用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法

专利名称：用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法
技术领域：
本发明涉及用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法。本发明还涉及可通过所述方法生产的细胞。本发明进一步涉及其中使用这类细胞生产发酵产物例如乙醇的方法。
背景技术：
最近几十年，传统化石燃料(基于石油的燃料)的大规模消耗造成了高水平的污染。这与化石燃料的世界储备并非有限的认识以及增长的环境意识一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新动机，所述替代性燃料是以每升为基础比无铅汽油释放更少CO2的无粒子燃烧燃料来源。尽管生物量衍生的乙醇可以通过得自许多不同来源的己糖的发酵来生产，但是，典型地用于商业规模生产燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂贵的。因此，燃料乙醇生产的提高会需要使用更低成本的原料。目前，只有衍生自植物生物量的木质纤维素原料能够足量获得，用于代替目前用于乙醇生产的作物。在大部分木质纤维素材料中，在C6糖之后的第 二常见的糖还包含相当大的量的C5糖(包括阿拉伯糖)。因此，对于经济上可行的燃料生产工艺而言，己糖和戊糖均必须被发酵形成乙醇。酵母Saccharomycescerevisia是有活力的并且充分适合乙醇生产,但是不能够转化阿拉伯糖。另外，没有一种天然存在的生物是已知能够以高乙醇产量以及高乙醇生产力将木糖发酵成乙醇的。因此，对下述生物存在需要，所述生物具有这些特性从而能够在商业上有活力地从木质纤维素原料生产乙醇。

发明内容
本发明的目的是提供能够转化阿拉伯糖的细胞，特别是酵母细胞。根据本发明达到了该目的，本发明提供了用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法，所述方法包括下述步骤:a)将基因araA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株,该细胞被命名为构建细胞；b)使构建细胞进行适应性进化直到获得转化阿拉伯糖的细胞，c)任选地，使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化，以改进阿拉伯糖转化；步骤b)或c)中产生的细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞；d)分析第一阿拉伯糖转化细胞和构建细胞的基因组的一部分或全基因组；e)鉴定第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP);并f)在能够转化阿拉伯糖的细胞的合理设计中使用SNP信息；g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的细胞。除了酵母细胞BIE201外，本发明还提供了具有基因araA、araB和araD的酵母细胞，其中染色体VII具有通过电泳测定的从1300至1600Kb的大小。本发明还涉及多肽，所述多肽属于下述多肽组成的组:a.多肽，其具有由在SSYl中具有置换E455终止子的多核苷酸SEQ IDNO:14编码的序列，以及其变体多肽，其中一个或多个其他位置具有用AA反式超家族中已有的氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变；b.多肽，其具有由在YJR154W中具有置换D171G的多核苷酸SEQ IDNO: 16编码的序列，以及其变体多肽，其中一个或多个其他位置具有用PhyH超家族中已有的保守氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变；c.多肽，其具有由在CEP3中具有置换S396G的多核苷酸SEQ ID NO:18编码的序列；d.多肽，其具有由在GAL80中具有置换T146P的SEQ ID NO:20编码的序列；和其变体多肽，其中一个或多个其他位置可具有用NADB Rossmann超家族中已有的保守氨基酸的氨基酸对氨基酸的突变。附图简述

