一种适用于室外的规模化光自养双阶段培养产油绿藻的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微藻生物技术领域、能源领域、环境领域，具体涉及一种适用于室外的 规模化光自养双阶段培养产油绿藻的方法。
【背景技术】
[0002] 化石能源储存量日益缩减及其引起的环境问题和二氧化碳减排的需求增加，可再 生的生物质能源成为世界能源结构战略调整的一个重要方向。微藻因不与农作物争地、光 合效率高、油脂含量高、可多季节培养等优势，被认为是当今生产生物柴油最好的原料。但 室内的优良藻株如何走出实验室，在室外条件下如何进一步筛选、进一步放大培养规模、有 效的提高油脂生产率等都还无法做到。因此要实现产业链，还有很长的路要走。
[0003] 同时在室外较大规模的培养条件下，采用价格低廉的培养原料是降低成本的重要 环节。在微藻的营养元素中，其中氮源是一种不可缺少的大量成分，而在各种氮源中，以铵 盐，硝酸盐以及尿素较为常见。而在这些氮源当中，尿素的价格相对低廉，因此是首选的氮 源营养。为了进一步提高微藻的油脂含量，目前主要采用方法是通过营养盐的缺失或者协 迫处理，如氮限制，磷限制，盐协迫、等等。但在这种情况下，其生长速度受到一定程度的限 制，最终藻细胞密度相比营养充足条件下较低，结果就导致了低的油脂生产率。
[0004] 有人用两阶段方法对 Nannochloropsis oculata 进行了诱导[Su, C. H.，Chien, L. J. , Gomes, J. , Linj Y. S. , Yuj Y. K. , Liouj J. S. , Syuj R. J. 2011. Factors affecting lipid accumulation by Nannochloropsis oculata in a two-stage cultivation process.J Appl Phycol，23 (5)，903-908]，当到达一定生物量以后，通过离心的方式收获藻体然后把 这些藻培养于缺氮培养基诱导油脂积累。但是，在整个培养过程中，通过离心收获藻体并置 于无氮培养基条件这个过程，成本很高，如果在大规模培养情况下进行这种操作是不可取 的。因此选用操作简便的两阶段诱导油脂积累很有必要，并且通过自养的两阶段诱导培养 产油微藻方面至今未有相关报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明提出了一种适用于室外的规模化光自养双阶段培养产油绿 藻的方法，本发明的方法简单易行，其明显缩短培养时间，节约培养成本，并且操作便利。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0007] -种适用于室外的规模化光自养双阶段培养产油绿藻的方法，包括：
[0008] 当大型培养装置中的产油藻达到0. 8-1. 5g/L时，添加 CH3COONa和NaCl，使其终浓 度分别为〇. 012-0. 12M和0. 017-0. 34M，同时保持光照，诱导1-3天，收集藻液。
[0009] 所述的光照，其光照强度彡400 μ mol m 2S \平均每天光照时间为8_13h ;
[0010] 所述的大型培养装置为多140升的培养装置；
[0011] 所述的大型培养装置架设于室外温室中；室外温室包括但不限于由玻璃、阳光板、 透光薄膜等透光材料组成。
[0012] 以上所述的方案中，优选的，所述的产油藻为小球藻属（包括普通小球藻 Chlorella Vulgaris、蛋白核小球藻chlorella pyrenoidsa等）、单针藻属（包括戴伯单针 藻Monoraphidium dybowskii、极小单针藻Monoraphidium pusiIlum 等）、纤维藻属（包括 镰形纤维藻Ankistrodesmus falcatu等）、栅藻属（包括斜生栅藻Scenedesmus obliquus、 四尾概藻 Scenedesmus quadricauda)、链带藻属（Desmodesmus intermedius) 〇
[0013] 以上所述的方案中，优选的，所述的大型培养装置为140L柱状光生物反应器， 装液量为120L，小球藻接种OD为0. 3。二氧化碳通气量为6L/min，温室内温度控制在 20-38°C，通过CO2控制藻液的pH在8. 70-9. 15,当藻液浓度为I. 5g/L时，向柱状反应器中 加入终浓度为0. 17M的CH3COONa和终浓度为0. 12M的NaCl，光照，诱导2天。
