五碳糖和糖醇的生产的制作方法

专利名称：五碳糖和糖醇的生产的制作方法
背景技术：
发明领域
本发明涉及在重组宿主中经发酵生产五碳的醛糖和酮糖以及糖醇的方法。特别地，本发明涉及如下重组宿主，它们经改造增强了戊糖磷酸途径中间物的产生，或者增强了木糖醇、D-阿拉伯糖醇、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、核糖醇、D-核糖、D-核酮糖、D-木糖和/或木酮糖中一种或多种的产生，并涉及利用这些宿主生产它们的方法。
背景技术：
五碳糖和五碳糖醇作为增甜剂有多种用途。例如，木糖醇被广泛用作一种不造成龋齿的替代增甜剂。D-核酮糖和D-木酮糖、以及除木糖醇之外的糖醇，也可以以游离单糖的形式用作增甜剂，或者用作寡糖的组分。在此方面，葡糖-木酮糖，蔗糖地一种结构接近类似物，可以很容易地从蔗糖和D-木酮糖进行合成(Kitaoka，K.，等，Oyo Toshitsu Kagaku41(2)165-72(1994))。
五碳糖和五碳糖醇也可以用于药物和功能性食品成分等的有机和酶促合成。D-阿拉伯糖和D-来苏糖从结构上都与D-核糖(核苷/核苷酸的天然糖组分)非常相似，并且是许多药物和药物制剂的成分。
五碳糖和五碳糖醇可以作为微生物如细菌和真菌的生长碳源。另外，在酶的实验室分析中它们被用作生化试剂，即以五碳糖和糖醇作为底物，以及在糖和糖醇的色谱分析中用作标准物。
如果一种糖能够通过一种非重组微生物或动物宿主进行酶促合成，就说这种糖是“天然合成的”。天然合成的五碳糖及其相应醇的前体通常是戊糖磷酸途径(PPP)中的糖中间物。以5-磷酸化或非磷酸化的形式存在的这些中间物本身作为其它各种有用化合物的化学前体是极有价值的。这些化合物包括，例如，核苷和核黄素(从PPP代谢物D-核糖5-磷酸衍生得到)，以及叶酸、泛醌和各种芳香氨基酸(从PPP代谢物D-赤藓糖4-磷酸衍生得到)。这些氨基酸又是类黄酮和生物碱的前体。因此，能够提高原材料如己糖向所需的PPP糖中间物如核糖-5-P、核酮糖-5-P或木酮糖-5-P转化，并由此也提高所需下游代谢物产量的方法和宿主，将具有重要的经济价值。这些化合物可以被提取或分离出来，就此或作为其它代谢/或化学反应的前体在体内或体外用于生产出有用的产物。
美国专利5,798,237(Picataggio，S.K.等)报道了一种使用木糖异构酶和木酮糖激酶基因进行遗传工程改造后能够发酵含有木糖的木质纤维素生物质得到乳酸的重组乳杆菌(Lactobacillus)。
Jeffries等人报道了为了有效地从木糖产生乙醇在酵母中进行的木糖发酵遗传工程。Jeffries，T.W.等，“在酵母中进行的木糖发酵遗传工程”(Genetic Engineering of Xylose Fermentation in Yeasts)，http//calvin.biotech.wisc.edu/jeffries/bioprocessing/xoferm/xoferm.html。此酵母的特点是具有指导碳流从五碳糖木糖进入二碳终产物醇(乙醇)的能力，这最可能经过的途径涉及PPP转酮酶，该酶沿着促使碳流远离PPP中间物累积的方向起作用。
Aristidou，A.等.，WO 99/46363报道的酵母中，通过过表达NAD谷氨酸脱氢酶或苹果酸酶，改进了与吡啶核苷酸连接的脱氢酶反应的偶联，该酵母不仅显示出可以更高效率地从木糖产生乙醇，而且也显示出提高了从木糖产生木糖醇的量。
然而，目前几乎没有人从相反方向对微生物进行修饰，以改变碳流方向使之远离糖酵解或乙醇的形成进入PPP途径，并累积PPP中间物以及由它们衍生的糖或糖醇。例如，U.S.5,281,531(Miyagawa，K.等)报道了在一种芽孢杆菌属(Bacillus)宿主中生产D-核糖的方法，其中葡糖酸操纵子(它是编码有关葡糖酸吸收和代谢的蛋白)被部分或完全修饰以使葡糖酸操纵子可以进行高度表达。具体地，gntR基因被缺失或灭活，并且启动子被另一个启动子所代替。
利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过发酵已经从葡萄糖生产出D-核糖(U.S.专利No.3,607,648)。对利用从自然界中分离的一些细菌，通过葡萄糖发酵来生产D-木酮糖和D-核酮糖的方法也已有描述(加拿大专利840981)。
U.S.3,970,522(Sasajima，K.-I.等)报道了在具有高2-脱氧葡萄糖氧化活性的芽孢杆菌属菌株中生产D-核糖。在一个菌株内，芽孢杆菌还缺失转酮酶和D-核酮糖磷酸3-差向异构酶中的至少一种酶。
Onishi等发展了一种多阶段方法用于生产木糖醇，其中首先利用嗜高渗酵母发酵葡萄糖得到阿拉伯糖醇。然后利用不同的菌株，在第二步发酵中将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖。最后，利用第三种菌株在第三步发酵中，通过发酵将D-木酮糖还原成木糖醇(Onishi，H.和Suzuki，T.，Appl.Microbiol.181031-1035(1969)).。
Harkki等发展了一种将葡萄糖转化成木糖醇的单阶段发酵方法，并首先提出直接对PPP途径进行修饰以便在单个宿主中从葡萄糖生产木糖醇(U.S.专利No.5,631,150)。
上述许多微生物方法所利用的细菌菌株都是从自然界分离得到的。大多数方法没有教导进一步提高微生物天然能力以生产这些糖或糖醇或者扩大有用发酵产物的谱系的方法。尽管Harkki等人的研究(U.S.5,631,150)对获得代谢工程宿主的方法和在这些宿主中生产木糖醇的方法(尤其是通过过表达PPP的氧化阶段的基因)进行了描述，但明显地，增加经过PPP途径的代谢流量的其它方法将不仅有益于五碳糖的生产，也有益于任何来源于PPP的产物或产物前体的生产。
发明概述
在研究葡萄糖向木糖醇的生物转化的同时，本发明人发现了两种产生木糖醇的新途径。本发明人还意外地发现各种五碳糖(醛糖和酮糖)以及糖醇，包括木糖醇的生产，可以通过利用六碳糖如葡萄糖作为碳源并利用如下微生物宿主来增强，所述微生物中PPP途径中的一个或多个酶促步骤或其它的所需酶促步骤通过代谢工程的方法在遗传上缺失、添加、增强或否则修饰。具体地，本发明提供能够增加进入PPP途径的己糖碳流的宿主，并提供一系列用于利用这些宿主生产所需糖或糖醇，尤其是木糖醇的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及在遗传修饰的宿主中通过顺序地将木酮糖-5-磷酸转化成木糖醇-1-磷酸(例如，利用木糖醇1-磷酸脱氢酶)生产木糖醇的新路线。例如利用适当的磷酸酶将木糖醇-1-磷酸转化成木糖醇。在另一个实施方案中，本发明涉及在遗传修饰宿主中生产阿拉伯糖醇，此阿拉伯糖醇是利用阿拉伯糖醇-5-磷酸脱氢酶从核酮糖-5-磷酸产生的。本发明还涉及一种新的葡萄糖吸收机制，它通过过表达枯草芽孢杆菌glcUgdh的操作子，导致葡萄糖和来源于葡萄糖的中间物进入戊糖磷酸的流量增加。本发明还涉及经过遗传修饰增强了glcUgdh操作子的表达的宿主。
除遗传修饰之外，本发明人还发现可以利用发酵条件进一步增加和调整根据本发明方法由特定宿主产生的五碳碳水化合物的谱系。
因此本发明涉及通过发酵六碳糖(优选葡萄糖)，在单一微生物宿主中经过遗传修饰并工程化的途径生产五碳糖和糖醇(尤其是木糖醇)、以及其它的PPP中间物或来源于它们的产物的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码木糖醇磷酸脱氢酶(XPDH)、或阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶(APDH)的纯化的和/或分离的多核苷酸，用于表达和维持它们的重组载体和宿主，以及这些构建体对于在重组微生物宿主中生产木糖醇和/或阿拉伯糖醇所具有的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及纯化的和/或分离的由这些多核苷酸编码的XPDH或APDH蛋白，或者含有由这些宿主产生的该XPDH或APDH蛋白的制备物，以及该XPDH或APDH特别是在木糖醇和/或阿拉伯糖醇的生产中的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及利用这些多核苷酸和表达它们的本发明重组载体和宿主制备XPDH或APDH的方法，以及该XPDH或APDH尤其是对于在遗传修饰的宿主中生产戊糖磷酸中间物以及来源于它们的产物(例如分别地木糖醇或阿拉伯糖醇)所具有的用途。
附图简述
附

图1.在质粒p131中枯草芽孢杆菌rpi基因区域的限制性图谱。
附图2.质粒p131Cm-2的构建和结构。
附图3.质粒pBS的构建和结构。
附图4.质粒pBS(AR2T)的构建和结构。
附图5.质粒pBS(AR2T)-Kan的构建和结构。
附图6.质粒pGT21的构建和结构。
附图7.质粒pGT23的构建和结构。
附图8.质粒pGT24和pGTK24的构建和结构。
附图9.质粒pGTK24(MXD2)的构建和结构。
附图10.质粒pTKTE1的构建和结构。