图1展示了载体pPWT006的物理图谱。图2展示了质粒pPWT018的物理图谱，其序列在SEQ ID NO:1中给出。图3展示了显示杂交实验结果的放射自显影图，所述杂交实验显示了在CEN.PK113-7D中的质粒pPWT080的一个拷贝的正确整合；图4展示了质粒pPWT080的物理图谱，其序列在SEQ ID NO:8中给出。图5展示了在作为唯一碳源的2%阿拉伯糖上的参照菌株BIE104A2P1的需氧生长曲线，图6展示了在作为唯一碳源的2%阿拉伯糖上的BIE104A2P1C的厌氧生长曲线，图7展示了 BIE104的生长曲线(0D600的糖_、乙醇-和甘油浓度)和产生的C02 (ml/hr，第二轴)，BIE104在2%葡萄糖上预培养并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和I %半乳糖的Verduyn培养基中生长,所有％以w/w的形式。图8展示了 BIE104A2P1C的生长曲线(0D600的糖_、乙醇-和甘油浓度)和产生的C02 (ml/hr，第二轴)，BIE104A2Plc在2%葡萄糖上预培养并在具有5%葡萄糖、5%木糖、
3.5%阿拉伯糖和I %半乳糖的Verduyn培养基中生长。图9展示了 BIE201的生长曲线(0D600的糖-、乙醇-和甘油浓度)和产生的C02 (ml/hr，第二轴)，其在2%葡萄糖上预培养并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和I %半乳糖的Verduyn培养基中生长,所有％以w/w的形式。图10展示了杂交的示意图。图11展示了“标准化熔融曲线”(熔融曲线；上图)和“标准化熔融峰”曲线(下图)的例子。后者源于第一图并显示作为温度函数的荧光信号的变化。展示菌株BIE104A2P1和BIE201。在该图中测试的基因是YJR154w。两个测试的菌株BIE201和BIE104A2P1之间探针的熔融温度的不同是清楚的。图12展示了在菌株BIE201中染色体VII的示意图(覆盖图)。读取深度阐释为沿着染色体的位置的函数。染色体VII的一些部分表示为多重拷贝，即2倍或3倍重复出现。图13展示了用溴化乙锭染色的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体，BIE104A2P1的同 义词)、通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株BIE104A2Plc，其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2Plc的菌株BIE201，其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad)。图14展示了用araA探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体，BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2Plc，通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株，其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1C的菌株BIE201，其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad)，用作染色体大小的参照。图15展示了用ACTl探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体，BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2Plc、通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株，其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1C的菌株BIE201，其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad)，用作染色体大小的参照。图16展示了用PNCl探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体，BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2Plc，通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株，其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1C的菌株BIE201，其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad)，用作染色体大小的参照。图17展示了用HSFl探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体，BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2Plc，通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株，其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1C的菌株BIE201，其在厌氧条件下可在阿拉 伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad)，用作染色体大小的参照。