钠0. 2 %、磷酸氢二钾0. 1 %、氯化钾0. 05 %、硫酸镁0. 05 %、硫酸亚 铁 0. 001%，pH 自然。
[0118] 上述均为质量百分比。
[0119] 2 方法
[0120] 2. 1发酵培养基及发酵时间确定
[0121] 分别选用A、B配方在30°C、180r/min条件下振荡培养2d、5d，取样测定发酵液中 GOD酶活，选取GOD酶活最高的配方及发酵时间。
[0122] 2. 2种子液的制备
[0123] 将斜面复苏的菌种挑至种子培养基中，30°C、180r/min条件下振荡培养2d即得液 体种子。
[0124] 2. 3不同接种量对目的菌株产酶性能的影响
[0125] 选取2%、4%、6%、8%(体积分数）4个水平的不同接种量在30°(：、18(^/1^11条件 下振荡培养5d进行产酶性能测定，研究接种量对目的菌株产酶性能的影响。
[0126] 2. 4发酵条件的优化
[0127] 2. 4. 1孢子悬液的制备
[0128] 将斜面培养基中的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三 角瓶中，于摇床上震荡20min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球 计数板进行计数，稀释成10 scfu/mL的孢子悬液。
[0129] 2. 4. 2采用正交法对发酵培养基进行优化
[0130] 以筛选出的发酵培养基4个组份设计一个4因素3个水平的正交试验，对筛选的 目的菌株进行发酵培养，取样测定产酶性能，得到一个最佳发酵培养基配方。
[0131] 2. 4. 3冻干粉制备及酶活测定
[0132] 制备种子液，以最优接种量接种至发酵罐（IOL)，30°C、180r/min条件下振荡培养 5d，将发酵液离心并冷冻干燥，将冷冻干燥后的菌粉粉碎取部分加灭菌纯净水回溶测定酶 活。
[0133] 3结果与分析
[0134] 3. 1采用两种培养基验证菌株的产酶性能，结果如表7、8所示。
[0135] 表7A配方（葡萄糖含量为8 % )菌株产酶结果
[0137] 表8B配方（葡萄糖含量为6% )菌株产酶结果
[0139] 由表7、8可知，用葡萄糖含量不同的培养基进行产酶性能测定，结果显示两种配 方发酵5d酶活皆高于发酵2d的酶活，且A配方发酵5d的酶活为9. 6U/mL，高于B配方的 6. 39U/mL。所以选定A配方，发酵5d进行后续试验。
[0140] 3. 2不同接种量对菌株产酶性能影响
[0141] 选取2 %、4%、6 %、8 % (体积分数）4个水平的不同接种量进行产酶性能测定，结 果如表9所示。
[0142] 表9不同接种量对菌株产酶性能影响
[0144] 由表9可以看出，接种量对菌株BLCC6-0006产GOD性能影响差异不显著，综合考 虑接种量以4%比较好。
[0145] 3. 3发酵培养基配方的优化
[0146] 以筛选出的发酵培养基中的4种组份作为正交试验的4个因素，设计一个4因素 3水平的正交试验，以产酶性能为测定指标，进一步优化培养基各组份的添加量。正交试验 因素水平表见表10。
[0147] 表10正交试验因素水平表
[0149] 正交试验结果见表11。
[0150] 表11产酶性能发酵条件优化结果分析表
[0153] 由表11可以看出，不同因素水平组合，发酵液酶活不同，经对发酵条件9种正交 筛选，且对结果进行分析可以看出，4个因素的添加量对产酶影响的顺序是KH 2P04>NaN03> 葡萄糖〉蛋白胨，由极差分析表可得各组份添加量分别为葡萄糖8%、蛋白胨0.3%、 KH2PO4O. 4%、NaNO3O. 4% 〇
[0154] 通过对正交表分析得出的产酶性能较好的组方5、7以及理论最优组方（A)进行产 酶性能验证，结果如表12所示。
[0155] 表12正交筛选的配方进行产酶性能验证
[0157] 由表12可以看出，BLCC6-0009发酵5d酶活可达10. 91U/mL。筛选出的最佳培养 基配方为：葡萄糖：10%、蛋白胨0. 1 %、磷酸二氢钾0.4%、硝酸钠0.4%、硫酸镁0.07%、 氯化钾0. 05 %、碳酸钙0. 07 %，pH自然。
[0158] 综上，经优化得到的菌株BLCC6-0009的发酵条件为：菌株BLCC6-0009的接种量为 4%，发酵时间为5d，发酵培养基的组成为：葡萄糖：10%、蛋白胨0. 1%、磷酸二氢钾0.4%、 硝酸钠〇. 4%、硫酸镁0. 07 %、氯化钾0. 05 %、碳酸钙0. 07 %，pH自然。
[0159] 3. 4菌株BLCC6-0009大培养发酵液及冻干粉酶活测定
