (4-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛将硼氢化钠(15.0 g， 0.39 mol)加入到3- (4-硝基苯氧基)丙醛二甲基乙缩 醛(30.0g, 0.12mol)和氯化铜(I) (1.2 g， 12.4 mmol)的乙醇(500mL)冷溶液中。 于60°C加热并搅拌混合物30 min，冷却至室温，用水(250 mL)稀释，真空浓 縮以除去乙醇，并用甲基f-丁基醚或MTBE(3 x 150mL)提取。合并有机提取 物，用盐水洗涤，用无水MgS04干燥并在真空中浓縮以得到粗残留物。通过 使用40%乙酸乙酯-己垸作为洗脱剂在中性氧化铝的柱色谱上纯化粗残留物以 得到作为深紫色液体的3《4-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛(19.5 g, 75%)。 NMR (400 MHz, CDC13) 5 6.74 (d, >/= 8.8 Hz， 2 H), 6.66 (d, /= 8.8 Hz, 2 H)， 4.62 (t， /= 5.6 Hz, 1 H), 3.95 (t， /= 6.0 Hz, 2 H), 3.35 (s, 6 H), 2.01—2.06 (m， 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 152.3， 139.1, 116.7， 115.6， 102.1, 64.5， 53.2, 32.8; GC—MS (m/z)以CnHnN03: 211.3计算，发现211,148,109,75。步骤E:制备mPEG醛A二甲基乙缩醛温和加热下将20 kDa线性mPEG"-OH (60.0 g， 3 mmol)溶解于300 mL干燥 的二氧六环中。溶液冷却至室温后，依次加入N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(5.0 g, 19.5 mmol)和4《二甲氨基)吡啶(2.5 g, 20.4 mmol)。反应混合物在室温搅拌 24h。然后向反应混合物中加入3《4~氨基苯氧基)丙醛二甲基乙缩醛(15.0 g, 71.0 mmol)。在室温又搅拌该混合物18h后，超过4h时间内滴加MTBE (4.5 L)。 收集生成的白色沉淀并在真空干燥以产生59.5 g粗产物，其再次溶解于二氯甲 烷(250mL)。超过4小时时间内滴加另一批MTBE(6.0L)。收集因此获得的白 色沉淀并在真空干燥以得到作为白色粉末的mPEG醛A 二甲基乙缩醛(58.0 g， 97%)。 'H NMR (400 MHz, DMSO—d6) 5 9.54 (br, 1 H)， 7.35 (d, J = 8.8 Hz, 2 H)， 6.85 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 4.56 (t, J= 5.6 Hz, 1 H)， 4.17 (t， 4.4 Hz, 2 H), 3.93 (t, 9.6 Hz, 2 H), 3.25 (s， 6 H)， 3.24 (s, 3 H)， 1.93-1.97 (m, 2 H)。步骤F:制备mPEG醛A将mPEG醛A 二甲基乙縮醛(55.0 g, 2.75 mmol)溶解于缓冲液(600 mL,柠 檬酸-HCl-NaCl, pH=2)。在室温搅拌该溶液20h并用二氯甲垸(6 x 200 mL)提 取。合并有机提取物，用盐水洗涤，用无水Na2S04干燥并在真空中浓缩至体积约350mL。然后在超过6h的时间内滴加MTBE(6.0L)。收集生成的白色沉 淀并在真空干燥以得到作为白色粉末的mPEG醛A(52.0 g, 95%)。 ^ NMR (400 MHz, DMSOd6) 5 9.73 (s， 1 H)， 9.56 (br， 1 H)， 7.36 (d, J= 8.8 Hz， 2 H), 6.86 (d, /= 8.8 Hz， 2 H), 4.23 (t, 6.0 Hz, 2 H), 4.17 (t, /= 4.8 Hz, 2 H)， 3.32 (s, 3 H), 2.83-2.87(m，2H)。