图18展示了用YGR031W探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体，BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2Plc，通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株，其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2Plc的菌株BIE201，其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad)，用作染色体大小的参照。图19展示了来自杂交BIE104A2P1XBIE201的10个剥离的子囊的例子。子囊用Singer Micromanipulator剥离。每个子囊由4个子囊孢子组成。这些子囊孢子彼此分开并以不同的距离放在琼脂平板上。理论上，4个单倍体孢子分离物可产生4个单独菌落。在一个“圆柱体”中的4个菌落起源于I个子囊。图20图解菌株BIE252在BAM (生物活性监测器，Halotec，TheNetherlands)中的性能。菌株在Verduyn培养基2%葡萄糖中预培养。BAM中的应用在厌氧条件下，在补充5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖、I %半乳糖和0.5%甘露糖的pH4.2的Verduyn培养基上进行。图21图解菌株BIE252AGAL80在BAM中的性能。菌株在Verduyn培养基2%葡萄糖中预培养。BAM中的应用在厌氧条件下，在补充5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖、I %半乳糖和0.5%甘露糖的pH4.2的Verduyn培养基上进行。图22展示了将完全己二酸路径双交换整合进入基因组的示意图。图23展示了用分析方法测量的己二酸标准物和样品产生的色谱图。图24展示了质粒pGBS416ARABD的物理图谱。序列表简沭SEQ ID NO:1 展示了 pPWT018 的序列；SEQ ID NO:2展示了用于检查pPWT018整合的引物序列；SEQ ID NO:3展示了用于检查pPWT018整合(用SEQ ID N0:2)并且用于检查PPWT018拷贝数(用SEQ ID NO:4)的引物；SEQ ID NO:4展示了用于检查pPWT018拷贝数的引物序列；SEQ ID NO:4展示了结合SEQ ID NO:4用于检查基因组中的pPWT018的存在的引物序列；SEQ ID NO:6展示了用于产生SIT2探针的正向引物序列；SEQ ID NO:7展示了用于产生SIT2探针的反向引物序列；SEQ ID NO:8 展示了质粒 pPWT080 的序列；SEQ ID NO:9展示了用于检查GRE3-基因座的3’-末端处的pPWT080的正确整合(用SEQ ID NO: 10)并且用于检查质粒PPWT080的拷贝数(用SEQID N0:11)的正向引物序列；SEQ ID NO:10展示了用于检查GRE3-基因座的3’ -末端处的pPWT080的正确整合的反向引物序列；SEQ ID NO:11展示了检查质粒pPWT080的拷贝数(用SEQ ID NO:10)的反向引物序列；SEQ ID NO:12展示了用于产生RKIl-探针的正向引物序列；SEQ ID NO:13展示了用于产生RKIl-探针的反向引物序列；SEQ ID NO:14展示了针对在野生型菌株BIE104中的SSYl基因的序列的序列；SEQ ID NO:15展示了在菌株BIE104A2Plc和BIE201中的SSYl基因的序列；SEQ ID NO:16展示了在野生型菌株BIE104中的YJR154w基因的序列；SEQ ID NO:17 展示了在菌株 BIE104A2Plc 和 BIE201 中的 YJRl54w 基因的序列；SEQ ID NO:18展示了在野生型菌株BIE104中的CEP3基因的序列；SEQ ID NO:19展示了在菌株BIE104A2Plc和BIE201中的CEP3基因的序列；

SEQ ID NO:20展示了在野生型菌株BIE104中的YPL277c基因的序列；SEQ ID NO:21 展示了在菌株 BIE104A2Plc 和 BIE201 中的 YPL277c 基因的序列；SEQ ID NO:22展示了在野生型菌株BIE104中的GAL80基因的序列；SEQ ID NO:23展示了在菌株BIE201中的GAL80基因的序列；SEQ ID NO 24展示了正向引物SSYl的序列；SEQ ID NO 25展示了反向引物SSYl的序列；
