专利名称：以光能自养方式培养淡水绿藻生产花生四烯酸的方法
技术领域：
本发明涉及微藻培养和生产技术，尤其涉及以光能自养方式培养淡水绿藻生产长花生四 烯酸(二十碳四烯酸)的方法。
背景技术：
绿藻Afeoc/^on's属或者/krj'etoc力7oris属是属于绿藻门的单细胞藻类，细胞圆形或卵 圆形，直径为10-15um，在一定的培养条件下，藻体内可大量积累花生四烯酸，最高可达干重 的20%，而且该藻中的花生四烯酸大部分都分布在藻体中的油滴中，同奶中的花生四烯酸分 布方式一致，很容易被人体吸收、利用。花生四烯酸是一种重要的不饱和脂肪酸，是许多类 二十烯酸的前体，如前列腺素，凝血黄素及血三烯素等，具有重要的生理功能。二十二碳四 烯酸还是细胞和细胞膜的重要组成部分，在预防和治疗人体多种疾病及婴幼儿的发育中发挥 着重要的作用。同时，花生四烯酸还是人体大脑细胞膜以及其他神经细胞中磷脂的重要成分 之一，对婴幼儿的大脑与视网膜发育，特别是在婴幼儿认知能力和视力的发育中起着重要的 作用。但是，人类本身并不能合成这些脂肪酸，必须从食物中获取，而一般食物中花生四烯 酸的含量很低。国际粮农组织(FA0)和世界卫生组织(WHO)宣称，为保证婴儿正常生长发 育，建议配方奶粉中加入每公斤婴儿体重60mg的花生四烯酸。美国惠氏公司对其加入花生四 烯酸的配方奶粉声称，加入花生四烯酸可使婴儿智商增加7分。
另外，花生四烯酸在食品、保健品、生物化工以及水产养殖等方面具有广泛的应用前景。
有关花生四烯酸的生理功能及其实际应用的研究己有较多报道，这也是人们重视食用鱼 油的理论依据。传统的生四烯酸多是从鱼油中提取。但是，由于深海鱼油的组成非常复杂， 特别是含有很多对人体有害的饱和脂肪酸，此外，以鱼油为原料获取的花生四烯酸有很多缺 点，如带有鱼腥味、口感很差，同时还容易受到重金属的污染，使其应用受到很大的限制。 同时，复杂的分离及提纯程序也导致脂肪酸的成本很高。最后，由于渔业资源的日益枯竭以 鱼油为原料的这些脂肪酸还面临着原料短缺的问题，导致其产量和价格随着鱼的产量和价格 而波动。目前除了来自于鱼油外，市场上还有利用发酵法培养被孢霉(ifom'er^aJ)生产的 花生四烯酸产品，采用发酵法生产花生四烯酸具有工艺复杂、投资大、需防止细菌的污染、 需要加入外源有机碳源以及成本过高等不可避免的问题。而微藻作为光能自养生物，既可以 在封闭条件下培养，也可以在开放式条件下培养，在培养过程中只需在培养基中添加一些无 机的营养盐。同时，由于微藻作是属于植物的范畴，因此不但可以提取花生四烯酸，而且还 可以以藻粉的形式直接食用。
在本发明申请之前，已经有很多生产花生四烯酸的报道和专利，如专利CN1175956、 CN1255545C、 CN1323904、 CN1362522、 CN15399825、 CN1537378等，但都局限于利用异养发 酵法培养生产花生四烯酸，由于一般微藻中的花生四烯酸含量很低，因此利用光能自养方法 大规模化培养绿藻、商业化生产花生四烯酸尚属空白。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以光能自养方式培养淡水绿藻生 产花生四烯酸的方法，本发明采用的技术方案是-
以光能自养培养淡水绿藻生产花生四烯酸的方法，包括下列步骤
① 、绿藻藻种进行驯化、筛选；
② 、驯化后绿藻类在培养基中采用光生物反应反应器进行藻种的预培养；
③ 、经预培养后，进行藻细胞的快速生长和多不饱和脂肪酸的累积，即绿藻的大规模培
养；
、上述培养液中的生物量及藻体中的花生四烯酸达到一定要求时即可进行采收；
⑤ 、收集藻细胞从而得到所需要的花生四烯酸；
⑥ 、循环利用采收后的养殖废水。