[0014] 以上所述的方案中，优选的，所述的大型培养装置为5. 04m2的跑道池（规格为 4. 8 (长）X 1. 05 (宽）X 0. 5 (深）），小球藻培养深度为20cm，跑道池的装液量是1000L，搅拌 转速为〇. 3m/s，搅拌时间段为8:00-17:00,同时在此时间段辅助以人工搅拌，即用地板刷 每隔4小时对跑道池中的藻液推动一次，控制光强< 800 μ mol m 2S \其余时段静置培养， 当5. 04m2跑道池中的藻液OD达到0. 4时不需控制光强，培养到藻液浓度为1.0 g/L时向跑 道池中加入终浓度为0. 17M的CH3COONa和终浓度为0. 12M的NaCl，光照，诱导2天。
[0015] 以上所述方案中，优选的，小球藻的培养基配方包括： 化学成分 ing/fL 尿素綱. K7HPO4 46 .MgSQ^OT2Q 75
[0016] Ni-n.COi 20 GiC.l，2H:0 3(， 柠檬酸 6 柠檬酸铁铵 6: LDTA 1
[0017] 2.86x1 0- ΜηΠ:·4Η?0 1.8 i χ 10'； ZnSO,7H:;0 0.222 χ ΗΓ Ν??;ν?ο04·2Η；0 0.39\|0- CuS04*5H：(^ 0.079'<1ΓΓ； C"oC1：*6H；；0 0.050, 1 ??
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0019] (1).本发明提供了一种规模化光自养双阶段培养产油绿藻的方法，显著提高油脂 产量，缩短培养周期，适用于工厂化的大型产油发酵。
[0020] (2).本发明中使用尿素代替NaNO3，可显著降低培养成本。
[0021] (3).本发明中，用NaCl和CH3COONa结合光诱导，即能诱导油含量增加，同时生物 量也增加。
【具体实施方式】
[0022] 本发明实施例所用的产油绿藻为小球藻Chlorella sp.来源于中国科学院淡水藻 种库，编号FACHB-1748。
[0023] 实施例1 :
[0024] -种适用于室外的规模化光自养双阶段培养产油绿藻的方法，包括以下步骤：
[0025] 1.原种制备
[0026] 1).对藻种进行逐渐扩大培养，试管中的藻种扩大到500mL。
[0027] 液体培养基400mL分装到500mL三角瓶中，锡纸封口后灭菌，将小球藻Chlorella sp.(保藏于中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-1748)接种到500mL三角瓶中，接种量OD 为0. 05,通入空气，刚开始时，通气量为0. 3L/min，而且光强不超过400 μ mol m 2S \直到三 角瓶中颜色变绿且OD为0. 5后，加大通气量，为0. 8L/min。光强也可缓慢增加，光强控制在 小于1000 μ mol m 2s 1D液体培养基见表1〇
[0028] 表 1
[0031] 2).将700mL和3. 5L液体培养基分别装到IL和5L三角瓶中，用锡纸封口后灭 菌待用，接种步骤1中培养至对数期的藻IOOmL到IL三角瓶中，再接IL三角瓶中对数期 的藻液200-300mL到5L三角瓶中（0D为0. 3左右），通气管穿过棉塞，一端接0. 22 μm 滤膜的空气过滤器，另一端通入藻液中，棉塞封口。通气量为0. 8L/min，光强控制在小于 1000 μ molm 2s 1O
[0032] 实施例2 :
[0033] -种适用于室外的规模化光自养双阶段培养产油绿藻的方法，包括以下步骤：
[0034] 本实施例所用培养基如表1所示，本实施例以架设于室外的阳光板温室内的柱状 光生物反应器为例进行说明：
[0035] 1.将培养至对数期的藻接种到140L柱状光生物反应器（140L反应器由两个70L 的柱状光生物反应器通过底部相联通的通道组成，70L的反应器的规格为：高I. 83m，直径 为0. 22m，大连汇新钛设备开发有限公司）。柱状光生物反应器的装液量为120L，接种OD为 0. 3。用型号为3L13XD的罗茨风机加二氧化碳通过充气管路对柱状光生物反应器进行通气 冒泡处理，通气量为6L/min，阳光板温室内温度控制在20-38 °C。通过CO2控制藻液的pH在 8. 70-9. 15,培养到藻液浓度为I. 5g/L。
[0036] 步骤1中小球藻扩大培养时，每天均为晴天，自然光强度为400-2