SEQIDNO 26展示了正向引物YJRl54w的序列；SEQIDNO 27展示了反向引物YJR154w的序列；SEQIDNO 28展示了正向引物CEP3的序列；SEQIDNO 29展示了反向引物CEP3的序列；SEQIDNO 30展示了正向引物YPL277c的序列；SEQIDNO 31展示了反向引物YPL277c的序列；SEQIDNO 32展示了正向引物GAL80的序列；SEQIDNO 33展示了反向引物GAL80的序列；SEQIDNO 34 展示了 H1-Res 探针 SSYl 的序列；SEQIDNO 35 展示了 H1-Res 探针 YJR154w 的序列；SEQIDNO 36 展示了 H1-Res 探针 CEP3 的序列；SEQIDNO 37 展示了 H1-Res 探针 YPL277c 的序列；SEQIDNO 38 展示了 H1-Res 探针 GAL80 的序列；SEQIDNO 39展示了正向引物YGL057c的序列；SEQIDNO 40展示了反向引物YGL057c的序列；

SEQIDNO 41展示了正向引物SDS23的序列；SEQIDNO 42展示了反向引物SDS23的序列；SEQIDNO 43展示了正向引物ACTl的序列；SEQIDNO 44展示了反向引物ACTl的序列；SEQIDNO 45展示了正向引物araA的序列；SEQIDNO 46展示了反向引物araA的序列；SEQIDNO 47展示了正向引物ACTl的序列；SEQIDNO 48展示了反向引物ACTl的序列；SEQIDNO 49展示了正向引物PNCl的序列；SEQIDNO 50展示了反向引物PNCl的序列；SEQIDNO 51展示了正向引物HSFl的序列；SEQIDNO 52展示了反向引物HSFl的序列；SEQIDNO 53展示了正向引物YGR031w的序列；SEQIDNO 54展示了反向引物YGR031w的序列；SEQIDNO 55 展示了正向引物(matA, mata)的序列；SEQIDNO 56展示了反向引物matA的序列；SEQIDNO 57 展示了反向引物 mata (alpha)的序列；SEQIDNO 58 展示了正向引物 GAL80::kanMX 的序列；SEQIDNO 59 展示了反向引物 GAL80::kanMX 的序列；SEQIDNO 60展示了用于扩增INTlLF的正向引物序列；SEQIDNO 61展示了用于扩增与Adi21表达盒具有50bp重叠侧翼的INTlLF的反向引物序列；SEQIDNO 62展示了用于扩增具有50bp侧翼INTlLF的Adi21表达盒的正向引物序列；
SEQ ID NO63展示了用于扩增Adi21表达盒的反向引物序列；SEQ ID NO64展示了用于扩增Adi22表达盒的正向引物序列；SEQ ID NO65展示了用于扩增Adi22表达盒的反向引物序列；SEQ ID NO66展示了用于扩增Adi23表达盒的正向引物序列；SEQ ID NO67展示了用于扩增Adi23表达盒的反向引物序列；SEQ ID NO68展示了用于扩增来自pUG7的与Adi23具有50bp侧翼重叠的kanMX标记物的正向引物序列；SEQ ID NO69展示了用于扩增来自pUG7的与Adi8具有50bp侧翼重叠的kanMX标记物的反向引物序列；SEQ ID NO70展示了用于扩增与pUG7的kanMX具有25bp侧翼重叠的Adi8表达盒的正向引物序列；SEQ ID NO71展示了 Adi8表达盒的反向引物序列；SEQ ID NO72展示了用于扩增Adi24表达盒的正向引物序列；SEQ ID NO73展示了用于扩增Adi24表达盒的反向引物序列；SEQ ID NO74展示了用于扩增Adi25表达盒的正向引物序列；SEQ ID NO75展示了用于扩增与SucC具有50bp重叠的Adi25表达盒的反向引物序列； SEQ ID NO76展示了用于扩增与Adi25具有50bp重叠的SucC的正向引物序列；SEQ ID NO77展示了用于扩增SucC表达盒的反向引物序列；SEQ ID NO78展示了用于扩增SucD表达盒的正向引物序列；SEQ ID NO79展示了用于扩增SucD表达盒的反向引物序列；SEQ ID NO80展示了用于扩增acdh67表达盒的正向引物序列；SEQ ID NO81展示了用于扩增与INTRF具有50bp侧翼重叠的acdh67构建体的反向引物序列；SEQ ID NO82展示了用于扩增酵母基因组上INTlLF位点的正向引物序列；SEQ ID NO83展示了反向引物用于扩增酵母基因组上INTlLF位点的序列；SEQ ID NO84 展示了 ADI21 PCR 片段的序列；SEQ ID NO85 展示了 ADI22 PCR 片段的序列；SEQ ID NO86 展示了 ADI23 PCR 片段的序列；SEQ ID NO87 展示了 ADI8 PCR 片段的序列；SEQ ID NO88 展示了 ADI24 PCR 片段的序列；SEQ ID NO89 展示了 ADI25 PCR 片段的序列；SEQ ID NO90 展示了 SUCC PCR 片段的序列；SEQ ID NO91 展示了 SUCD PCR 片段的序列；SEQ ID NO92 展示了 ACDH67PCR 片段的序列；SEQ ID NO93展示了 KANMX标记物片段的序列；SEQ ID NO94 展示了 INTlLF PCR 片段的序列；SEQ ID NO95 展示了 INTlRF PCR 片段的序列；SEQ ID NO96展示了 araABD表达盒的正向引物序列；