所述的培养基，包括碳源、氮源、磷源、鉄源、无机盐，碳源为碳酸钠、碳酸氢钠、碳 酸、二氧化碳或其混合物；氮源选自有机氮化合物、无机氮化合物或其混合物；磷源为磷酸 盐、磷酸氢盐或其混合物；鉄源为有机鉄化合物、无机鉄化合物或其混合物；无机盐为一种 或多种选自下列物质钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锰盐、钻盐、锌盐、铜盐、钼酸盐、硼化 物及其混合物。
所述的碳源为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸、二氧化碳或其混合物，所述的无机氮化合物包 括硝酸盐、铵盐其混合物，有机氮化合物为尿素。
所述的碳源浓度为0-50mM/L,所用的氮源浓度是0-50mM/L，所述的磷源浓度为 0.01-l.OmM，所述的鉄源浓度为0.01-50uM，所述的无机盐浓度，以钠盐为标准，为 0. 01-100卯m。
培养基的pH值为5. 0-10.0。
所述的培养温度为5-45°C，优选为10-30°C，更优选为15-25°C。 所述的培养是在通气或者不通气并且搅拌条件下进行的。 所述的培养是在人工光源或自然光源下培养的。 细化为包括下列步骤
① 、对绿藻在低温条件下进行驯化筛选；
② 、对经驯化后的绿藻藻类在权利要求l-5之一的培养基中进行预培养；
③ 、经预培养后，再接种到上述的权利要求1-5之一的培养基中进行培养，其中在该步 骤培养基中氮源的浓度为预培养中氮源浓度的1/100-1/2。 其中预培养的温度为10-45。C优选为10-30°C，更优选为15-25°C。，。 上述的经预培养后的培养温度为5-45°C，优选为10-30'C,更优选为15-25°C。 所指的培养设施为封闭式的或不封闭的培养设施。 细胞收集是指采用气泡分离、沉降、过滤或离心等方法。 收集藻细胞后的培养基处理指采用沉降、过滤、泡沫分离或三种方法的结合。 本发明可以带来如下技术效果
通过调整培养条件，促使绿藻大量积累花生四烯酸，等花生四烯酸含量达到10%以上时 进行采收。
采用过滤法或离心机分离绿藻，分离过程不添加任何化学物质，分离后的清夜可返回养 殖池使用，解决了可食用绿藻采收问题。
采用泡沫分离法或者微孔过滤法除去藻液采收后养殖废水中的有机物和固体颗粒，水可 以回收再利用，可以节约水资源。
本发明延长了绿藻养殖生产期，大大提高了养殖绿藻的产量和质量；生产出食用级藻粉， 研制出高附加值的二次产品。
本发明的产品本身是天然绿色保健食品，可以加工成胶囊或以食品添加剂的形式添加到 诸如奶制品和其它食品中。
本发明中的藻粉可以采用有机溶剂或植物油提取藻粉中的花生四烯酸，作为食品添加剂 使用。
具体实施例方式
本发明提供了一种淡水绿藻用的培养基，包括碳源、氮源、磷源、鉄源、无机盐，其中 所述的碳源包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸、二氧化碳或其混合物；所述的氮源选自有机氮化 合物、无机氮化合物或其混合物；所述的无机氮化合物包括硝酸盐、铵盐或其混合物，有机 氮化合物为尿素。所述的鉄源为有机鉄化合物、无机鉄化合物或其混合物；所述的无机盐这 为一种或多种选自下列的物质钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锰盐、钻盐、钼酸盐、锌盐、硼 化物、铜盐及其混合物。
在本发明的培养基中，其中所述的碳源浓度为0 — 50mM/L，所用的氮源浓度是0-50mM; 所述的磷源浓度为0-0. 5mM;所述的鉄源浓度为0. l-50uM;所述的无机盐浓度，以钠盐为标 准，为0. 01-100ppm。其pH值为5. 0-11.0。
本发明还提供了一种在上述的培养基中培养微藻的方法。这种方法是在通气和/或机械搅 拌条件进行。所述的微藻是Afeoc/^oris或户ari"oc力7on's属藻类。藻种保存在固体斜面或 液体培养基中。