制备mPEG醛B:歩骤A:制备4- (4-硝基苯氧基)丁-l-醇室温下，超过15min的时间内，将/>~硝基氟苯(10.0 g, 70.7 mmol)缓慢加 入到l， 4-丁二醇(31.9 g, 354讓ol)和氢氧化钾(5.0g， 89.1 mmol)的混合物。室 温下搅拌混合物lh。然后将其倒入水中并用二氯甲垸提取。有机提取物用盐 水洗涤，用无水MgS04干燥并在真空中浓縮以得到粗产物。粗产物从乙酸乙 酯-己烷重结晶以得到作为白色固体的4-(4-硝基苯氧基)丁-l-醇。& NMR (400 MHz, CDC13) S 8.22 (d, /= 8.8 Hz, 2 H)， 6.98 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 4.14 (t, 6.0 Hz, 2 H), 3.80—3.75 (m, 2 H)， 2.00—1.94 (m, 2 H), 1.83—1.76 (m， 2 H), 1.65—1.48 (br, 1 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 164.0, 141.4， 125.9, 114.4， 68.6, 62.3， 29.0， 25.5; GC-MS (m/z)以C10H13NO4: 211.2计算，发现211,139,123， 109, 73， 55。歩骤B:制备4- (4-硝基苯氧基)丁醛使用步骤8中所述的制备111 ￡0醛八的方法从4- (4-硝基苯氧基)丁-l-醇以81%的产率获得作为白色固体的4- (4-硝基苯氧基)丁醛。iHNMR(400 MHz, CDC13) S 9.86 (s， 1 H), 8.17 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 6.94 ((!， /= 8.8 Hz， 2 H)， 4.12 (t， 《/= 6.0 Hz, 2 H), 2.71 (t, /= 6.0 Hz， 2 H), 2.18 (m, 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 200.3， 162,8， 140.5, 124.9， 113.5, 66.7， 39.3， 20.7; GC—MS (m/z) 以C10H NO4: 209.2计算，发现209， 139, 123, 109， 71。步骤C:制备4- (4-硝基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛使用步骤<:中所述的制备111 ￡0醛八的方法从4- (4-硝基苯氧基)丁醛 以82%的产率获得作为淡黄色固体的4- (4-硝基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛。'H NMR (400 MHz, CDC13) 5 8.19 (d, /= 8.8 Hz, 2 H), 6.96 (d， /= 8.8 Hz, 2 H)， 4.62 (t, 5.6 Hz, 1 H)， 4.10 (t, J= 5.6 Hz, 2 H), 3.37 (s, 6 H), 1.90—1.93 (m, 2 H), 1.85-1.81 (m, 2 H); 13C NMR(励MHz， CDC13) 5 163.9， 141.3, 125.8， 114.3， 104.0， 68.3, 52.9， 28.9， 24.1; GC—MS (m/z)以C12H17N05: 255.3计算，发现255， 224, 192, 117， 75。步骤D:制备4- (4-氨基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛将4- (4-硝基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛(4.0g， 15.7mmol)溶解于甲醇(40 mL)中，并在10%钯碳(0.4 g)存在下在室温氢化16h。通过Celite过滤混合物 后，真空浓縮滤出物以得到粗残留物，其通过使用50%乙酸乙酯-己垸作为洗 脱剂在中性氧化铝的柱色谱上被纯化以得到作为深紫色液体的4- (4-氨基苯氧 基)丁醛二甲基乙缩醛(2.5 g, 70%)。 & NMR (400 MHz, CDC13) 5 6.70 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 6.57 (d， /= 8.8 Hz， 2 H), 4.40 (t， /= 5.6 Hz， 1 H), 3.85 (t， J= 5.6 Hz， 2 H), 3.30 (s, 6 H)， 1.78—1.73 (m, 4 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 5 151.6, 139.9, 115.9, 115.3， 104.0, 67.8, 52.4， 28.8， 24.3; GC—MS (m/z)以C12H19N03: 225.3计 算，发现225, 194, 162， 109， 85。歩骤E:制备mPEG醛B二甲基乙缩醛使用步骤E中所述的制备mPEG醛A的方法从20 kDa线性mPEG-OH和 4-(4-氨基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛以93。/。的产率获得作为白色粉末的mPEG 醛B 二甲基乙縮醛。！HNMR (400 MHz, DMSO~4) 5 9.53 (br， 1 H) 7.35 ((!， / = 8.8 Hz， 2 H), 6.84 (d, /= 8.8 Hz， 2 H), 4.40 (t, /= 5.6 Hz， 1 H)， 4.17 (t, /= 4.4 Hz, 2 H), 3.91 (t， 《/= 9.6 Hz, 2 H)， 3.24 (s, 3 H), 3.23 (s, 6 H)， 1.71—1.63 (m， 4 H)。步骤F:制备mPEG醛B使用步骤F中所述的制备mPEG醛A的方法从mPEG醛B 二甲基乙縮醛 以87%的产率获得作为白色粉末的mPEG醛B HNMR (400 MHz， DMSO~4) S 9.71 (s， 1 H), 9.54 (br， 1 H), 7.34 (d， /= 8.8 Hz, 2 H), 6.83 (d, 8.8 Hz, 2 H), 4.17 (t, /= 4.8 Hz, 2 H)， 3.91 (t， /= 6.0 Hz， 2 H)， 3.24 (s, 3 H) , 2.60~2.56 (m, 2 H), 1.97—1.93 (m,2H)。制备mPEG醛C:步骤A:制备3- (3-硝基苯氧基)丙-1-醇使用步骤A中所述的制备mPEG醛A的方法从3-硝基苯酚和3-氯-l-醇以 93%的产率获得作为淡黄色液体的3- (3-硝基苯氧基)丙-l-醇。'HNMR(400 MHz, CDC13) S 7.85 (d， /= 8.0 Hz, 1 H)， 7.78 (s, 1 H), 7.46 (t, /= 8.0 Hz, 1 H), 7.26 (d, / = 8.0 Hz， 1 H), 4.23 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 3.92 (t， / = 6.0 Hz, 2 H), 2.16—2.09 (m, 2 H); l3C NMR (100 MHz, CDC13) 5 159.3， 149.1, 129.9， 121.5, 115.7, 108.7, 65.7, 59.6,31.7。步骤B:制备3- (3-硝基苯氧基)丙醛使用步骤8中所述的制备111 ￡0醛八的方法从3- (3-硝基苯氧基)丙-l-醇以78%的产率获得作为淡黄色液体的3-(3-硝基苯氧基)丙醛。1HNMR(400 MHz, CDC13) S 9.90 (s, 1 H)， 7.85 (d， >/= 8.0 Hz， 1 H)， 7.75 (s, 1 H), 7.45 (d， J = 8.0 Hz, 1 H), 7.26~7.22 (m, 1 H)， 4.40 (t， /= 6.0 Hz, 2 H)， 2.99 (t， /= 6.0 Hz， 2 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) S 199.1， 158.9, 149.1， 130.0， 121.5, 116.1, 108.7, 62.0, 42.8; GC—MS (m/z)以C9H9N04: 195.2计算，发现195, 167， 139， 93, 65。