附图11.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 63的遗传图谱。
附图12.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 67的遗传图谱。
附图13.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 64的遗传图谱。
附图14.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 66的遗传图谱。
附图15.显示有相关表达盒和限制性位点的B995的遗传图谱。
附图16.显示有相关表达盒和限制性位点的B1068的遗传图谱。
附图17.显示有相关表达盒和限制性位点的B1154的遗传图谱。
附图18.显示有相关表达盒和限制性位点的B1449的遗传图谱。
附图19.显示有相关表达盒和限制性位点的B1003的遗传图谱。
附图20.显示有相关表达盒和限制性位点的B1187的遗传图谱。
附图21.显示有相关表达盒和限制性位点的B1011的遗传图谱。
附图22.PGI1和PGI1，IDP2缺陷型菌株在不同葡萄糖浓度中的生长。
附图23.质粒pGTK74的构建。
附图24(A和B).附图24A质粒pGTK74(LRXPDH)的构建。附图24B质粒pGTK74 BHDH2)的构建。
附图25(A和B).附图25A质粒pGTK24(GDOP)的构建。附图25B质粒pGTK74(GDOP)的构建。
附图26.在转化了BD170[pGTK24(GDOP)]的枯草芽孢杆菌菌株和未转化的对照菌株中的葡萄糖吸收(1％葡萄糖)速率(cpm比min)。
附图27(A和B).附图27A表达载体pGTK74(APDH)的构建。附图27B表达载体pGTK74(BHDH)的构建。
优选实施方案的详述
许多糖可以既以D-构型又以L-构型存在。如果没有明确的说明，并且如果所列的糖或糖醇能够以D-构型和L-构型存在，那么旨在指所列的糖或糖醇的D-构型。
本发明提供用于生产具有D-构型的糖以及相应的糖醇，优选5-碳糖和糖醇，最优选木糖醇的方法，该方法通过代谢利用葡萄糖或其它合适碳源，尤其是通过对它们进行发酵来实现。
本发明提供方法以提高流入戊糖磷酸途径中间物核酮糖-5-P、木酮糖-5-P和核糖-5-P以及由此流入它们的衍生产物中的碳源如葡萄糖。本发明还提供了应用于此方法的经过遗传修饰的宿主，以及制备这些宿主的方法。
根据本发明，所需糖或糖醇的生产是在经过一定方式的遗传修饰的微生物宿主中，通过从前体代谢产生糖或糖醇来实现的，其中微生物宿主的遗传修饰导致，与宿主经过遗传修饰之前在相同条件和相同时间下产生的所需糖或糖醇的量比较，所需糖或糖醇的产生增强。此产生的增强可以反映生产总量或生产率的提高或比生产力的提高。该遗传修饰可以例如通过失活一种或多种基因来实现，其中所述基因编码的酶能够降解或者利用所需要的产物，或能够抑制或阻遏所需产物在宿主中的产生。这种失活通常会导致宿主缺少靶基因的表达产物，或者缺少如下这样一种基因的表达产物，这种基因的表达是与失活基因的功能可操作连接的。一种物质如蛋白质或酶的“缺少”是指与失活之前宿主表达的蛋白质或酶的水平相比较，失活后宿主中含有的蛋白质或酶的水平减少，并且包括由于基因失活完全缺失这种蛋白质或酶的宿主。
遗传修饰也可以例如通过过表达一种或多种其它基因来完成，所述这些基因编码能增加尤其是在遗传修饰宿主的培养过程中产生的所需产物的量的蛋白质，尤其是酶。还可以对宿主进行遗传修饰使之包含既能提高产量又能减少所需糖或糖醇降解的一组修饰。另外，也可以通过在适当的条件下对经过遗传修饰的微生物宿主进行培养，进一步提高所需糖或糖醇在本发明宿主中的产量。
其合成可以按照本发明的方法进行增强的糖(碳水化合物)的实例包括，尤其是，天然产生的具有D-构型的糖，特别是具有D-构型的五碳醛糖。本发明的方法不包括生产D-核糖的具体方法(美国专利3,607,648，3,970,522)。
“代谢途径”是指在宿主细胞内发生的一系列两种或多种酶反应，其中一种酶反应的产物成为下一个化学反应的底物。在代谢途径的每一步，都形成中间代谢化合物并且其被用作下一步的底物。这些化合物被称为“代谢中间物”。每一步的产物也被称为“代谢物”。特定途径的中间物可以以途径名称来提及。例如戊糖磷酸途径(PPP)中的中间物可被称为PPP中间物。
在最简单的实施方案中，本发明涉及如下经过遗传修饰的宿主，与工程化之前在同等培养条件下产生的糖中间物的量进行比较，该修饰后的宿主能够在指定的时段内产生增加量的一种或多种特异性PPP糖中间物。PPP糖中间物指是PPP途径中间物的糖，尤其是指D-核糖-5-磷酸(D-核糖-5-P)，核酮糖-5-磷酸(核酮糖-5-P)，D-木酮糖-5-磷酸(D-木酮糖-5-P)，D-景天庚酮糖-7-磷酸(D-景天庚酮糖-7-P)，D-甘油醛-3-磷酸(D-甘油醛-3-P)和D-赤藓糖-4磷酸(D-赤藓糖-4-P)。本发明也涉及制备这些宿主的方法，和利用这些宿主生产，提取和纯化一种或多种所列糖的方法，以便以粗细胞提取物、部分纯化(优选无细胞)或分离的形式提供这些糖。
在另一个实施方案中，本发明涉及经过遗传修饰的宿主，它能够产生增加量的一种或多种特异性糖或糖醇，尤其是五碳糖或糖醇，在本发明的重组宿主中上述所列的一种或多种PPP糖中间物是这些糖或糖醇的代谢前体，该增加量是在指定的时段内与工程化之前在同等培养条件下产生的糖中间物的量进行比较而言的。尤其是，该宿主经过工程化能够使D-阿拉伯糖醇(也称D-arabinitol)、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、核糖醇、D-核糖、D-核酮糖、木糖醇、D-木糖、和D木酮糖中的一种或多种的产量增加。本发明也涉及制备这类宿主的方法，和利用此宿主生产、提取和纯化一种或多种所列糖或糖醇的方法，以便以粗细胞提取物、部分纯化(优选无细胞)或分离的形式提供这些糖或糖醇。
PPP途径的中间物可以作为其它糖的代谢前体。例如，许多微生物(细菌和真菌，包括酵母)以核酮糖-5-P作为核酮糖的前体。具有或者经过工程化后具有核酮糖还原酶(NADPH)形式的阿拉伯糖醇脱氢酶的微生物，能够从核酮糖产生D-阿拉伯糖醇。核酮糖也可以作为D-阿拉伯糖(通过利用L-岩藻糖异构酶的途径)和核糖醇(经过核糖醇脱氢酶)的前体。因此，此处所用的术语“核酮糖-5-P衍生产物”包括核酮糖、核糖醇、D-阿拉伯糖醇及D-阿拉伯糖和核糖醇，以及它们的混合物，但并不限制于这些实例。
木酮糖-5-P也可以作为包括木酮糖在内的几种重要产物的前体，这些产物又可以作为D-来苏糖(经过甘露糖异构酶)和D-木糖(经木糖异构酶)的前体。因此，此处所用的术语“木酮糖-5-P衍生产物”包括木酮糖、D-来苏糖、和D-木糖、以及它们的混合物，但并不限制于这些实例。
例如，遗传修饰导致木酮糖-5-P相对量提高的菌株可以进行进一步的遗传修饰，以得到木酮糖-5-P衍生产物如木糖醇的产量增加的菌株。类似地，经遗传修饰提高了核糖-5-P的量或者提高了流向核糖-5-P的碳流的菌株，可以进行进一步修饰以提高核糖-5-P衍生产物的产量，尤其是核苷酸和核黄素的产量，或D-赤藓糖-4-P及其产物如叶酸、泛醌和各种芳香氨基酸的产量。类似地，正如此处描述的对于产物如糖醇，在积累核糖-5-P或提高了流向核糖-5-P的碳流的菌株中核糖-5-P衍生产物的产生，可以通过对导致这些产物产生的随后/下游代谢反应进行遗传修饰得以进一步提高。
在优选实施方案中，提供了生产D-阿拉伯糖，D-来苏糖和D-木糖的新方法。在另一优选实施方案中，提供了生产五碳D-酮糖(即，D-核酮糖和D-木酮糖)以及所有可以从D-戊糖衍生得到的五碳戊糖醇(即，木糖醇、D-阿拉伯糖醇和核糖醇)的方法。生产木糖醇的方法是特别优选的实施方案。
本发明也提供改变五碳碳水化合物产物谱系(相互比较时的相对量)的方法，其中所述五碳碳水化合物是，尤其在本发明的宿主中，通过调节发酵条件由葡萄糖和其它碳源(尤其是在糖酵解途径中能够通过代谢转化成六碳糖中间物的碳源)发酵产生的。利用本发明的方法，人们可以通过发酵葡萄糖和其它六碳糖获得增加水平的来源于PPP中间物的任何天然合成的五碳糖或糖醇，所述糖或糖醇或者具有D-构型或来源于具有此构型的糖或糖醇。尤其是可以生产D-核酮糖、D-核糖、D-木酮糖、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、D-木糖、D-阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇，而且也可以生产从PPP中间物衍生的其它产物。
本发明的宿主和方法可通过在微生物宿主内并入设计以实现下列目的单一遗传修饰或几种不同遗传修饰的组合来获得或实现
a)破坏或降低一个或多个酶促步骤或者底物转运步骤，尤其是
糖运输步骤的活性；
b)引入一个或多个新的所需酶活性或者糖运输活性；
c)过表达已存在于宿主中的一个或多个所需酶活性或者糖运输
活性；
或者
d)(a)和(b)和(c)的任何组合。
在优选的实施方案中，本发明的宿主经过遗传修饰，使PPP途径的非氧化阶段中包含受到破坏的一个或多个酶促步骤，和/或使间接影响通过PPP途径的碳流的一个或多个酶促步骤受到破坏。