[0160] 在优化的发酵条件下对菌株BLCC6-0009进行大培养（100mL/500mL)测定发酵液 及冻干粉酶活，结果如表13、14所示。
[0161] 表13菌株BLCC6-0009发酵液酶活
[0163] 表14菌株BLCC6-0009冻干粉酶活
[0165] 注：BLCC6-0009-1、BLCC6-0009-2 为菌株 BLCC6-0009 的两个重复。
[0166] 由表13及14可以看出BLCC6-0009大培养（100mL/500mL)发酵液及冻干粉酶活 测定结果显示该菌株的产酶性能较稳定，发酵液及冻干粉酶活分别为10. 225U/mL及150U/ g°
[0167] 现有的产葡萄糖氧化酶的菌株，由于产酶量低，需要对发酵液进一步的分离、纯化 得到葡萄糖氧化酶；而采用本发明的黑曲霉菌株BLCC6-0009经扩大培养后制备的冻干粉， 酶活高达150U/g，可直接作为饲料酶制剂进行使用，无需进一步的分离纯化，具有较好的工 业应用价值。
【主权项】
1. 一株高产葡萄糖氧化酶的黑曲霉，其为黑曲霉（Aspergillusniger)BLCC6-0009， 已于2015年12月04日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M 2015722〇2. 权利要求1所述的黑曲霉BLCC6-0009在葡萄糖氧化酶发酵生产中的应用。3. -种菌剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述黑曲霉BLCC6-0009或其发酵 产物。4. 权利要求1所述的黑曲霉BLCC6-0009和/或权利要求3所述的菌剂在制备饲料酶 制剂中的应用。5. -种葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征在于，步骤为：在发酵培养基中发酵权利要 求1所述的黑曲霉BLCC6-0009,即得到葡萄糖氧化酶发酵液。6. 根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖 10 %、蛋白胨〇. 1 %、磷酸二氢钾〇. 4%、硝酸钠0. 4%、硫酸镁0. 07 %、氯化钾0. 05 %、碳酸 钙0. 07%，均为质量百分比，pH自然。7. 根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，发酵的温度为25-35Γ，发酵的时间 为 96-120h。8. 根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，黑曲霉BLCC6-0009的接种量为 3-5 % 〇9. 根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，在所述发酵前，还包括如下步骤： 将黑曲霉BLCC6-0009的斜面种子接种在灭菌后的种子培养基中，在25-35°C、180r/min培养2d，得到液体种子液。10. 根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述种子培养基的组成为： 蔗糖3 %、硝酸钠0. 2 %、磷酸氢二钾0. 1 %、氯化钾0. 05 %、硫酸镁0. 05 %、硫酸亚铁 0. 001%，均为质量百分比，pH自然。
【专利摘要】本发明公开了一株高产葡萄糖氧化酶的黑曲霉菌株，其为黑曲霉(Aspergillus？niger)BLCC6-0009，已于2015年12月04日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC？NO:M？2015722。本发明还公开了一种葡萄糖氧化酶的生产方法，在发酵培养基中发酵权利要求1所述的黑曲霉BLCC6-0009，即得到葡萄糖氧化酶发酵液。本发明筛选得到的黑曲霉菌株，具有葡萄糖氧化酶产量高的优势，可用于制备饲料酶制剂。CCTCC NO: M 201572220151204
【IPC分类】A23K20/189, C12R1/685, C12N9/04, C12N1/14
【公开号】CN105385609
【申请号】CN201510988872
【发明人】单宝龙, 陈雷, 谷巍, 徐海燕, 辛国芹, 王红, 汪孟娟, 赵影, 董佩佩, 汪祥燕, 谢全喜, 王春凤
【申请人】山东宝来利来生物工程股份有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月24日