SEQ ID NO 97展示了 araABD表达盒的反向引物序列SEQ ID NO 98 展示了 Tyl:: araABD 的正向引物序列；SEQ ID NO 99 展示了 TYl:: araABD 的反向引物序列；SEQ ID NO 100 展示了 Tyl::kanMX 的正向引物序列；SEQ ID NO 101 展示了 Tyl::kanMX 的反向引物序列。发明详述在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含comprises"，"包含")、“包括包括"和"包括")应被解释为包含在内。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整数。冠词“一个”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如，“一个元件”可表示一个元件或多于一个元件。本文所述的本发明的多个实施方式可以交叉组合。本发明提供了用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法，所述方法包括步骤a)至g)，这些将在本文中详细描述:步骤a)将基因araA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株,该细胞被命名为构建细胞；步骤a)将在说明书 中下文详细描述并将通过例子阐释。步骤b)和c)使构建细胞进行适应性进化直到获得转化阿拉伯糖的细胞，任选地，使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化，以改进阿拉伯糖转化；步骤b)或c)中产生的细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞；步骤b)和c)将在适应性进化下在说明书中下文详细描述并通过例子阐释。步骤d)分析第一阿拉伯糖转化细胞和构建细胞的基因组的一部分或全基因组；使用基因组重测序通常技术进行该步骤d)。步骤e)鉴定第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP)；通过查看第一阿拉伯糖转化细胞和其构建细胞之间的差异来进行步骤e)步骤f)使用在能够转化阿拉伯糖的合理设计的细胞中的SNP的信息；在步骤f)中，技术人员将知道哪种SNP阿拉伯糖转化是有贡献的，并基于该信息能用常用技术设计改进的菌株。在步骤e)、f)和/或g)中技术人员优选地使用表现分型技术，即鉴定具有期望特征的细胞并结合基因分型技术，即鉴定与选择的特征关联的候选基因。表现分型技术的例子是在单糖或糖混合物的存在下在摇瓶或发酵罐中的生长实验。可应用在固体琼脂培养基上的生长检验。但是，可使用合适已知方法。基因分型技术的例子是重测序技术比如Solexa等等、定量PCR、Southern印迹。但可使用其他合适的已知方法。步骤g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的细胞。在步骤g)中，可使用构建新菌株的所有常用技术。在一种实施方式中，使不同的菌株(亲本)合并，以使亲本的有利特性合并。例如可使用杂交技术，包括步骤b)或c)的菌株与与不具有在步骤b)或c)的菌株中存在的所有SNP的菌株杂交。例如，通过称为适应性进化的方法，用对发酵阿拉伯糖的能力而言必要的基因或增强发酵阿拉伯糖的能力的基因(所有基因一起命名为ARA)转化的单倍体酵母菌株可被增强。在适应性进化方法期间，三个命名为mutl、mut2和mut3的突变已被引入基因组。此类酵母菌株的基因型可被写为mutl mut2 mut3 AM。此类酵母菌株可与另一单倍体酵母菌株杂交，所述另一单倍体酵母菌株还包含就阿拉伯糖转化而言需要的基因，但尚不能进行阿拉伯糖转化，因为其缺少进行阿拉伯糖转化的额外突变。但是，该菌株可具有另一有益特性，比如对抑制剂的耐受性。该特性被命名为ABC。此种方法在图10中阐释。在一种实施方式中，在上述方法中，能够转化阿拉伯糖的酵母细胞具有较之宿主菌株而言扩增的染色体，其中扩增的染色体具有与其中araA、araB和araD基因被引入宿主菌株的染色体相同的数目。