本发明的遗传修饰集中在编码影响糖代谢、参与碳水化合物代谢的几个关键部分的蛋白质，尤其是酶的基因上。从这方面来说最重要的部分包括戊糖磷酸途径(PPP)的非氧化阶段；PPP的氧化阶段；糖酵解(Embden-Meyerhof)途径的上半部(即在醛缩酶之前)；和原核生物的糖吸收系统(PTS系统)。另外，可以靶向由多元醇脱氢酶、醛糖异构酶和酮糖差向异构酶以及糖去磷酸化酶催化的各种独立的代谢反应。
PPP的反应被分成氧化阶段，以及由随后的一系列反应组成的非氧化阶段。经氧化还原酶如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化的反应构成了氧化阶段。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸转化成葡糖酸内酯-6-磷酸，后者很快经化学(在一些宿主中是酶)的作用转化成6-磷酸葡萄糖酸。然后6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖酸转化成核酮糖-5-P。
PPP中非氧化阶段的特征在于以下几种酶的催化活性(1)核糖-5-P异构酶(也称核酮糖-5-P异构酶)，(2)核酮糖-5-P 3-差向异构酶，(3)转酮酶和(4)转醛醇酶。在PPP的非氧化阶段中，核酮糖-5-P被核糖-5-P异构酶异构化成核糖-5-P。在核酮糖-5-P 3-差向异构酶的作用下，核酮糖-5-P也可以被差向异构化变成木酮糖-5-P。转酮酶将核糖-5-P和木酮糖-5-P转化成甘油醛-3-P和景天庚酮糖-7-P。转醛醇酶获取甘油醛-3-P和景天庚酮糖-7-P并将它们转化成果糖-6-磷酸和赤藓糖-4-P。转酮酶随后以赤藓糖-4-P和木酮糖-5-P为底物并将它们转化成甘油醛-3-P和果糖-6-P。
经过修饰在戊糖磷酸途径的非氧化阶段具有一个或多个遗传修饰的宿主是本发明特别优选的宿主。优选地，失活PPP非氧化阶段的一种或多种酶，以便经过PPP非氧化阶段的碳流在需要被阻断的位点被破坏，从而使得碳流改变方向进入所需化合物的产生过程。这样，在此宿主中，经过PPP非氧化阶段的天然碳流减弱或者完全停止。这可以优选通过对一种或多种编码核酮糖-5-P异构酶、核酮糖-5-P 3-差向异构酶、转酮酶、和转醛醇酶的基因进行破坏来达到。如下文详细讨论的，这种破坏既可以通过随机化学突变和筛选来完成，又可以通过定向诱变技术如基因破坏来完成。
为了增加核酮糖-5-P和核酮糖-5-P衍生物的产量，特别优选对核糖-5-P异构酶基因进行破坏或失活。作为替代方案或此外，对核酮糖-5-P 3-差向异构酶基因进行破坏或失活是极为理想的。将这样的宿主在六碳糖如葡萄糖、或者能够转化成葡萄糖或葡萄糖的六碳糖代谢物如葡萄糖-6-P的糖上进行培养时，进入PPP的碳流被挡在或阻塞在核酮糖-5-P步骤，由此导致该中间物累积，并导致在能产生核酮糖-5-P衍生物的那些宿主中从核酮糖-5-P流向核酮糖-5-P衍生物的碳流增加。生产被“阻挡”或“阻塞”在某一特定步骤，是指在此步骤宿主对化合物的利用率或降解率低于化合物的合成率，以致相对于在同等条件下生长的未经修饰的宿主，化合物的量增加。
为了增加木酮糖-5-P和木酮糖-5-P衍生物的产量，极优选对编码核糖-5-P异构酶的基因进行破坏或失活。编码核酮糖-5-P 3-差向异构酶的基因优选保持完整，否则引入此基因的额外拷贝(既可以是同源的也可以是异源的，但是优选来自同种的同源拷贝)，以便增加流向木酮糖-5-P的碳流。当构建能够增强产生木酮糖-5-P的宿主时，另外还特别优选对转酮酶基因进行失活。将这样的宿主在六碳糖如葡萄糖、或者其六碳糖代谢物如葡萄糖-6-P上进行培养时，进入PPP的碳流在木酮糖-5-P阶段受到阻挡或阻塞，由此导致该中间物的累积，并导致在能够产生木酮糖-5-P衍生物的宿主中从木酮糖-5-P向木酮糖-5-P衍生物的碳流增加。
编码核糖-5-P异构酶和转酮酶和/或转醛醇酶的基因的失活能够阻断、或明显地减少PPP途径的碳流沿着形成糖酵解途径中间物的方向流出PPP途径。或者，失活转酮酶基因、或再另外失活转醛醇酶基因，甚至不失活核糖-5-P异构酶基因，也可用于在那些酶促步骤阻断碳从PPP途径流失而进入糖酵解途径，但是仍旧允许产生核糖-5-P及其衍生物。
其中失活核糖-5-P异构酶的上述基因失活导致，与未经修饰的宿主比较，核酮糖-5-P和木酮糖-5-P中的一者或两者出现累积，或者导致一种或多种在其合成途径中核酮糖-5-P或木酮糖-5-P是代谢前体的代谢产物出现累积。
当多个编码转酮酶或D-核糖-5-磷酸异构酶的几种同工酶的基因存在于宿主中时，如酿酒酵母的转酮酶基因和大肠杆菌的D-核糖-5-磷酸异构酶基因，则优选将所有编码那些酶的基因进行失活。根据不同的应用(即，是否需要碳流进入木酮糖-5-P)，可以对编码D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的基因进行失活，或者过表达。实施本发明最优选的模式是对存在于所选宿主中的所有D-核糖-5-磷酸异构酶和转酮酶基因进行失活。
本发明的宿主也可以被设计成过表达如下一种或多种所需要的基因，所述基因编码的蛋白质已经存在于宿主中并且能够催化特定的五碳糖和糖醇之间的相互转化。或者，本发明的宿主可被设计成表达期望的但宿主以前缺少的酶活性。在本发明的宿主和方法中作为引入和/或过表达的靶的这类基因的实例，包括编码多元醇脱氢酶如木糖醇脱氢酶、阿拉伯糖醇脱氢酶或核糖醇脱氢酶的基因。类似地，编码作用于中性糖的各种异构酶和差向异构酶的基因也被认为属于这一类。这类异构酶和差向异构酶的实例有L-果糖异构酶(Garcia-Junceda E.，等，Bioorg.Med.Chem.31349-1355(1995))、D-甘露糖异构酶(Allenza，P.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.24-25171-182(1990))、D-木糖异构酶(例如，Bhosale，S.H.等的综述，Microbiol.Rev.60280-300(1996))、酮糖3-差向异构酶(Ishida，Y.，等，J.of Fermentation and Bioengineering 83529-534(1997))。
对重新引入或过表达的基因的特异性选择将取决于本发明的具体实施。例如，如果木糖醇是靶产物并且宿主产生木酮糖，那么需要在发酵或至少在生产周期中(如果与发酵步骤分离)在宿主细胞中表达木糖醇脱氢酶基因。如果D-木糖是靶产物并且宿主产生木糖醇，那么在发酵或生产周期间，必须表达多种已知D-木糖异构酶基因中的一种。
因此，在一个实施方案中，本发明的宿主被用于木糖醇的生产，采用的方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有
D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上，培
养重组宿主；
(B)在所述宿主中生产木糖醇，方法是通过阿拉伯糖醇不是中间物
的代谢途径将一种或多种戊糖磷酸途径中间物转化成所述木糖醇；以
及
(C)回收部分(B)中产生的所述木糖醇。
在优选的实施方案中，所述途径利用核酮糖-5-磷酸作为产生木糖醇的中间物。在特别优选的实施方案中，此途径利用核酮糖-5-磷酸、木酮糖-5-P和木糖醇-1-P作为产生木糖醇的中间物。木糖醇-1-P也可称为木糖醇-5-P。
或者，在另一特别优选的实施方案中，此途径利用(1)核酮糖-5-磷酸、(2)核酮糖、和(3)木酮糖及木糖中的至少一个作为产生木糖醇的中间物。
因此，在优选的实施方案中，木糖醇是在本发明的宿主中经过如实施例24所例举的途径生产的，该途径中
a)经酶如核酮糖-5-P 3-差向异构酶作用，核酮糖-5-P被差向异构化
成木酮糖-5-P；
b)经酶如木糖醇-5-磷酸脱氢酶(也可称作木糖醇-1-磷酸脱氢酶或
简称XPDH)或者核糖醇磷酸脱氢酶作用，木酮糖-5-P被还原成D-木糖
醇-5-磷酸(D-木糖醇-1-磷酸)；以及
c)经糖磷酸酶作用，D-木糖醇-5-磷酸(D-木糖醇-1-磷酸)去磷酸
化变成木糖醇。
特别优选的宿主是可以积累木酮糖-5-P，并具有如下基因的宿主，所述基因表达的酶能够将木酮糖-5-P还原成木糖醇-5-P，如木糖醇-5-磷酸脱氢酶。
在本领域中所提及的D-木糖醇-5-磷酸应理解为与L-木糖醇-1-磷酸是同样的化合物，反之亦然，因此在本文中它们可以相互交换。另外，本领域中所提及到的能够产生或利用木糖醇-5-P的酶如木糖醇-5-磷酸脱氢酶，应理解为也是指并等同于称为木糖醇-1-磷酸脱氢酶或简称XPDH的酶，并且这些名称是可以互换的。
或者，在另一个优选的实施方案中，木糖醇在宿主中的生产是以实施例9例举的路线进行的，其中核酮糖-5-磷酸被去磷酸化转化成核酮糖(例如利用核酮糖-5-P磷酸酶)；核酮糖被差向异构化成木酮糖(例如利用塔格糖差向异构酶)；并且木酮糖或被还原为木糖醇(例如利用木糖醇脱氢酶)，或者，作为替代方案，首先将木酮糖部分异构化成木糖，然后将木酮糖和木糖还原成木糖醇。