本发明所用的淡水微藻是能生产花生四烯酸的微藻，包括可以从UTEX(美国德克萨斯大 学保种中心)以及CCAP(英国藻类和原生动物保藏中心)等获得的种类，如UTEX1707， CCAP254/6。
本发明的目的是提供一种培养绿藻生产花生四烯酸的方法，它是采用封闭式或者开放式 培养系统，培养绿藻生产花生四烯酸，该方法采用光能自养方法培养微藻，与其它方法相比， 在培养基中只需添加一些无机盐，不许添加有机物作为营养，以光能作为能源，具有投资少、 成本低、培养简单等优点，而且可以在盐碱滩涂和沙漠等地区生产。
本发明采用大面积封闭式养殖绿藻的方法及设施，封闭式培养是指在封闭的透明容器。 开放式培养指在露天或温室内的培养池中培养。池体有钢筋混凝土或土壤建成的池子，覆盖 或不覆盖塑料或橡胶质的薄膜，中间有隔离带，池中有搅拌装置，使培养液循环流动；池上 设有由钢材或其它材料等作骨架，以玻璃钢、玻璃、有机玻璃或者塑料薄膜作壁、顶的罩棚， 棚的四周由通气窗口。这种养殖池长年不用维修，可减少培养液污染，提高藻粉质量和产量， 延长养殖生产期。
下面结合实施例进一步说明本发明。 实施例1:
将消毒的淡水放入一级育种的管道式光生物反应器中，调整PH为6 8，营养盐浓度为 1. 5g/升NaN03、 36mg/LCaC12、 20mg/L Na2C03、 75mg/L MgS04、 30mg/L K2HP04、 lmg/L Fe-EDTA 以及微量元素溶液，按照0.1g生物量/L进行接种,并冲入含1-5%二氧化碳的过滤空气，使藻 液在封闭的管道中循环流动。养殖5 10天；进入二级育种阶段，在玻璃温室内的浅水道养 殖池中放置上述养殖培养液，养殖采用自然光源，从上述一级光生物反应器中接种培养液， 接种密度为O. lg生物量/升，养殖5-IO天；进入三级育种阶段，按照O. lg生物量/L，的密 度将上述二级扩种液转入塑料大棚内浅水道养殖池中的上述养殖培养液中，养殖7 10天； 在自然条件下，将消毒的淡水放入带有搅拌装置的室外养殖池，调整水体，要求其中为p朋 8,向上述水体中加入三级扩种液，接种密度为0. lg生物量/L，添加上述元素，NaNO减为原 浓度的1/3-1/10，白天每隔2 3小时搅拌0. 5小时，养殖7 10天；待上述培养液生物量 达l-2g生物量/L，花生四烯酸含量达到10%时即可采用离心或微滤进行采收；分离后的藻糊 在喷雾干燥器中喷雾干燥，进口温度为165'C，出口温度为8(TC，即可得绿藻藻粉。
实施例2:
按照实施例l所述的步骤，其中使用养殖培养液的条件为温度在25t:、 PH值为6-8，
0. 25g/L NaN03、 2. 5mg/L CaC12、 25mg/L NaCl、 75mg/L MgS04、 25mg/L K2HP04、 12. 5mg/L FeS04-EDTA以及微量元素溶液。
实施例3:
按照实施例l所述的步骤，其中使用养殖培养液的条件为温度在15'C、 PH值为6-8、 营养盐浓度为1.0/升Na亂、2. 5mg/L CaC12、 25mg/LNaCl、 75mg/LMgS04、 25mg/L K2HP04、 12. 5mg/L FeS04-EDTA以及微量元素溶液。
实施实例4 : -将消毒的淡水或放入柱式光生物反应器中进行预培养，调整PH为6 8，营养盐浓度为
1. 5g/升NaN0:,、 36mg/LCaC12、 20mg/L Na2C03、 75mg/LMgS04、 30mg/L K2HP04、 lmg/L Fe-EDTA 以及微量元素溶液，按照0. lg生物量/L进行接种，并冲入含0 -5%二氧化碳的过滤空气进行 搅拌，连续光照，光照强度为150W,培养温度为25'C。养殖5 10天；等生物量达5g/L时收 集藻细胞，转移至新配置的上述不含NaN03培养液中继续培养，养殖5 10天，等花生四烯 酸含量达到10%时即可采用离心或微滤进行采收；分离后的藻糊在喷雾干燥器中喷雾干燥， 进口温度为165。C，出口温度为80。C，即可得绿藻藻粉。