步骤C:制备3- (3-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛使用步骤C中所述的制备mPEG醛A的方法和步骤D中所述的制备mPEG 醛B的方法从3- (3-硝基苯氧基)丙醛以45%的产率获得作为深紫色液体的 3- (3-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛。'HNMR(400MHz,CDCl3)5 7.04(t，J =8.0 Hz， 1 H), 6.33—6.24 (m, 2 H)， 6.24 (s, 1 H), 4.62 (t, /= 5.6 Hz， 1 H), 4.23 (t, 7= 4.4 Hz, 2 H)， 3.61 (br， 2 H), 3.36 (s, 6 H), 2.08—2.03 (m， 2 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) 5 159.9, 147.6, 130.0， 107.9, 104.5， 102.1， 101.6， 63.6, 53.3, 32.8; GC-MS (m/z)以C H17N03: 211.2计算，发现211, 196， 164, 148, 109, 75。步骤D:制备mPEG醛C二甲基乙縮醛使用步骤E中所述的制备mPEG醛A的方法从20 kDa线性mPEG-OH和 3-(3-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛以95y。的产率获得作为白色粉末的mPEG醛C 二甲基乙缩醛。NMR (400 MHz, DMS0^6) 5 9.72 (br, 1 H), 7.17—7.13 (m, 2 H), 7.01 (d， /= 8.0 Hz, 1 H), 6.85 (d, 8.0 Hz, 1 H), 4.95 (t, /= 5.6 Hz, 1 H)， 4.53 (t， 4.8 Hz， 2 H), 3.95 (t， /= 9.6 Hz, 2 H)， 3.26 (s, 3 H)， 3.24 (s, 6 H)， 2.00—1.95 (m，2H)。步骤E:制备mPEG醛C使用步骤F中所述的制备mPEG醛A的方法从mPEG醛C 二甲基乙縮醛 以95%的产率获得作为白色粉末的mPEG醛C。 & NMR (400 MHz， DMSO-^) S 9.72 (s, 1 H)， 9.69 (br， 1 H), 7.20 - 7.13 (m, 2 H), 7.01 (d, 8.0 Hz, 1 H), 6.55 (d, /= 8.0 Hz, 1 H), 4.244.07 (m, 4 H), 3.24 (s, 3 H), 2.87 (t, /= 8.0 Hz， 2 H)。制备mPEG醛D:步骤A:制备4- (3-硝基苯氧基)丁-l-醇使用步骤A中所述的制备mPEG醛A的方法从3-硝基苯酚和2-[(4-氯丁 基)氧基]四氢吡喃以81%的产率获得4- (3-硝基苯氧基)丁-l-醇，随后在乙 醇中与浓硫酸回流反应0.5h。 &NMR (400 MHz, CDC13) S 7.79 (d， /= 8.0 Hz, 1 H)， 7,71 (s， 1 H), 7.41 (t, J= 8.0 Hz, 1 H)， 7.26—7.19 (m, 1 H), 4.08 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 3.73 (t, /= 6.4 Hz， 2 H), 1.96~1.90 (m, 2 H)， 1.89—1.71 (m, 2 H);GC-MS (m/z)以C10H13NO4: 211.2计算，发现211, 139， 123， 109， 93, 73, 55。步骤B:制备4- (3-硝基苯氧基)丁醛使用步骤8中所述的制备!11 ￡0醛八的方法从4- (3-硝基苯氧基)丁-l-醇以78%的产率获得4-(3-硝基苯氧基)丁醛。& NMR (400 MHz, CDC13) S 9.86 (s, 1 H), 7.82 (d, /= 8.0 Hz, 1 H), 7.71 (s, 1 H), 7.42 (t, 8.0 Hz， 1 H), 7.22—7.19 (m, 1 H)， 4.09 (t， /= 6.0 Hz， 2 H)， 2.70 (t, /= 7.0 Hz， 2 H), 2.20—2.14 (m, 2 H)。