因此，参与葡萄糖转化成木糖醇的途径和酶反应包括木糖醇磷酸途径、木糖醇脱氢酶途径、塔格糖差向异构酶途径和阿拉伯糖醇途径。
在木糖醇磷酸途径中，核酮糖-5-P被转化成木酮糖-5-P。木酮糖-5-P再被转化成木糖醇-5-P，后者被转化成木糖醇。
在木糖醇脱氢酶途径中，核酮糖-5-P被转化成木酮糖-5-P。木酮糖-5-P再被转化成木酮糖，后者被转化成木糖醇。
在塔格糖差向异构酶途径中，核酮糖-5-P被转化成核酮糖。核酮糖被转化成木酮糖，后者再被转化成木糖醇。
在阿拉伯糖醇途径中，阿拉伯糖醇被转化成木酮糖，后者被转化成木糖醇。
已知D-甘露糖异构酶能够催化D-核酮糖和D-来苏糖的相互转变(Stevens，F.J.等，J.Gen.Microbiol.124219-23 1981))。因此，通过在产D-木酮糖的宿主中表达编码甘露糖异构酶的基因，就能够以葡萄糖发酵产物的形式获得D-来苏糖。
还已知L-果糖异构酶能将D-核酮糖转化成D-阿拉伯糖(Bartkus，J.M.等，J.Becteriol.165704-709(1986))。在本发明产D-核酮糖的宿主(例如，枯草芽孢杆菌GX2)中表达适当的基因(例如，大肠杆菌的fucI，GenBank编号U29581)，将得到能够将葡萄糖经D-核酮糖转化成D-阿拉伯糖的宿主。
设计本发明的宿主时，重要的是还应牢记己糖代谢中的早期步骤，包括糖吸收系统、糖酵解途径的上半部分(即，位于己糖激酶/葡糖激酶和醛缩酶作用之间的某点)和PPP途径的氧化阶段。这些区域的遗传修饰不是实施本发明所必需的。然而，可对本发明的宿主进行遗传修饰，使之在这些区域包括一个或多个修饰，以便使流入PPP氧化阶段及因而进入PPP非氧化阶段的碳流最大化，由此可以进一步提高所需要的发酵产物的产量。
更特别地，在本发明宿主中，对编码能够调节碳流在糖酵解途径和PPP途径之间分配的酶的基因进行破坏是极为理想的。这些基因能够编码存在于糖酵解途径上半部分(即，在丙糖磷酸异构酶步骤之前)的酶活性。这个基因的破坏以及此基因编码的酶的缺失能够阻止碳流通过糖酵解途径流出己糖磷酸库，这导致六碳糖酵解代谢物的累积，特别是葡萄糖6-磷酸(葡萄糖-6-P)的累积，后者能够进入PPP途径的氧化阶段。
作为丙糖磷酸异构酶步骤之前活性破坏或减少的靶标的糖酵解酶是那些位于葡萄糖-6-磷酸合成之后的酶，尤其是葡萄糖-6-磷酸异构酶(或称为葡糖磷酸异构酶)、果糖磷酸激酶和醛缩酶。优选的修饰靶标是葡萄糖-6-磷酸异构酶基因和/或果糖磷酸激酶基因。由于葡萄糖-6-磷酸异构酶基因的活性减少或缺失的微生物菌株在葡萄糖上的生长情况一般不好，所以在发酵时可以利用果糖作为共底物。或者可以分两个阶段进行发酵，其中在富果糖的培养基上使生产菌株进行生长并且仅在生产阶段添加葡萄糖，所需要的PPP糖或其衍生物在生产阶段进行积累。需要增加进入PPP氧化阶段的碳流时，不需要减少葡糖激酶或己糖激酶基因的活性，因为这些酶产生葡萄糖-6-P(PPP氧化阶段的第1个酶葡萄糖-6-P脱氢酶的底物)。或者，细胞内的糖酵解酶的活性可以通过突变、改变启动子和/或利用化学抑制剂来降低，而且可以根据酶试验或者底物培养筛选试验(substrategrowth screening assay)对所需要的突变株进行筛选。用于鉴定每一种糖酵解酶存在或缺失的体外酶试验是本领域众所周知的。
使进入PPP途径的碳流增加的替代/补充方法是过表达编码PPP氧化阶段的第一个酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因。具体来说，来自异型发酵乳酸菌(如，肠系膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)(GenBank编号M60615))的这些基因将是适用的，这是由于它们对许多葡萄糖-6-磷酸脱氢酶所典型的变构抑制的敏感性减少(Sugimoto S.& Shio，I.，Agric.Biol.Chem.51101-108(1987))。过表达编码PPP氧化阶段的第二个酶6-磷酸葡糖酸的基因，也被认为属于本发明的范围。这个酶的高活性能够阻止细胞累积6-磷酸葡糖酸和向培养基中分泌葡糖酸。
为了实施本发明，另外一组可以优选进行失活的基因是编码控制宿主细胞吸收糖的酶或蛋白质的基因。在细菌宿主中，在引入替代(基于激酶的)糖吸收系统的同时通过突变产生失活的野生型糖吸收系统(称作PTS系统)，可用于改善细胞的整体代谢和能量平衡。在易于出现所谓“辅因子不平衡”现象的宿主中，失活与PPP氧化阶段中的酶竞争辅因子(典型的是NADP+)的酶，也是本发明的范围。辅因子不平衡在下文进一步讨论。
在本发明微生物宿主内有利地进行表达或过表达的基因组合将根据本发明的具体实施来确定。过表达PPP氧化阶段的基因，尤其是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶，是有用的，尽管在大多数实施过程中这不是绝对必须的。在某些可能发生辅因子不平衡现象的宿主(如，许多酵母)中，表达异源或同源的转氢酶可能是有利的。或者，也可以通过给宿主提供编码如下的一对脱氢酶的基因来实现转氢酶的作用，这对脱氢酶利用不同的辅因子(一个用NADPH，另一个用NAD)并且，优选地在细胞质中，催化否则相同的反应。
当在细菌宿主中实施本发明并且这些宿主天然的基于PTS的糖吸收系统被失活时，葡糖激酶或己糖激酶的过表达是特别有用的。在一些宿主中，可能需要或希望(过)表达同源或异源糖-磷酸磷酸酶，以便实现五碳糖磷酸向相应的中性(即，去磷酸化的)糖的极大转化。大量其它的基因，包括编码木糖醇脱氢酶、D-阿拉伯糖醇脱氢酶、核糖醇脱氢酶、L-果糖异构酶、D-甘露糖异构酶、D-木糖异构酶、酮糖3-差向异构酶等的基因，都可以用于本发明的具体实施中。
除了旨在减少或增强微生物宿主内某种已知酶活性的特定遗传修饰，如上述的修饰之外，经未知的酶/机制起作用的突变也可以用于实施本发明。例如，通过采用如本发明所显示的某些突变筛选/选择方案，可以很大程度地特异改变产戊糖/戊酮糖的重组宿主的发酵产物谱系。
当在能够经PTS系统获取葡萄糖并对之进行磷酸化的微生物宿主中实施本发明时，优选对葡萄糖吸收系统进行修饰。PTS系统发挥功能需要连续供应磷酸烯醇丙酮酸-一种糖酵解途径的产物。如果利用以葡糖激酶或己糖激酶为基础的葡萄糖吸收和磷酸化系统代替PTS系统，那么是ATP而不是磷酸烯醇丙酮酸提供葡萄糖吸收和磷酸化所需的能量。不同于磷酸烯醇丙酮酸，ATP可以经过呼吸链利用由PPP氧化阶段产生的NADPH进行补充。因此，这样的一个系统将为本发明那些通过PPP途径将己糖磷酸转化成戊糖磷酸的微生物宿主细胞提供好得多的能量平衡，并且由此将获得更高产量的所需五碳糖。利用基于激酶的系统代替基于PTS的葡萄糖吸收和磷酸化系统的技术是本领域众所周知的(Flores，N.等，NatureBiotechnology 14620-623(1996))。
本发明也涉及被修饰的葡萄糖吸收机制，它通过过表达枯草芽孢杆菌glcUgdh操纵子，增加流入戊糖磷酸的葡萄糖和葡萄糖衍生的中间物的量。当例如在本文描述的制备木糖醇的方法中，希望利用能够生产出增强水平的一种或多种戊糖磷酸支路中间物的宿主时，这类宿主特别有用。本发明也涉及一种宿主，对它进行遗传修饰后增强了glcUgdh操纵子的表达。
在转氢酶活性很低或缺失的宿主中和缺少经过呼吸链重新氧化NADPH机器的宿主中，PPP的活性可以造成一种有时称之为“辅因子不平衡”的现象。辅因子不平衡引起经过PPP氧化阶段的碳流减少，这是因为供应葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶的细胞内NADP+受到了限制。这种情况下，为了实施本发明方法，可以对宿主进行附加的遗传修饰，其中所述附加的遗传修饰能够降低其它细胞代谢部分对NADP+的需求或允许细胞，例如通过NAD+，对NADPH进行再氧化(NADH通过呼吸链的再氧化比NADPH有效得多)。
因此，表达转氢酶基因有利于提高如上所述的发明中某些宿主的性能。或者，可以在宿主细胞内表达作用于相同底物但是利用两种不同辅因子(NADH和NADPH)的一对脱氢酶。这样的一对酶可以有效地作为一个“准转氢酶”，平衡着NADH-NAD+和NADPH-NADP+库的氧化还原态(Aristidou等，WO 99/46363)。特别适用的脱氢酶对是NADH和NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶。例如，在酵母中NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶(由GDH1基因编码)从野生型的染色体基因获得足够高水平的表达。因此，仅过表达一种基因-NADH依赖性谷氨酸脱氢酶基因(例如，酵母GDH2基因(Miller，S.M.，等，-Mol.Cell Biol.116229-47(1991)；Boles，E.，等，Eur.J.Biochem.217(1)469-77(1993))就足以缓解宿主细胞内的辅因子不平衡(Aristidou等，WO 99/46363)。