实施例5 :
按照实施例1所述的培养基，其中的培养设施为板式光生物反应器，其中使用养殖培养 液的条件为温度在20-30°C、 PH值为6-8，光照为120W，在反应器底部冲入含二氧化碳1-5% 的过滤空气，培养5-10天，等生物量达5g/L时停止充气，待藻细胞自然沉降至反应器底部 后，弃掉上层清液液，并加入新配置的不含硝酸钠的培养液中继续充气培养，养殖5 10天， 等花生四烯酸含量达到10%时即可采用离心或微滤进行采收；分离后的藻糊在喷雾干燥器中 喷雾干燥，进口温度为165'C，出口温度为8(TC，即可得新绿藻藻粉。 实施例6:按照实施例1所述的培养培养，光照改为250W，共养殖培养14天后；等生物 量达5g/L并花生四烯酸含量达到10%即可采用离心或微滤进行采收；分离后的藻糊在喷雾干 燥器中喷雾干燥，进口温度为165'C，出口温度为8(TC，即可得绿藻藻粉。
本发明的突出的实质性的特点和积极效果可从下述实施例中得以体现,但是它们并不是 对本发明作任何限制。
因此按以上所述，按照本发明的方法，以自养方式培养绿藻工业化生产花生四烯酸，可 以低成本、稳定地提供没有腥味的花生四烯酸，替代现有的从鱼油中高成本的提取方法或者 异养发酵的方法。
此外，本发明还在碳源包括碳酸钠、碳酸氢钠，碳酸、二氧化碳；有机氮化合物、无机 氮化合物；无机氮化合物包括硝酸盐、铵盐，有机氮化合物包括尿素。所述的鉄源为有机鉄 化合物、无机鉄化合物；所述的无机盐这为一种或多种选自下列的物质钠盐、钾盐、镁盐、 钙盐、猛盐、钻盐、钼酸盐、锌盐、硼化物、铜盐的条件下进行了实验，仍能取得一定效果。 在本发明的培养基中，其中所述的碳源浓度为O、 50mM/L，所用的氮源浓度是O、 50mM; 所述的磷源浓度为0.01、 l.OmM;所述的鉄源浓度为0.01、 50uM;所述的无机盐浓度，以钠 盐为标准，为O.Ol、 100卯m。其pH值为5、 IO分别进行试验，仍能取得一定效果。 本发明预培养的温度为5、 45°C;进行试验，仍能取得一定效果。 氮源的浓度为预培养中氮源浓度的1/100、 1/5进行试验，仍能取得一定效果。 以上用实施例对本发明进行了描述。本领域的普通技术人员在上述的基础之上可以做出 多种变动，这些变动仍属于本说明书所涵盖范围之内。
权利要求
1、一种以光能自养方式培养淡水绿藻生产花生四烯酸的方法，其特征是，包括下列步骤①、绿藻藻种进行驯化、筛选；②、驯化后绿藻类在培养基中采用光生物反应反应器进行藻种的预培养；③、经预培养后，进行藻细胞的快速生长和多不饱和脂肪酸的累积，即绿藻的大规模培养；④、上述培养液中的生物量及藻体中的花生四烯酸达到一定要求时即可进行采收；⑤、收集藻细胞从而得到所需要的花生四烯酸；⑥、循环利用采收后的养殖废水。
全文摘要
本发明涉及微藻培养和生产技术，尤其涉及以光能自养方式培养淡水绿藻生产长花生四烯酸(二十碳四烯酸)的方法。为提供一种以光能自养方式培养淡水绿藻生产花生四烯酸的方法，本发明采用的技术方案是①绿藻藻种进行驯化、筛选；②驯化后绿藻类在培养基中采用光生物反应反应器进行藻种的预培养；③经预培养后，进行藻细胞的快速生长和多不饱和脂肪酸的累积，即绿藻的大规模培养；④上述培养液中的生物量及藻体中的花生四烯酸达到一定要求时即可进行采收；⑤收集藻细胞从而得到所需要的花生四烯酸；⑥循环利用采收后的养殖废水。本发明主要用于生产长花生四烯酸。
文档编号C12P7/40GK101096640SQ20071005747
公开日2008年1月2日 申请日期2007年5月29日 优先权日2007年5月29日
发明者陈幕钊, 高清潭 申请人:天津禄升海洋生物科技有限公司