步骤C:制备4- (3-氨基苯氧基)丁酸二甲基乙縮醛依次使用步骤C中所述的制备mPEG醛A的方法和步骤D中所述的制备 mPEG醛B的方法从4- (3-硝基苯氧基)丁醛以52%的产率获得4- (3-氨基苯 氧基)丁醛二甲基乙縮醛。！H NMR (400 MHz, CDC13) S 7.10~7.04 (m, 1 H),6.94~6.33 (m, 3 H), 4.43 (t, /= 5.6 Hz, 1 H), 3.92 (t, J= 6.4 Hz, 2 H)， 3.34 (s， 6 H) 1.82-1.78 (m， 4 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) 5 160.1, 164.5， 130.1，跳3, 105.3, 104.3, 102.1， 67.3， 52.8, 29.1, 24.5; GC—MS (m/z)以C12H19N03: 225.3计 算，发现225， 194, 164， 109,85。歩骤D:制备mPEG醛D二甲基乙縮醛使用歩骤E中所述的制备mPEG醛A的方法从20 kDa线性mPEG-OH和 4-(3-氨基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛以90。/。的产率获得作为白色粉末的mPEG 醛D 二甲基乙縮醛。'H NMR (400 MHz, DMS0^6) S 9.71 (br, 1 H), 7.16—7.12 (m， 2 H)， 7.01 (d, 8,8 Hz, 1 H)， 6.54 (d， 《/= 8.8 Hz, 1 H), 4.95 (t, /= 5.6 Hz, 1 H)， 4.20 (t， /= 4.8 Hz, 2 H)， 3.92 (t, J= 6.0 Hz， 2 H)， 3.25 (s， 6 H)， 3.24 (s， 3 H)， 1.71—1.64 (m, 4 H)。步骤E:制备mPEG醛D使用步骤F中所述的制备mPEG醛A的方法从mPEG醛D 二甲基乙縮醛 以95%的产率获得作为白色粉末的mPEG醛D。 iH NMR (400 MHz, DMSO~4) S 9.72 (s, 1 H)， 9.70 (br， 1 H), 7.16~7.13 (m, 2 H), 7.01 (d, 8.8 Hz, 1 H), 6.53 (d， /= 8.8 Hz, 1 H)， 4.20 (t， ■/= 4.4 Hz, 2 H)， 3.92 (t， /= 6.0 Hz， 2 H)， 3.24 (s， 3 H)， 2.74—2.61 (m, 2 H), 1.98—1.91 (m, 2 H)。实施例2、制备Ser-Gly-IFN使用人基因组DNA作为模板利用PCR方法克隆修饰的重组人干扰素 ^x2b，艮卩Ser-Gly-IFN。基于人干扰素~01215的侧翼序歹U(GenBank登陆号弁 NMJ)00605)合成寡核苷酸。得到的PCR产物亚克隆到pGEM-T载体 (Promega)。通过pGEM-T克隆再次PCR扩增IFN变体并随后利用Ndel/BamHI 作为克隆位点亚克隆到蛋白表达载体pET-24a (Novagen)， 一种T7 RNA聚合 酶启动子驱动载体。然后将载体pET-24a转化到五.co" BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene)株系。通过于卡那霉素(50吗/mL)和氯霉素(50 pg/mL) 存在下保持转化的co" BL21~CodonPlus (DE 3卜RIL来筛选高表达克隆。使用极品肉汤培养基(BD, 200 mL)在一个1000 mL的烧瓶中繁殖BL21—CodonPlus (DE 3)~RIL和Ser-Gly-IFN基因。烧瓶在37°C以230rpm摇 荡16h。在5L发酵罐(Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison， NJ)中 进行分批和补料-分批发酵。分批发酵使用150 mL过夜预培养的接种物和3 L 带有卡那霉素(50 |ig/mL)、氯霉素(50ug/mL)、 0.4%丙三醇和0.5% (v/v)痕量 元素(IO g/L的FeS04 *7H20， 2.25 g/L的ZnS04 '71120， 1 g/L的CuS04 '5{120， 0.5 g/L的MnS04 H20， 0.3 g/L的H3B03, 2 g/L的CaCl2 2H20, 0.1 g/L的 (NH4)6Mo7024,0.84 g/L EDTA， 50 ml/L HC1)的极品肉汤培养基。