通过PPP途径的碳流也可以通过使如下细胞中的酶失活来增加，这类酶能够与PPP氧化阶段的酶竞争NADP+。例如，使NADP依赖性柠檬酸脱氢酶基因IDP失活(Loftus，T.M.，等，Biochemistry 339661-9667(1994))，可以对通过PPP途径的代谢流产生刺激作用。
通过为宿主细胞提供适当的共底物和能够利用NADPH还原此共底物的酶，也可以实现NADPH的再氧化。这种共底物的典型实例是木糖，它可以被NAD(P)H依赖性木糖还原酶还原为木糖醇。已经从大量微生物中克隆出编码适当木糖还原酶的基因(Amore，R.等，Gene 109(1)89-97(1991)；Billard，P.等Gene 162(1)93-97(1995))。
在辅因子不平衡的条件下经过PPP氧化阶段的碳流发生减少这一问题的一个更好解决方法是，在本发明宿主内表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡糖酸脱氢酶的异源基因，这两种酶都能够利用NAD+作为辅因子。能够编码具有这些性质的葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因的合适实例是来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠系膜状明串珠菌的zwf基因(Ma，J.F.，等，J.Bacteriol.180(7)1741-1749；Lee，W.T.，等，J.Biol.Chem.26613028-13034(1991))。而且，对于实施本发明具有作用的NAD+特异性6-磷酸葡糖酸脱氢酶是已知的(Ohara，H.等，Bioschi.Biotech.Biochein.60(4)692-693(1996))。
在还原型而不是氧化型的辅因子(NADH)变得有限时，微生物细胞中可以发生“相反”类型的辅因子不平衡。在本发明范围之内，这个问题典型地发生在当靶产物为5-碳糖醇时，它是通过酶促还原相应的5-碳酮糖形成的。在这种情况下，对编码竞争NADH的酶的野生型基因进行失活是有用的。在酵母中具体适用的实例是参与甘油生产的成对NADH依赖性脱氢酶GPD1和GPD2(Ansell R.，等，EMBO J.162179-2187(1997))。在枯草芽孢杆菌中，失活3-羟基丁酮还原酶基因将是提高用于供应糖醇生产的NADH的优选遗传修饰。
优选的用在一些宿主(例如，酵母)中实施本发明的另一种遗传修饰方法是(过)表达糖-磷酸磷酸酶基因如酿酒酵母中的DOG1基因(Sanz，P.，等，Yeast 101195-202(1994))。已知这个基因编码的磷酸酶也对5-碳糖磷酸如核糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸具有活性。本发明人证明这种酶对木酮糖5-磷酸也具有活性，并且在此公开了DOG1的过表达引起5-碳糖和相应多元醇，尤其是核糖醇的累积增加。已知对于实施本发明有用的另一类型磷酸酶，名称是“低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶”(Chernoff，J.和Li，H.C.，Arch.Biochem.Biophys.240135-145(1985))。本发明人意外发现，这些酶也作用于5-碳糖磷酸。发现酿酒酵母的LPT1基因(Ostanin K.，等，J.Biol.Chem.27018491-18499(1995))的过表达能够提高五碳糖和糖醇的产量。适用于实施本发明的其它的这类基因从Zygosaccharomyces rouxii种酵母中分离出来并在本文中进行了公开。
在某些宿主如枯草芽孢杆菌中，磷酸酶的表达可能不是必需的，原因是正如本发明人的发现，这类宿主的细胞能够容易地对大量五碳糖磷酸包括D-核糖5-磷酸、D-核酮糖5-磷酸和D-木酮糖5-磷酸进行去磷酸化。
在本发明实施中有用的再一类型遗传修饰是使编码将五碳糖转化成相应的糖磷酸的激酶的基因失活或减少其活性。这种有用的遗传修饰的一个实例是使编码木酮糖激酶的基因失活。我们在本文中显示，这个基因的失活能够增加核酮糖以及相应多元醇即木糖醇的产量。类似地，如果核酮糖或核糖醇是靶产物，则失活核酮糖激酶将是有用的。
产物的谱系，如由本发明的重组菌株产生的五碳糖，在大多数情况下可以通过发酵条件进行调控或进一步修饰。最重要的是，培养基中溶解氧的浓度影响酮糖和相应糖醇的平衡。例如，当本发明的某些枯草芽孢杆菌菌株在高通气条件下进行培养时，它们产生出戊酮糖作为发酵的主要五碳糖产物。而在微有氧条件下，多元醇是主要的发酵产物。
除了用于构建新的重组微生物宿主的遗传方法之外，本发明还提供了通过调节所述宿主的发酵条件控制产物谱系的方法。例如，根据本发明，通过调节微生物培养中的通氧量，由本发明宿主产生的糖与相应糖醇的比率能够在很大范围内变化。
不论发酵条件是否针对所需要产物的生产或产物的选择进行过优化，在本发明方法中宿主发酵所用的碳源都可以是葡萄糖、或另一种能够通过与代谢葡萄糖的糖酵解或PPP途径有至少某些共同步骤(即重叠)的途径进行代谢的六碳糖。这些其它的糖的例子包括果糖和甘露糖。在本发明范围内还可以考虑使用的碳源是包含这些六碳糖的寡糖和多糖，如蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、菊粉、淀粉等。这些碳源可以单独或混合使用，例如转化糖或高果糖的糖浆。戊糖也可以用作底物糖混合物的一部分。在本发明框架中，戊糖的角色局限于被作为共底物而不是主要底物(例如，作为再生NADP+的“电子库(electron sink)”)。
在另一实施方案中，利用重组XPDH基因序列，构建了表达或过表达XPDH基因的宿主。本发明人在鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)和R.halodurans.中鉴定到此序列。来自艰难梭菌(C.difficile)的相似序列(SEQID NO51、52和53)也可以应用于此方面。这些宿主对于在如下途径中产生木糖醇尤其有用，该途径通过XPDH将木酮糖-5-P转化成木糖醇-1-P，然后利用磷酸酶将木糖醇1-P转化成木糖醇。如实施例(实施例28)所示，这种菌株的培养液包含有木糖醇，然而在对照菌株的培养基中不能检测到木糖醇。
在另一个实施方案中，首次对阿拉伯糖醇-磷酸脱氢酶基因进行了克隆，并且构建了表达这个基因的宿主。来自鸟肠球菌(E.avium)的序列(SEQID NO68)含有一个由352个密码子构成的开放阅读框，该阅读框前面具有一个典型的核糖体结合位点。推导出的氨基酸序列在SEQ ID NO69给出。此酶是可逆的，它可将D-阿拉伯糖醇-5-磷酸转化成D-木酮糖-5-磷酸，反之亦然。因此，可以在通过将D-木酮糖-5-磷酸转化成D-阿拉伯糖醇-5-磷酸制备D-阿拉伯糖醇(CAS No.488-82-4)(也称为D-arabinitol)的方法中，应用本发明的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶。此序列可以用于鉴定其它的可用序列，如SEQ ID NO70，以前有报道说这个序列是山梨糖醇脱氢酶，而本发明人发现它是来自B.halodurans.的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶。
可以在其中实施本发明的宿主范围包括细菌和真菌。真菌优选酵母。具体来说，具有GRAS状态的微生物种如酵母酿酒酵母或革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌都适于作为本发明的宿主。其它适用的宿主有酵母的许多种类，例如属于如下属的酵母酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomycesi)、假丝酵母属(Candida)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如，Zygosaccharomyces rouxii、产朊假丝酵母(Candida utilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))；丝状真菌如来自如下属的那些曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)或木霉属(Trichoderma)等等(例如黑曲霉(Aspergillus niger)、娄格法尔特氏青霉(Penicillium roqueforti)、Trichoderma reesei)；或细菌如埃希氏杆菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属、乳酸细菌等的各个种(例如大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，乳乳杆菌(Lactobacillus lactis)，树干毕赤酵母(Pichia stipitis)以及脉胞菌属(Neurospora)、毛霉属(Mucor)和Fisarium属的各个种)。
