一株低产尿素黄酒酵母菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于黄酒酿造技术领域，涉及一株低产尿素酿酒酵母菌。
【背景技术】
[0002] 黄酒是世界上最古老的酿造酒之一，也是我国的特产，享有"国酒"的美誉。绍兴 黄酒更是我国黄酒的杰出代表，以卓越的品质闻名于世，是中国首批原产地域保护产品，其 酿制技艺列入国家非物质文化遗产。
[0003] 氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC)是发酵食品和酒精饮料生产中的代谢产 物，2007年被国际癌症研究中心（IARC)确认为人类可能致癌物质（2A类）。由于其存在潜 在致癌性，EC受到了世界各国的广泛关注。加拿大早在上世纪80年代就制定了饮料酒中 EC的限量标准；美国、英国、澳大利亚及欧盟等国家和相关组织也先后进行了食品中EC含 量的普查及安全性风险评估，并在酒行业内积极开展研究、采取降低酒中EC的措施，取得 了一定成效。2005-2010年，包括WH0/FA0食品添加剂专家委员会（JECFA)、欧洲食品安全 局（EFSA)、澳大利亚/新西兰食品标准化组织（FSANZ)、香港食物环境卫生署（FEHD)、韩国 食品药品管理局（KFDA)等机构相继对酒精饮料中的氨基甲酸乙酯做了含量普查和风险评 估。评估结果强调EC摄入的主要来源是酒精饮料，建议各国必须采取有效措施将EC含量 尽可能降低。
[0004] 目前我国正在制定酒精饮料中EC的限量标准，如何降低黄酒中氨基甲酸乙酯 (Ethyl Carbamate，EC)含量，已成为我国黄酒行业迫切需要解决的问题。以往的研究认为， 黄酒中的EC主要由尿素和酒精反应生成。但近年来的大量研究表明，瓜氨酸和酒精反应也 是黄酒中EC的重要生成途径。因此，选育低产尿素和瓜氨酸的黄酒酵母菌，降低黄酒中氨 基甲酸乙酯的前体物尿素和瓜氨酸含量，被认为是降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的有效途 径。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了低产尿素酿酒酵母XZ-11-1，该菌种于2015年11月27日保藏于中 国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015713。该菌酿制的机械化绍兴加饭酒 中的尿素和瓜氨酸含量一般为7. 5mg/L和llmg/L左右，与黄酒行业普遍使用的85#酵母 菌和出发菌株XZ-Il酵母菌（CGMCC No. 5768)酿制的机械化绍兴加饭酒相比，尿素含量分 别下降70%左右和25%左右（分别为2511^/1左右和1〇11^/1左右），瓜氨酸含量分别下降 78%左右和26%左右（分别为50mg/L左右和15mg/L左右）。酵母菌XZ-11-1生长在固体 YEH)培养基上的菌落呈乳白色、湿润、有光泽、平坦、边缘整齐。显微镜下观察酵母细胞呈椭 圆形，繁殖方式为芽殖。酵母菌XZ-11-1显微形态照片见图1。
[0006] 所述酵母菌，选育方法如下：
[0007] 以申请人母公司使用的生产菌株XZ-Il酵母菌（CGMCCN。. 5768)为出发菌株诱变， 然后以TTC法和二氧化碳失重法筛选出酒精发酵能力强的酵母菌，再以发酵试验筛选出产 酒精能力强、产尿素含量低的酵母菌。
[0008] (1)以酿酒酵母XZ-11作为出发菌株进行诱变，将XZ-11充分活化后，移接于 IOOmL 12~13°Bx米曲汁或麦芽汁培养基，在25°C、120r/min恒温震荡培养48h，调整菌悬 液浓度为IO6个/mL ;打开紫外灯，预热15-20min左右；取5mL菌悬液置于直径9cm无菌培 养皿内，在磁力搅拌器上采用15W、距离30cm、3min的紫外线剂量进行避光诱变。
[0009] (2)将诱变后的菌悬液先进行TTC法初筛，挑取菌落TTC显色呈红色的菌株移接 于12~13°Bx米曲汁或麦芽汁斜面培养基，在28~30 °C培养2~3天，再用平板划线法纯 化，挑取单菌落移接斜面培养基，在28~30°C培养2~3天，备用。
[0010] (3)初筛出的菌株再以二氧化碳失重法复筛：装入200mL糯米饭糖液的300mL三 角瓶中，接入经28~30°C培养24小时的液体试管菌种2mL，装上发酵栓（内装5mol/L H2SO4 封口，装量以距离出气口 5mm为度），称重，置于30°C培养箱中培养7天，称重，计算出失重 量，选取失重量10. 6g以上的菌株进行酿酒小试再复筛。
[0011] 所述二氧化碳失重法复筛液体试管和三角瓶糯米饭糖液培养基制备方法为：取加 饭酒生产用糯米饭，加入2倍水，将温度降至60°C，按70~140单位/g糯米饭加入糖化酶， 搅拌均匀，在58~60°C下保温糖化4~6小时，期间每小时搅拌一次，过滤，调整糖度为 13°Bx，于115°C灭菌20分钟，冷却至常温备用。
[0012] (4)经二氧化碳失重法复筛得到的菌株，以容量为5L的小陶坛为容器进行发酵试 验再复筛。配方：制备速酿酒母或酿制加饭酒的糯米饭2250g、熟麦曲45g、生麦块曲210g、 水1250mL和上述糯米饭糖液28~30°C培养24小时的液体酵母30mL。
[0013] 温度控制：控制落坛后品温为25~27°C，放入生化培养箱中保温发酵，生化培养 箱温度控制：在30°C下发酵1天，再在27°C下发酵16小时，再在24°C下发酵8小时，再在 21°C下发酵1天，再在18°C下发酵1天，然后在14°C下后发酵18天；
[0014] 开耙：落坛后发酵18~20小时开头耙，头耙后5~7小时开二耙，以后每天开耙 一次，后发酵不开耙。
[0015] 发酵4天后测定酒精度和总酸，发酵结束后测定酒精度、总酸、尿素和瓜氨酸含 量，挑选出发酵4天酒精度在14. 5% vol以上、总酸在6. 4g/L以下，且发酵结束酒精度在 18. 5% vol以上、总酸在6. 8g/L以下、尿素含量在8. Omg/L以下、瓜氨酸含量在15mg/L以 下的菌株。以上得到的菌株，再以XZ-Il酵母菌作对照，用上述方法再进行发酵试验，获得 出1株尿素和瓜氨酸降低显著的酵母菌，编号为XZ-11-1。采用该菌酿制的机械化绍兴加饭 酒中的尿素和瓜氨酸含量一般为7. 5mg/L和llmg/L左右，低于现有所有可工业化生产的菌 株。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1酿酒酵母XZ-11的获得
[0017]