在一种实施方式中扩增的染色体是染色体VII。在一种实施方式中，在酵母细胞中，(较之宿主菌株)扩增了动粒周围的部分染色体VII。在一种实施方式中，染色体VII左臂上的区域扩增了三次。在一种实施方式中，染色体VII的部分右臂扩增了两次并且邻近部分扩增了三次(见图12)。扩增三次的染色体VII右臂上的部分含有在强构建型启动子控制下的阿拉伯糖表达盒，即基因araA、araB和araD。除了酵母细胞BIE201外，本发明还涉及具有araA、araB和araD基因的酵母细胞，其中染色体VII具有如通过电泳测定的从1300至1600Kb的大小。菌株BIE201已在W02011003893 中公开。BIE201具有所有单核苷酸多态性:SSY1基因中的G1363T、YJR154w基因中的A512T、CEP3基因中的Al 186G和GAL80基因中的A436C。在一种实施方式中，在酵母细胞中，araA、araB和araD基因的拷贝数是每种2至10个，在一种实施方式中，每种2至8个或3至5个。araA、araB和araD基因的拷贝数可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10个。拷贝数可以用对技术人员而言已知的方法测定，合适的方法在实施例中阐释，并且结 果在例如图12中示出。在一种实施方式中，酵母细胞的单核苷酸多态性的两种或多种但不是不是全部选自由下述突变组成的组=SSYl基因中的G1363T、YJR154w基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G和GAL80基因中的A436C。在一种实施方式中，酵母细胞具有单种多态性GAL80基因中的A436C。在一种实施方式中，酵母细胞具有单种多态性CEP3基因中的A1186G。性接合通过可扩散分子、信息素介导的酵母中的交配可容易证明(Manney, Duntze &Betz 1981)。当在培养皿中的琼脂生长培养基表面上混合相反交配型的细胞时，2至3个小时内变化显而易见。由于每一类型的细胞将其信息素分泌进培养基，其对由相反类型产生
的信息素有反应(MacKay Manney 1974)。它们各自通过分化为专门的功能形式-配子
起反应。细胞停止分裂并改变它们的形状。它们伸长并成为梨形的。这些特征性细胞已被称为“梨形细胞(shmoos) ”。接触或近似靠近的相反交配型的细胞在表面上结合并融合在一起形成具有中心缢痕的特征性“花生”形状，即两个梨形细胞在它们的小末端处融合。每一结合对内的两个单倍体核融合成为二倍体核，形成真正的合子。二倍体迅速在缢痕处发芽，形成特征性的“三叶草”图。人们在显微镜下能容易地观察到所有这些阶段。通过单倍体细胞分泌的交配信息素是通过琼脂扩散的小的肽分子(Betz, Manney& Duntze 1981)。因此，它们的存在和对相反交配型的细胞的作用易于证明。如果交配型a (alpha)的细胞在琼脂培养基上过夜培养，高浓度的信息素在生长周围的琼脂中累积。如果交配型a(matA或mata)的细胞位于该琼脂上，它们在两个小时内开始经历“梨形细胞”转化。可在其中已生长交配型a (alpha)细胞的液体培养基中证明相同的作用。减数分裂梨形细胞是酵母中的配子。只有当存在相反交配型的细胞时，所述梨形细胞从正常营养性单倍体细胞中分化。以类似方式，任何二倍体细胞可经历减数分裂形成具有成为配子的潜能的单倍体(Esposito & Klapholzl981 ；Fowell 1969)。减数分裂是孢子形成的一部分过程，其发生在当二倍体细胞转移至营养不平衡培养基上时，但是当子囊变得相当突出时，只有在3-5天之后该变化在显微镜下变得显而易见。理论上，所有的子囊应当包含4个孢子，但实际上，一些仅仅包含2个或3个。子囊具有特征性形状。用容易获得的消化酶粗制制剂(例如酵母裂解酶，蜗牛酶)处理孢子形成混合物将去除子囊的壁，释放孢子。当在子囊中的或被释放的孢子回到营养充足的环境时，它们萌发并在稳定的单倍体阶段经历营养生长。在称为a和a (alpha)的2个交配型中出现单倍体菌。每个子囊中，2个孢子是正常的交配型a(matA)并且另外2个是a (mata(alpha))型。当一种交配型的细胞遇到另一种交配型的细胞时，它们启动一系列的事件导致接合(见性接合)。结果是二倍体细胞，其通过在稳定的二倍体阶段的有丝细胞分裂生长。如果人们仅仅将形成孢子的细胞培养物转移至生长培养基，结果是单倍体菌株和新的二倍体菌株的混合种群，所述二倍体菌株与来自二倍体高级生物体之间的杂交的生殖相似。通常，酵母遗传学家随机或通过微操作分离孢子，以保护单倍体菌株交配并形成下一代二倍体菌株。该控制程度和在单倍体阶段观察遗传特性的能力使得酵母的遗传分析有力和有效。话应(adaption)适应是一种进化过程，藉此种群变得更加适合(适应)其一种或多种栖息地(栖息地)。该过程在若干到许多代中发生，并且是生物学的基本现象之一。术语适应也可以表示对生物存活而言特别重要的特征。