优选的执行本发明的遗传修饰技术是重组DNA技术(遗传工程)。此技术主要应用于两种类型的工作。第一种是对所选择宿主的功能性野生型基因进行失活。另一种相反类型，其工作是引入和表达异源基因，此基因编码的酶在本发明的宿主中缺失或表达水平不足。后一类型工作的变化形式是过表达宿主的同源基因，此基因在野生型菌株中以亚最佳水平表达。
对本发明宿主的野生型基因的定向失活可以利用任何一种本领域已知的方法来完成。例如，在宿主内产生特异针对靶基因的反义RNA。可以在靶基因表达所需要的“辅助”基因，如转录激活剂或抗终止子中进行突变。以基因的染色体野生型拷贝和相同基因在体外构建的无活性拷贝之间进行的同源重组作为基础的基因失活技术，称为“基因破坏”，是实施本发明“基因失活任务”的优选方法。这一技术是本领域的技术人员所熟知的。体外失活靶基因的优选方法是构建一个包含此基因的克隆拷贝的质粒。接下来将编码序列打断，或者利用编码遗传选择标记的DNA如抗生素抗性基因或弥补宿主营养缺陷型突变的基因，代替部分编码序列。然后将质粒构建体或其部分用于转化所选择的宿主，使之具有抗生素抗性或成为原营型。除了重组DNA技术，也可以应用基于随机化学、放射性诱变或自发突变、然后对靶突变体进行筛选的传统遗传技术。
本发明中异源基因的表达或同源基因的过表达可以通过许多方法完成。优选的方法是在体外构建一个所谓的“表达盒”，它包含一个在所选宿主中具有功能的启动子及随后的待(过)表达的基因编码区和一个转录终止信号。当然，如果待表达基因的天然启动子在所选宿主中具有活性，则包含编码序列和侧翼5′和3′区域的未修饰基因不需任何修饰就可以是这样一个“盒”。然后可以将表达盒引入本发明的宿主中作为多拷贝质粒的一部分，所述质粒稳定保持在宿主中或整合到染色体中。
许多不同的启动子可应用于这种表达盒中，优选地，该启动子在其被应用的宿主中具有强至中等的强度。启动子可以是可调节的或组成型的。优选地，应当使用不受葡萄糖抑制的、或者在培养基中有葡萄糖存在时只轻微受到抑制的启动子。只是提及许多可适用启动子中的少数，就可以提及例如，糖酵解基因启动子如枯草芽孢杆菌tsr基因(编码果糖二磷酸醛缩酶)的启动子或酿酒酵母GAPDH(编码甘油醛磷酸脱氢酶)的启动子(BitterG.A.，Meth.Enzymol.152673-684(1987))。其它强启动子有，例如，面包酵母的ADHI启动子(Ruohonen L.，等，J.Biotechnol.39193-203(1995))，磷酸饥饿诱导型启动子如酵母的PHO5启动子(Hinnen，A.等，《酵母遗传工程》(Yeast Genetic Engineering)，Barr，P.J.等编，Butterworths(1989)，或来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等，J.Gen.Microbiol.1371127-1133(1991))。可以构建基因组DNA的噬菌体表达文库，从其中可以获得与例如酿酒酵母的相应基因相似的任何所需的糖代谢基因。
本发明微生物菌株的有用特征不局限于通过使具有已知功能的基因失活或过表达来实现。这些菌株的某些特征优选通过随机化学诱导或自发的突变、然后筛选性能改进的菌株来获得。一种特别有效的筛选方法(由本发明人意外发现的)以获得在转酮酶基因中带有突变的、表现出改良的生长性质的突变株为基础。发现大多数此种突变株能够转化葡萄糖得到不同谱系的五碳糖，而亲本不能进行这种转化。具体来说，通过此方法可以实现D-木酮糖产量的极为明显的增加。可以通过检测各种糖和PPP中间物的试验、以及检测PPP酶活性的试验，对突变株进行表征。PPP酶活性的检测可以利用本领域已知的方法，例如Alexander，M.A.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.29282-288(1988)所描述的方法。
在本发明的宿主和方法中产生的发酵产物，可以单独获得(以分离的形式)或以混合物的形式与其它发酵产物，或其它的糖或糖醇一起(即，作为提取物或以部分纯化的形式)获得。用于纯化五碳糖及其糖醇的方法是已知的。例如，D-木糖可以从纤维素加工的侧流中分离得到，并经氢化生产出木糖醇。从培养基中纯化这些化合物(包括D-核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、D-木酮糖-5-磷酸、D-核酮糖、D-木酮糖、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、D-木糖、D-阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇)的方法是本领域众所周知的，并包括各种形式的柱色谱(例如，离子交换，吸附，反相色谱等)和结晶。沉淀难溶性的钡盐和钙盐也可以用于纯化五碳糖磷酸。
克隆的XPDH基因及其蛋白质
对编码木糖醇磷酸脱氢酶(XPDH)的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)基因进行克隆和翻译。SEQ ID NO48显示了在pBK(LRXPDH)质粒上提供的该核苷酸序列。此序列包括349氨基酸构成的开放阅读框(SEQ ID NO49)，并以较不常用的起始密码子TTG起始。
鼠李糖乳杆菌XPDH序列的推导氨基酸序列与几种其它中等链长脱氢酶的序列同源，尤其是例如B.halodurans和艰难梭菌中的那些脱氢酶——但它们的底物或是未知的或被错误指定。例如，尽管SEQ ID NO50是来自B.Halodurans的XPDH的氨基酸序列(GenBank PIDg1072799)，却被作为山梨糖醇脱氢酶列出。SEQ ID NO51-53一直没有得到注释SEQ IDNO51是来自艰难梭菌的一个序列，它显示出与鼠李糖乳杆菌XPDH具有一些同源性。SEQ ID NO52是来自艰难梭菌的一个相似序列。SEQ ID NO53是来自艰难梭菌的另一个相似序列。
艰难梭菌酶与鼠李糖乳杆菌XPDH具有以下同源性，SEQ ID NO 5152％相同残基，E值(通过NCBI WWW互联网址提供的BLAST算法计算)e-109。SEQ ID NO 5237％相同残基，E值(通过NCBI WWW互联网址提供的BLAST算法计算)e-68。SEQ ID NO 5337％相同残基，E值(通过NCBI WWW互联网址提供的BLAST算法计算)e-65。
经过实验证明具有XPDH的功能的B.halodurans酶具有较低的同源性数值
SEQ ID NO 5036％相同残基，E值(通过NCBI WWW互联网址提供的BLAST算法计算)e-63
克隆的APDH基因及其蛋白质
对编码阿拉伯糖醇-磷酸脱氢酶(APDH)的鸟肠球菌基因进行克隆和翻译。编码此基因的核苷酸序列如SEQ ID NO68所示。此序列包括349个氨基酸构成的开放阅读框(SEQ ID NO69)。
鸟肠球菌APDH序列的推导氨基酸序列与几种其它中等链长脱氢酶的序列同源，尤其是例如具有被报道为B.halodurans中的一种山梨糖醇脱氢酶的序列的脱氢酶(SEQ ID NO70)。
多核苷酸
除非有其它说明，此处所有的通过DNA分子的序列分析测定的核苷酸序列都是按实施例中描述的方法进行测定的，所有由本文测定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列都是通过翻译上述所测定的DNA序列来进行预测的。因此，正如本领域所知的对利用此方法测定的任一DNA序列来说，此处测定的任一核苷酸序列可能都有一些错误。由自动装置测定的核苷酸序列典型地达到至少约35％的同一性，例如至少55％、65％、75％、85％或至少95％的同一性。更典型地，它们与测序的DNA分子的真实核苷酸序列有约80％或90％同一性。真实序列可以通过其它方法(包括本领域已知的人工DNA序列分析法)得到更精确的测定。也正如本领域已知的，同真实序列进行比较在测定的核苷酸序列中插入或缺失一个核苷酸，将会引起核苷酸在翻译中出现移框，以致从发生插入和缺失的点开始，所预测的由被测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列将与实际由被测序的DNA分子编码的氨基酸序列完全不同。
一个核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”，对于DNA分子或多核苷酸来说，是指一段脱氧核糖核苷酸序列，而对于RNA分子或多核苷酸来说，是指相应的核糖核苷酸序列(A，G，C和U)，此时特定脱氧核糖核苷酸序列中的每一个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)被尿嘧啶核糖核苷酸(U)所代替。
“功能性”是指核苷酸序列执行的功能与另一个同源核苷酸序列的功能相当，如编码与所描述的酶具有相同活性(如驱动相同反应)的酶。
利用本文提供的信息，如在附图和序列表中列出的核苷酸序列，编码XPDH或APDH多肽、或者它们的融合蛋白嵌合结构的本发明核酸分子，可以通过标准的克隆和筛选程序获得，如那些用于克隆染色体DNA、或以mRNA为起始物质克隆cDNA的程序。在实施例中描述的，作为本发明举例说明的XPDH或APDH核酸分子，是从来自鼠李糖乳杆菌的染色体DNA文库中发现的。
