活。选取酶活高的菌株进行保存。
[0053] 2. 4. 3硫酸二乙酯（DES)诱变
[0054] 取5mL孢子悬液加入到体积为25mL的三角瓶中，再加入0. 2mL的DES (体积浓度 50% )，震荡不同时间，再加入0. 5mL的硫代硫酸钠（体积浓度85% )终止反应。稀释梯度 为10 1~10 6。取10 4~10 63个稀释度的孢子悬液各0. 2mL涂布于平板培养基上，倒置于 培养箱中30°C培养2~3d。挑取平板上的单菌落接种到斜面培养基上，培养至孢子产生， 再通过发酵培养基测定每个菌株产GOD的性能，选取酶活高的菌株保存。
[0055] 2. 5菌株的鉴定
[0056] 对筛选到的产酶性能较好的菌株进行5. 8S-ITS区序列测定鉴定到属，构建系统 发育树，明确其分类地位。
[0057] 2. 5. 1菌株DNA的提取
[0058] 待测菌株在斜面培养基平板上活化3天后，挑取菌块至发酵培养基中，振荡培养 (30°C、160r/min)3d，然后将菌丝过滤烘干，采用生工生物工程（上海）股份有限公司真菌 基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组总DNA。
[0059] 2. 5. 2PCR 扩增和 5. 8S rDNA-ITS 区序列测定
[0060] 采用引物ITSl与ITS4对5. 8S rDNA-ITS区序列进行扩增。
[0061] 引物序列如下：
[0062] ITS1:5, -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，SEQ ID N0:1 ;
[0063] ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，SEQ ID NO: 2。
[0064] PCR扩增选用50 μ L反应体系：Mixture 25 μ L (含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天 根生化科技有限公司），引物ITSl和ITS4 (浓度为25 μ mol/L)各1 μ L，模板DNA 2 μ L，超 纯水21 yL。PCR扩增反应条件是：94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，30个循 环；72°C延伸7min。将含有目的片段的PCR产物送北京博尚公司测序。
[0065] 测得的序列在NCBI中进行BLAST比对分析，利用DNAMAN6. 0软件进行多重序列比 较，用MEGA3. 1构建系统发育树。
[0066] 3结果与分析
[0067] 3. 1产葡萄糖氧化酶菌株的分离初筛
[0068] 采用多点混合土样采集方法，采取深度为0~IOcm深度的果园土样，并采用梯度 稀释及涂布法进行产葡萄糖氧化酶（GOD)菌株的筛选，初步分离得到60株产葡萄糖氧化酶 (出现蓝色反应圈，如图1所示）的菌株并进行斜面保存。编号如下：
[0069] 78b2、ASP-1、ASP-2、ASP-3、ASP-4、ASP-5、C-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-X、C-X-1、 0父-2、^-4、^-5、^-6、^-7、黑1号、黑2号、黑3号、黑1-1号、黑2-1号、黑3-1号、 黑3-2号、桃土-1、青霉-1、青霉-2、桃土-2、桃土-3、桃土-4、青霉-5、黑-1、黑-2、杨-Z-1、 杨-z-2、杨-z-3、桃-1、桃-2、桃-3、樱桃土 -1、樱桃土 -2、樱桃土 -3、樱桃土 -4、樱桃土 -5、 黑2-2号、黑2-3号、黑3-3号。
[0070] 3. 2菌株的复筛
[0071] 挑取平板蓝色反应圈较大的15株菌分批接种至发酵培养基进行液体发酵5d，采 用Underbofler滴定法测定每个菌株产酶性能，结果如表1、2所示。
[0072] 表1ASP-1等8株菌产酶性能测定结果
[0073]
[0075] 由表1可以看出，以菌株C-2产酶性能较好，发酵5d后发酵液中GOD酶活可达 8.72U/mL〇
[0076] 表2黑-1等7株菌产酶性能测定
[0078] 由表1、2可以看出菌株C-2产酶性能较稳定，第二次测定时产酶可达到8. 9U/mL， 维持在高于8. 5U/mL的水平，所以选定菌株C-2进行后续试验。
[0079] 3. 3诱变筛选结果及产酶性能验证