此类适应在可变种群中通过天然选择由更成功地进行繁殖的、更好地适应的形式生产。环境条件的改变改变了天然选择的结果，影响所造成的适应的选择性益处(selective benefits),改善生物在新条件下的适合度(fitness)。在极端环境改变的情况下，有益适应的出现和固定对存活而言可以是至关重要的。大量不同的因素(例如养分可用度、温度、氧可用度等等)能够驱动适应性进化。话合度(Fitness)适应性(在给定栖息地集合中生物能够生活和繁殖的程度)和适合度之间存在清楚的联系。适合度是天然选择率的一种估计量和预测器。通过应用天然选择，替代性表型的相对频率可随着时间而变化，如果它们可以遗传的话。遗传改夺当天然选择作用于种群的遗传变异性时，遗传改变是潜在的机制。通过这种方式，种群遗传适应于其环境。遗传改变可导致可见的结构，或者以适应改变的栖息地的方式调节生物的生理活性。
可出现栖息地的频繁变化。因此，接着适应的过程从不会最终结束。及时地，可能出现环境逐步变化并且物种越来越好地适应其环境。另一方面，可能出现环境变化相对迅速并且接着物种越来越不能良好适应。适应是遗传过程，其在某种程度上一直在进行，当种群不改变栖息地或环境时也在进行。DNA序列中的单个核苷酸可改变(置换)、去除(缺失)或添加(插入)。插入或缺失SNP(InDel)可转变翻译框。单核苷酸多态性可落入基因的编码序列(开放阅读框或0RF)内、基因的非编码区域(如启动子序列、终止子序列等等)或基因之间的基因间区域。由于遗传密码的兼并性，编码序列中的SNP未必改变在转录和翻译之后产生的相应的蛋白质的氨基酸序列。其中两种形式产生相同多肽序列的SNP称为同义的(同义突变)。如果产生不同的多肽序列，它们是非同义的。非同义的变化可以是错义的或无义的。错义变化在相应的多肽中产生不同的氨基酸，而无义变化产生过早的终止密码子，有时导致形成截短的蛋白质。例如通过改变的转录因子结合或相应的mRNA稳定性，不在蛋白质-编码区域的SNP可仍具有基因表达的结果。可在DNA中出现的变化不必限于单个核苷酸的变化(置换、缺失或插入)，而是也可包含两个或多个核苷酸的变化(小细胞核变异)。另外，可出现染色体易位。染色体易位是由非同源染色体之间的部分重排造成的染色体畸形。尤其，根据本发明在下述阅读框中产生SNP:SSYU CEP3和GAL80。SSYl在这里是SPS质膜氨基酸传感器系统(Ssylp-Ptr3p-Ssy5p)的组分，其感知外部的氨基酸浓度并传送导致调节氨基酸通透酶基因表达的细胞内信号。CEP3在这里是必须的动粒蛋白质，CBF3复合物的组分，其结合着丝粒的⑶EIII区域；包含N-末端Zn2Cys6类型锌指结构域、C-末端酸性结构域和推测的卷曲螺旋二聚化结构域。GAL80在这里是参与在缺少半乳糖的情况下抑制GAL基因的转录调节子。通常其通过Gal4p抑制转录活性并通过Gal3p或Gallp结合释放抑制。根据本发明，已经显示基因SSYl、CEP3和GAL80中的SNP对于细胞能够发酵混合糖组合物而言是重要的。进行BLAST搜索用于在这些基因中发现SNP。经鉴定的SNP的概况在表I中给出: 表1:本发明的SNP的概况
权利要求
1.生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法，其包括下述步骤: a)将基因araA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株，该细胞被命名为构建细胞； b)使所述构建细胞进行适应性进化，直到获得转化阿拉伯糖的细胞， c)任选地，使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化，以改善阿拉伯糖转化；在步骤b)或c)中生产的所述细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞； d)分析所述第一阿拉伯糖转化细胞和所述构建细胞的全基因组或部分基因组； e)鉴定所述第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP);和 f)在能够转化阿拉伯糖的细胞的合理设计中使用SNP的信息； g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的所述细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤e)、f)和/或g)中一种或多种分表型技术与一种或多种分表型技术组合使用。
3.根据权利要求1方法或2的方法，其中，在所述方法中，所述能够转化阿拉伯糖的酵母细胞具有与所述宿主菌株相比扩增的染色体，其中所述扩增的染色体具有与所述宿主菌株中的araA、araB和araD基因被引入其中的所述染色体相同的数目。
4.根据权利要求3的方法，其中所述扩增的染色体是染色体VII。