正如文中所示，本发明的核酸分子既可以以RNA形式如mRNA存在，也可以以DNA形式存在，包括例如通过克隆获得的或合成产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链。单链的DNA或RNA可以是编码链，也称有义链，或者它可以是非编码链，也称反义链。
“分离的”核酸分子是指从其天然环境中被转移出来的一段核酸分子，DNA或RNA。例如，对于本发明来说，包含在载体中的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中的被纯化(部分地或基本上地)的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录本。本发明中分离的核酸分子还包括合成产生的这类分子。
本发明的分离的核酸分子包括如下DNA分子，该DNA分子包含一个能够编码本发明XPDH或APDH蛋白、或含有它们的融合蛋白的开放阅读框(ORF)。对这类融合蛋白可以进行工程化，以便例如为XPDH或APDH多肽或其转录本提供附加的活性或功能，或者提供一种功能以帮助在宿主生产后纯化XPDH或APDH蛋白。因此，举例来说，可将多肽与标记序列如肽融合，后者使融合(含有标记)多肽的纯化变得容易。在本发明此方面的某些实施方案中，标记序列是六组氨酸肽，例如载体pQE(Qiagen，Inc.)中提供的标签，尤其是，其中的许多已经商业化。例如，如Gentz 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)描述的，六组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。“HA”标签是另一个用于纯化的肽，它相应于流感血凝素蛋白的表位，其描述见Wilson 等，Cell 37767-778(1984).。
在一个实施方案中，XPDH或APDH编码序列与编码信号序列的序列可操作地连接，这样，当进行翻译后，信号序列将产生的XPDH或APDH引导到细胞内或外的所需要的位点。这种信号序列可以是细菌的或真核的，取决于XPDH或APDH是在细菌还是在真核宿主细胞中产生。
包含SEQ ID NO48或SEQ ID NO68所示XPDH或APDH蛋白编码序列或其中所需片断的DNA分子；以及包含一段与上述序列实质上不同的序列、但是由于遗传密码的简并性仍旧能够编码XPDH或APDH蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO49或SEQ ID NO69)的DNA分子。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，对于本领域技术人员来说，产生这样的简并性变体是常规操作。
本发明不仅提供上文描述的核酸分子，而且提供具有与上述序列互补的序列的核酸分子。这类分离的分子，尤其是DNA分子，可作为探针用于通过与染色体原位杂交进行基因作图，以及用于通过例如Northern印迹分析检测XPDH或APDH基因在不同物种中的表达。
本发明还提供从完整的多核苷酸序列的5′和3′末端缺失了不同残基、但保留了阅读框并且仍旧能够编码具有XPDH或APDH催化活性的XPDH或APDH的多核苷酸。因此在实施方案中，这类多核苷酸编码的本发明多肽从完整多肽的N-末端或C-末端缺少了不同残基，但保持了XPDH或APDH的催化活性。
因此本发明提供分离的核酸分子，包括(1)编码具有SEQ ID NO49所示氨基酸序列的鼠李糖乳杆菌XPDH多肽的多核苷酸，特别是SEQ ID NO48所示多核苷酸序列；或者编码具有SEQID NO69所示氨基酸序列的鸟肠球菌APDH多肽的多核苷酸，特别是SEQ IDNO68所示多核苷酸序列；(2)编码XPDH或APDH序列中的有用肽片断的多核苷酸，这种有用片断包括但不限于提供酶活性的片断，即具有催化活性的XPDH或APDH蛋白；以及(3)编码如上所述的、但是缺失了N-末端甲硫氨酸的XPDH或APDH多肽的多核苷酸。
本文描述的分离核酸分子的片断保持了所需的性质或者它编码的多肽保持了所需的性质或活性。如上所述的分离核酸分子的片断所指的片断，长至少约15个核苷酸(nt)，并且更优选至少约20nt，再更优选至少约30nt，甚至更优选至少约40nt，可用作在此讨论的探针和引物，或者用于给融合蛋白构建体提供所需要的基序或结构域。当然，根据本发明长度为50-300nt，或甚至600nt的较大片断也具有用处，正如相应于SEQ ID NO48或68所示大部分(即使不是全部的)DNA核苷酸序列的片段或编码SEQ IDNO49或69的片段也是有用的。举例来说，与SEQ ID NO48或68所示的片断进行比较，长至少20nt的片断是指包括SEQ ID NO48或68所示核苷酸序列中的20个或更多个连续碱基的片段。
具体地，本发明提供如下多核苷酸，它具有的一段核苷酸序列是SEQID NO48或68所示序列的一部分、或者编码SEQ ID NO49或69所示的氨基酸序列。本发明还考虑编码缺失氨基末端甲硫氨酸的XPDH多肽的多核苷酸。本发明也提供了由这些多核苷酸编码的多肽，该多肽包含一个起始于SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的第2位、但缺失氨基末端甲硫氨酸的氨基酸序列。
另一个方面，本发明提供分离的核酸分子，该分子所包含的一段多核苷酸在严紧杂交条件下与如上描述的本发明核酸分子中的部分或优选全部的多核苷酸杂交，特别是与SEQ ID NO48或68或其互补序列杂交。“严紧杂交条件”是指在溶液中42℃孵育过夜，该溶液中含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20μg/ml变性的经剪切的鲑鱼精子DNA，之后在0.1×SSC中约65℃洗涤滤膜。
一段多核苷酸能够与多核苷酸的一部分杂交是指多核苷酸(DNA或RNA)能够杂交参照多核苷酸的至少约15个核苷酸(nt)，更优选至少约20nt，再更优选至少约30nt，甚至更优选约30-70(如50)nt。它们可用作如上所讨论的和下文进一步详述的探针和引物。
举例来说，“长至少20nt”的多核苷酸部分是指来自参照多核苷酸(例如，SEQ ID NO48或68所示核苷酸序列)的核苷酸序列中的20或更多个连续的核苷酸，当然，只能与poly A序列或者T(或U)残基组成的互补链进行杂交的多核苷酸不包括在用于杂交本发明核酸的一部分的本发明多核苷酸之内，因为这样的多核苷酸缺少特异性，并且能够与任何包含poly A序列或者其互补序列的核酸分子(例如，几乎任何双链cDNA克隆)杂交。
正如已经说明的，编码XPDH多肽的本发明核酸分子可以包括，但不限于该多肽的编码序列本身；该多肽和附加序列的编码序列，附加序列的例子有编码前导或分泌序列的那些序列，如前-，或原-或前原-蛋白质序列；与附加的非编码序列连在一起、并具有或不具有前面提到的附加编码序列的该多肽编码序列，所述非编码序列包括但不局限于例如，内含子和非编码的5′和3′序列，如在转录、mRNA加工(包括例如剪接和聚腺苷腺化信号)、mRNA的核糖体结合和稳定信号中起作用的被转录但不被转译的序列；编码附加氨基酸如提供附加功能的那些氨基酸的附加编码序列。
变体和突变多核苷酸
本发明还涉及本发明核酸分子的变体，它编码XPDH的部分、类似物、或衍生物。变体可以在自然界发生，如天然的等位基因变体。“等位基因变体”是指在生物染色体上占有一个特定位点的一个基因的几种交替形式中的一种。Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wiley & Sons，New York(1985)。非天然发生的变体可以利用本领域已知的诱变技术产生。
这类变体包括通过核苷酸的替代、缺失或添加产生的那些变体。替代、缺失或添加作可以涉及一个或多个核苷酸。变体可以在编码区、非编码区、或两个区域同时发生变化。在编码区发生改变可以引起保守的或者非保守的氨基酸替代、缺失或添加。其中特别优选沉默替代、缺失或添加，这类变化不改变XPDH多肽或其部分多肽的性质和活性。从这点来说，还特别优选保守替代。
本发明其它实施方案包括分离的核酸分子，该分子包含具有编码如下多肽的核苷酸序列，尤其是那些在严紧杂交条件下能够与其杂交的那些核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO49或69所示的完整氨基酸序列相比，至少具有35％同一性，更优选至少具有55％、65％、75％、85％和95％同一性。能够与上述序列杂交的这样的多核苷酸，在严紧杂交条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