溶解的氧气浓 度控制在35%而通过加入5N的NaOH水溶液将pH保持在7.2。制备含有600 g/L葡萄糖和20 g/L的MgS04 7H20的供料溶液。当pH升高至高于设置点 的数值，加入适当体积的供料溶液以提高培养物肉汤中的葡萄糖浓度。通过加 入IPTG至终浓度ImM诱导Ser-Gly-IFN基因的表达并在培育3h后收集培养 物肉汤。用大约比例1:10 (湿重g/mL)的TEN缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)， lmMEDTA， 100 mM NaCl)重悬浮收集的细胞团，并利用微射流机破碎，然 后于lO，OOOrpm离心20min。用TEN缓冲液冲洗含有包涵体(IB)的团粒2 次并按上述离心。然后在150 mL的4 M盐酸胍(GuHCl)水溶液中悬浮含IB 的团粒并在20,000 rpm离心15min。然后在50 mL的6 M GuHCl溶液中溶解 该IB。 GuHCl溶解的材料然后在20,000 rpm离心20min。通过在1.5 L新制备 的重折叠缓冲液(100mMTris-HCl(pH8.0)， 0.5ML-精氨酸，2mMEDTA)中 稀释变性的IB开始重折叠，该缓冲液只在加入时搅拌。允许重折叠反应混合 物在不搅拌下混合48h。用20 mM Tris缓冲液(带有2 mM EDTA和0.1M尿素， pH 7.0)透析重折叠的重组人干扰素^0C2b(即，Ser-Gly-IFN)用于Q~Sepharose 柱色谱进一步纯化。将重折叠后的重组人蛋白Ser-Gly-IFN上样到Q~Sepharose柱(GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA)。柱被预平衡并用20 mM Tris-HCl缓冲液 (pH 7.0)冲洗。产物用20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)和200 mM NaCl的混合 物洗脱。含有Ser"Gly-IFN的流分基于其吸收在280 nm收集。通过蛋白检测 试剂盒利用Bradford方法(Pierce, Rockford, IL)确定Ser-Gly-IFN的浓度。实施例3、 mPEG醛A和Ser-Gly-IFN的结合包括mPEG醛A和Ser~Gly-IFN的代表性多肽-聚合物结合物按下述制备 将上述实施例2中制备的Q~Sepharose纯化的Ser~Gly-IFN (1 mg)与 mPEG醛A—起处理。最终的反应混合物含有50mM磷酸钠(pH6.0)， 5 mM 硼氢化氰钠(Aldrich, Milwaukee, WI)和lOmg的mPEG醛A。然后在室、温i咅 育该混合物20h以形成作为主要产物的单-PEG化的Ser^ly-IFN，然后用SP XL Sepharose色谱(GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA)纯化其。具体i也， 用20 mM乙酸钠(pH 5.4)预平衡和冲洗SP柱。然后用含有20 mM乙酸钠(pH 5.4)和60 mM NaCl的缓冲液洗脱单-PEG化的Ser-Gly-IFN。未反应的IFN(即 Ser-Gly-IFN)通过含有20 mM乙酸钠(pH 5.4)和200 mM NaCl的缓冲液洗脱。 通过12%的十二垸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的凝胶电泳分析被洗脱流分并且 通过考马斯亮蓝染色R-250和银染检测该信号。基于其保留时间和在280 nm 的吸收收集含单-PEG化的Ser-Gly-IFN的流分。通过蛋白检测试剂盒利用 Bradford方法(Pierce， Rockford， IL)确定单-PEG化的Ser-Gly-IFN的浓度。单 -PEG化的Ser-Gly-IFN的分离产率是30% 40%。实施例4、单-PEG化的Ser-Glv-IFN的物理特性和生物学特性利用Ser~Gly-IFN和单-PEG化的Ser-Gly-IFN的胰蛋白酶的肽图谱确定 上述PEG化反应的专一性。