[0080] 3. 3. 1化学诱变筛选结果
[0081] 对C-2菌株发酵液进行10min、20min、40min DES化学诱变，然后梯度稀释涂布平 板，30°C培养挑取生长速度较快的8株菌至斜面保存，并将这8株菌分别接种至液体发酵培 养基，30°C、180r/min发酵5d结果如表3所示。
[0082] 表3化学诱变筛选结果
[0085] 由表3可以看出化学诱变筛选的8株菌酶活皆低于原始菌株（C-2)。
[0086] 3. 3. 2物理诱变与化学诱变相结合筛选结果
[0087] 由于纯化学诱变效果不理想，对原始菌株（C-2)采用物理诱变与化学诱变相结合 的方法进行诱变。诱变后，将挑纯的菌株接种至发酵培养基30°C、180r/min条件下培养5d 测定酶活，结果如表4所示。
[0088] 表4物理与化学诱变相结合的方法筛选结果
[0089]
[0090] 注：括弧里面a代表孢子悬浮液仅用DES处理20min、40min等，不进行物理诱变； b代表孢子悬浮液在紫外灯下15s后再用DES处理20min、40min等。
[0091] 由表4可以看出，诱变筛选的菌株a-40-2及b-20-2两株菌酶活高于原始菌株 (C-2)，进行下一步产酶验证。
[0092] 3. 3. 3诱变筛选产酶验证
[0093] 表5筛选的菌株产酶性能验证
[0096] 由表5可以看出筛选的2株产GOD性能较好的菌株进行产酶性能验证后发现只有 菌株b-20-2酶活较C-2高，为10. 5U/mL左右，其它菌株稳定性不好。选定菌株b-20-2进 行后续试验，并将其统一命名BLCC6-0009。
[0097] 3. 4菌株BLCC6-0009遗传稳定性对产酶性能影响
[0098] 将菌株BLCC6-0009进行遗传稳定性测定，结果如表6所示。
[0099] 表6菌株BLCC6-00091~8代产GOD稳定性
[0101] 由表可以看出菌株BLCC6-0009在1~8代范围内产酶性能较稳定，维持在10U/mL 左右。
[0102] 3. 5 菌株 BLCC6-0009 的鉴定
[0103] 3. 5. 1菌株BLCC6-0009的生长特性
[0104] 将菌株在平板上于30°C培养，菌落生长快，菌丝为白色，产孢后表面黑色，粉末状。 分生孢子头的顶囊呈黑色，球形或近球形，小梗双层，第一层粗大，第二层短小，呈放射状排 列，布满整个顶囊，如图2所示。
[0105] 3.5.2PCR 扩增结果
[0106] 利用引物ITSl和ITS4,菌株BLCC6-0009扩增到目的片段大小在600bp左右，如图 3所示。
[0107] 将扩增得到的PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行测序。测序结果如SEQ ID NO. 3 所示。
[0108] 3. 5. 3目的菌株的系统发育分析
[0109] 将目的菌株的5. 8SrDNA - ITS区序列在NCBI中进行BLAST分析，并下载相似性最 大的序列和该属内代表种，利用MEGA3. 1软件Neighboring-joining方法构建系统发育树 (图 4)。
[0110] 将测得菌株的5. 8S rDNA-ITS区序列在NCBI中进行BLAST分析，从Genebank中 调取它们相关的序列进行序列分析。Aspergillus niger JF838357. 1、HQ850370. 1等的 5. 8S rDNA-ITS区序列来源于GenBank。系统聚类分析发现它和曲霉属的黑曲霉菌亲缘关 系最近，相似度达99. 6%，综合以上菌株的菌落形态、生长特性、镜检形态及5. 8S rDNA-ITS 区序列系统进化分析证明菌株BLCC6-0009为黑曲霉（Aspergillus niger)。
[0111] 实施例2 :菌株发酵条件的优化
[0112] 1 材料
[0113] 1.1基础发酵培养基：
[0114] A配方：葡萄糖8%、蛋白胨0.3%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.07%、氯化钾 0· 05 %、硝酸钠0· 4%、碳酸钙0· 35 %，pH自然。
[0115] B配方：葡萄糖6 %、蛋白胨0. 3 %、磷酸二氢钾0. 2 %、硫酸镁0. 07 %、氯化钾 0.05%、硝酸钠0.4%、碳酸钙1%，pH自然。
[0116] 1. 2种子培养基：
[0117] 蔗糖3 %、硝酸