5.除了酵母细胞BIE20 1之外，具有araA、araB和araD基因的酵母细胞，所述酵母细胞中染色体VII具有如通过电泳测定的从1300至1600Kb的大小。
6.根据权利要求5的酵母细胞，其中所述araA、araB和araD基因的拷贝数是每种3至5个。
7.根据权利要求6的酵母细胞，其具有选自由下述突变组成的组的一种或多种所述单核苷酸多态性:SSY1基因中的G1363T、YJR154W基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G和GAL80基因中的A436C。
8.根据权利要求7的酵母细胞，其具有GAL80基因中的A436C的单核苷酸多态性。
9.根据权利要求8的酵母细胞，其还具有CEP3基因中的A1186G的单核苷酸多态性。
10.属于由下述多肽组成的组的多肽: a.多肽，其具有由在SSYl中具有置换E455终止子的多核苷酸SEQIDN0:14编码的序列，以及其变体多肽，其中一个或多个其他位置具有用作为AA反式超家族中已有的氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变； b.多肽，其具有由在YJR154W中具有置换D171G的多核苷酸SEQIDNO:16编码的序列，以及其变体多肽，其中一个或多个其他位置具有用作为PhyH超家族中已有的保守氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变； c.多肽，其具有由在CEP3中具有置换S396G的多核苷酸SEQIDNO:18编码的序列； d.多肽，其具有由在GAL80中具有置换T146P的SEQID NO:20编码的序列； 和其变体多肽，其中一个或多个其他位置可具有用作为NADBRossmann超家族中已有的保守氨基酸的氨基酸对氨基酸的突变。
11.由包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖的糖组合物生产一种或多种发酵产品的方法，其中用根据权利要求5-9任一项的酵母细胞发酵所述糖组合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述糖组合物通过下述由木质纤维素材料生产:a)预处理一种或多种木质纤维素材料以生产经预处理的木质纤维素材料； b)酶处理所述经预处理的木质纤维素材料以生产所述糖组合物。
13.根据权利要求11或12的方法，其中所述发酵是厌氧进行的。
14.根据权利要求11-13任一项的方法，其中所述发酵产品选自由下述组成的组:乙醇；正丁醇；异丁醇；乳酸；3_羟基-丙酸；丙烯酸；乙酸；琥珀酸；延胡索酸；苹果酸；衣康酸；马来酸；柠檬酸；己二酸；氨基酸，比如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸；`1，3_丙二醇；乙烯；甘油；β-内酰胺抗生素和头孢菌素；维生素；药物制剂；动物饲料添加剂；专用化学品；化学原料；塑料；溶剂；燃料，包括生物燃料和生物气或有机聚合物和工业酶，诸如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。`
全文摘要
本发明涉及用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法，其包含下述步骤a)将基因AraA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株，该细胞被命名为构建细胞；b)使构建细胞进行适应性进化直到获得转化阿拉伯糖的细胞；c)任选地，使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化，以改进阿拉伯糖转化；在步骤b)或c)中生产的细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞；d)分析第一阿拉伯糖转化细胞和构建细胞的全基因组或部分基因组；e)鉴定第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP)；和f)在能够转化阿拉伯糖的细胞的合理设计中使用SNP的信息；g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的细胞。
文档编号C07K14/395GK103119053SQ201180020279
公开日2013年5月22日 申请日期2011年4月19日 优先权日2010年4月21日
发明者保罗·克莱斯森, 比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森, 威尔伯特·赫尔曼·马里·海涅, 吉斯博蒂娜·皮特奈拉·苏勒库姆·范 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司