真空干燥100吗每种化合物的样品并在60 pL的 8 M尿素/0.4 M NH4HC03溶液中重组成。用还原剂和吲哚乙酸处理后，用来 自Promega的胰蛋白酶(测序级)消化该溶液。收集进样并注射到C18 HPLC 柱。利用在0.1% TFA-H20中含有0-70%乙腈的75-min梯度洗脱剂分离生成 的胰蛋白酶肽。来自Ser"Gly-IFN和单-PEG化的Ser-Gly-IFN样品中的肽流 分通过其在214nrn的吸收率检测并手工收集，用Speed-Vac系统干燥，以及 进行MALDI-TOF分析。来自两种样品的数据比较显示PEG化反应的主要位 点发生在Ser-Gly-IFN的N-末端。在被水泡性口炎病毒(VSV)攻击的牛肾上皮细胞(MDBK)中检测单-PEG 化的SeM31y-IFN和其他修饰的人IFN-ot2b变体的单-PEG化产物(即单-PEG 化画Gly-Ser画IFN,画Met画Met画IFN,誦Met-His誦IFN, -Pro画IFN禾口國Gly國Met画IFN)的抗病 毒活性。通过向检测中加入四唑盐WST-1然后从存活细胞酶的甲暨的形成确 定感染细胞的细胞病变效应(CPE)。对每种浓度利用三重复数据值进行CPE生物检测。基于提供50%细胞保护(EC5Q，即50%细胞病变效应)的浓度计算所有这些单-PEG化修饰的人IFN"(X2b化合物的特异性抗病毒活性。CPE抗病毒 生物检测的结果以IU/mg单位使用Roferor^作为参考标准报告。结果显示单 -PEG化的Ser-Gly-IFN的CPE生物活性是2.0 x 1(f而其它单-PEG化的人 IFN-0C2b变体的CPE生物活性在8.3 x io6 2.9 x 107 IU/mg的范围内。其它实施方式本说明书中公开的所有特征可以以任何结合来组合。本说明书中公开的每 种特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代特征所代替。因此，除非另有 说明，公开的每种特征仅仅是通用的等效或类似特征系列的实例。从上述说明中，本领域技术人员可以轻易地确定本发明的必要特征，并且 可以对发明进行各种改变和修改以使其适用于各种用途和条件而不背离其精 神和范围。因此，其它实施方式也在下述权利要求的范围内。
权利要求
1、一种多肽-聚合物的结合物，包括多肽部分；聚环氧烷部分；将多肽部分与聚环氧烷部分连接的接头；多肽部分和接头间的第一联接；以及聚环氧烷部分和接头间的第二联接；其中多肽部分含有人干扰素-α部分和在人干扰素-α部分的N-末端的1-6个其它氨基酸残基；聚环氧烷部分含有1-20,000 C1-C8环氧烷重复单元；接头是C1-C8亚烃基、C1-C8杂亚烃基、C3-C8环亚烃基、C3-C8杂环亚烃基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳烷基或-Ar-X-(CH2)n-，其中Ar是亚芳基或杂亚芳基，X是O、S或N(R)，R是H或C1-C10烷基，和n是1-10；和第一联接和第二联接的每个可以独立地是羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸盐、尿素、醚、硫基、磺酰基、亚磺酰基、氨基、亚氨基、羟基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基团。
2、 根据权利要求l所述的结合物，其中所述人干扰素-a部分是人干扰素-Q2b部分。
3、 根据权利要求2所述的结合物，其中所述多肽部分是-Ser-Gly-IFN，其 中IFN是人干扰素-ct2b部分。
4、 根据权利要求3所述的结合物，其中所述聚环氧垸部分是含有5-10,000 个重复单元的聚环氧乙垸部分。
5、 根据权利要求4所述的结合物，其中所述聚环氧乙垸部分具有数均分 子量20,000道尔顿。
6、 根据权利要求5所述的结合物，其中所述接头是-Ar-X-(CH2)r。
7、 根据权利要求6所述的结合物，其中所述Ar是亚苯基。
8、 根据权利要求7所述的结合物，其中所述X是O。
9、 根据权利要求8所述的结合物，其中所述n是3。
10、 根据权利要求9所述的结合物，其中所述第一联接是氨基而第二联接是氯基甲酸酯基。
11、 根据权利要求10所述的结合物，其中所述结合物是<formula>formula see original document page 3</formula>，其中mPEG是甲氧基封端的聚环氧乙垸部分。
12、 根据权利要求1所述的结合物，其中所述聚环氧垸部分是含有5-10,000 个重复单元的聚环氧乙烷部分。
13、 根据权利要求12所述的结合物，其中所述聚环氧乙垸部分具有数均 分子量20,000道尔顿。
14、 根据权利要求1所述的结合物，其中所述接头是-Ar-X-(CH2)n-。
15、 根据权利要求14所述的结合物，其中所述Ar是亚苯基。
16、 根据权利要求15所述的结合物，其中所述X是O。
17、 根据权利要求16所述的结合物，其中所述n是3。
18、 根据权利要求1所述的结合物，其中所述第一联接是氨基而第二联接 是氨基甲酸酯基。
19、 根据权利要求1所述的结合物，其中所述人干扰素-a部分具有在N-末端的半胱氨酸残基。
20、 一种多肽-聚合物的结合物，包括 多肽部分；聚环氧垸部分；将多肽部分与聚环氧烷部分连接的接头； 多肽部分和接头间的第一联接；以及 聚环氧垸部分和接头间的第二联接；其中聚环氧烷部分含有1-20,000 CH^环氧烷重复单元；接头是 -Ar-X-(CH2)n-，其中Ar是亚芳基或杂亚芳基，X是O、 S或N(R)， R是H或 CH^烷基，和n是1-10;和第一联接和第二联接的每个可以独立地是羧酸酯、 羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸盐、尿素、醚、硫基、磺酰基、亚磺酰基、氨 基、亚氨基、羟基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基团。
21、 根据权利要求20所述的结合物，其中所述Ar是亚苯基。
22、 根据权利要求21所述的结合物，其中所述X是O。
23、 根据权利要求22所述的结合物，其中所述n是3。
24、 根据权利要求20所述的结合物，其中所述多肽部分含有人干扰素-a部分和在人干扰素-a部分的N-末端的1-6个其它氨基酸残基。
25、 根据权利要求20所述的结合物，其中所述多肽部分含有干扰素-3部分或粒细胞集落刺激因子。
26、 一种通式(I)的化合物其中mPEG是甲氧基封端的聚环氧乙垸部分；R2， R3和R4之一是CHO取代的C, Cu)烷基；以及 其它的Rp R2， R3和R4的每个独立地是H、 d Cu)烷基、C2 do烯基、C2 d。炔基、C3 C加环烷基、C3 C20环烯基、C! C20杂环烷基、C, C20烯基，芳基或杂芳基。
27、 根据权利要求26所述的化合物，其中所述mPEG含有5-10,000个重复单元。
28、 根据权利要求27所述的化合物，其中所述mPEG具有数均分子量 20,000道尔顿。
29、 根据权利要求26所述的化合物，其中所述R2是CHO取代的丙基或 CHO取代的丁基。
30、 根据权利要求26所述的化合物，其中所述R3是CHO取代的丙基或 CHO取代的丁基。
31、 一种多肽，其包括干扰素-a部分和在干扰素-ci部分的N-末端的1-6个其它氮基酸残基。
32、 根据权利要求31所述的多肽，其中所述干扰素-a部分是人干扰素-a部分。
33、 根据权利要求32所述的多肽，其中所述人千扰素-a部分是人干扰素 -a2b部分。
34、 根据权利要求33所述的多肽，其中所述人干扰素-a部分具有在N-末端的半胱氨酸残基。
35、 根据权利要求34所述的多肽，其中所述人干扰素-a部分是野生型干扰素-a部分。
36、 根据权利要求31所述的多肽，其中所述多肽是Ser-Gly-IFN、 Gly隱Ser-IFN、 Met-Met-IFN、 Met-His-IFN、 Pro-IFN或Gly画Met-IFN，其中IFN是人干扰素-Cl2b部分。
37、 根据权利要求31所述的多肽，其中所述干扰素-a部分是野生型干扰 素-a部分。
全文摘要
本发明涉及一种多肽-聚合物的结合物，其包括多肽部分、聚环氧烷部分、将多肽部分与聚环氧烷部分连接的接头、多肽部分和接头间的第一联接、以及聚环氧烷部分和接头间的第二联接。
文档编号A61K39/00GK101405024SQ200680053048
公开日2009年4月8日 申请日期2006年12月29日 优先权日2005年12月30日
发明者劳伦斯·I·吴, 布赖恩·T·吴, 沈立明, 邓克立, 高国席 申请人:药华医药股份有限公司