在实际情况下，任一具体的核酸分子与例如SEQ ID NO48所示核苷酸序列的同一性是例如35％、55％、75％、85％还是95％，可以常规地利用已知的计算机程序如Bestfit program(Wisconsin序列分析软件包，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University ResearchPark，575 Science Drive，Madison，WI 53711)进行测定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981)的局部同源算法，找到两个序列之间的最佳同源区段。当使用Bestfit或者任何其它的序列比对程序来测定一个具体的序列(举例来说)与本发明的参照序列是否具有95％的同一性时，首先设定参数，当然这种同一性百分数的计算是对参照核苷酸序列的全长进行的，并且允许同源比较中的短缺区(gap)不超过参照序列总核苷酸数的5％。
在另一个实施方案中，本发明的变体多核苷酸包括与SEQ ID NO48或68所示的核酸序列具有至少35％、55％、65％、75％、85％、95％或99％同一性的核酸分子，而不论它们是否编码具有XPDH或APDH活性的肽。这是由于即使一个具体核酸分子不编码具有XPDH或APDH活性的多肽，本领域技术人员仍知道如何利用这个核酸分子，例如作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)的引物。不编码具有XPDH活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括，尤其是(1)从cDNA文库中分离XPDH或APDH基因或者它们的等位基因变体；(2)与分散的中期染色体进行原位杂交，获得XPDH或APDH基因的精确染色体位点；和Northern印迹分析用于探测在特定组织中mRNA的表达。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将能够立即意识到，大量具有与SEQ ID NO48或68所示核酸序列有同一性的同源序列的核酸分子将能够分别编码具有XPDH或APDH酶(即催化)活性的多肽。实际上，由于核苷酸序列的所有简并变体都能够编码相同的多肽，即使没有进行上述的比较实验，这一点对技术人员也是很清楚的。本领域技术人员也将意识到，对于不是简并变体的核酸分子，适当数量的也将编码具有XPDH或APDH酶(催化)活性的多肽。这是因为技术人员十分明了较少可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸替代(例如，将一个脂肪族的氨基酸用另一个脂肪族的氨基酸替代)，如下文的进一步描述。
载体和宿主细胞
本发明也涉及包含本发明核酸分子的载体，利用本发明的重组载体遗传工程化的宿主细胞，通过重组技术对XPDH或ADPH多肽或其片断的制备，及它们的用途。
可以将本发明的多核苷酸连接到含有选择标记的载体中以便在宿主中进行繁殖。通常，将质粒载体引入沉淀物如磷酸钙沉淀中、或者引入具有带电荷脂质的复合体中。如载体是病毒，则可以利用适当的包装细胞系在体外对其进行包装然后转导宿主细胞。
为表达编码蛋白，应该将编码这个蛋白的DNA插入序列与能够在所需要的宿主中指导转录的适当启动子进行操作连接。有用的原核启动子的实例有枯草芽孢杆菌degQ启动子(尤其是其degQ36突变体)、噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子，这里仅提及了一部分。也可以使用天然启动子。其它适用的启动子对技术人员来说是已知的。表达构建体还将包括用于转录起始、终止的位点、以及在转录后的区域中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录本的编码部分将优选包括位于起始点的翻译起始密码子和适当地位于待翻译的多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
正如所说明的，表达载体将优选包括至少一个选择标记。这样的标记包括用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性和用于培养枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及其它细菌的四环素或氨苄青霉素抗性。合适宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇属(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞。优选的宿主包括微生物细胞，尤其是细菌和酵母细胞。如果需要，哺乳动物细胞也可用来作为克隆基因的宿主。用于上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域已知的。
优选用于细菌的载体包括pQE70、pQE60和pQE-9，可从Qiagen获得；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可从Stratagene获得；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可从Pharmacia获得。其它适用载体是技术人员容易明了的。
可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法将构建体引入宿主细胞。这些方法在许多标准实验手册，如Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)中都有描述。多肽及片断
本发明还提供具有SEQ ID NO49所示氨基酸序列编码的氨基酸序列的分离或纯化的XPDH多肽，或含有上述多肽的一部分的肽或多肽，特别是如上所描述的由上述核酸分子编码的那些。
本发明还提供了XPDH蛋白(特别是由上述的多肽核苷酸编码的)的融合蛋白，例如，其中XPDH氨基酸序列与信号序列或一条多肽融合，以提高XPDH蛋白在宿主细胞中、在进行纯化过程中或在随后的处理和贮藏时的稳定性和持久性。而且，例如可以将肽部分加到多肽上以利于纯化，如上文所述。可以在多肽的最后制备步骤之前将这些区域去除。尤其是，将肽部分加到多肽上以造成分泌或排泄、提高稳定性和利于纯化，这些都是本领域的熟知和常规技术。
如上所述的XPDH蛋白可以通过熟知方法从重组细胞培养物中进行回收和纯化，这些方法包括硫酸氨或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选应用高效液相色谱(″HPLC″)进行纯化。
本发明的XPDH或APDH多肽包括天然的纯化产物、化学合成方法所得的产物、以及利用重组技术从原核或真核宿主生产的产物，其中的宿主包括，举例来说，微生物细胞如细菌和酵母(特别是枯草芽孢杆菌和酵母属)，以及高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。另外，在某些情况下作为宿主介导的方法的结果，本发明的多肽也可以包括最初未经修饰的甲硫氨酸残基。
XPDH或APDH多核苷酸和多肽根据本发明可以具有许多用途，尤其是利用XPDH或APDH的化学和生物性质的用途。
变体和突变多肽
为了改善或改变XPDH或APDH多肽的特征，可以应用蛋白质工程。为本领域专业技术人员熟知的重组DNA技术可以用于制备包括了单个或多个氨基酸替代，缺失，添加的新突变蛋白或″突变蛋白(muteins)″、或融合蛋白。这些被修饰的多肽能够显示出，例如增强的活性或增加的稳定性。另外，它们可以纯化得到较高的产量，而且显示出至少在某些纯化和贮藏条件下比相应的天然多肽具有较好的溶解性。
N-末端和C-末端缺失的突变体
举例来说，对许多蛋白质包括膜结合蛋白的细胞外结构域或者分泌蛋白的成熟形式，本领域已知可以从N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸而不会造成蛋白质的生物功能的实质性丧失。
然而，即使从蛋白质的N-末端缺失一个或多个氨基酸导致此蛋白质的一种或多种生物功能受到修饰或者丧失，其它生物活性也仍可以保持。因此，将完整蛋白或细胞外结构域的少于大多数的残基从N末端去除时，通常被截短蛋白质仍旧可以保持诱导和/或结合抗体的能力，其中所述抗体能够识别全部或部分的XPDH或APDH蛋白。缺少全蛋白N-末端残基的具体多肽是否保持了这种免疫活性，可以很容易地利用此处描述的和否则为本领域已知的常规方法进行测定。
因此，本发明还提供从SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。
然而，即使从蛋白质的C-末端缺失一个或多个氨基酸能够导致此蛋白质的一种或多种生物功能受到修饰或者丧失，其它生物活性也仍可以保持。因此，将完整蛋白或细胞外结构域的少于大多数的残基从C-末端去除时，通常被截短蛋白质仍旧可以被保持诱导和/或结合抗体的能力，其中所述抗体能够识别完整或成熟形式的蛋白。缺少全蛋白C-末端残基的具体多肽是否保持了这种免疫活性，可以很容易地利用此处描述的和否则为本领域已知的常规方法进行测定。本发明也提供从氨基和羧基末端同时缺失一个或多个残基的多肽。
其它突变体
除了上述讨论的蛋白质的末端缺失形式，本领域普通技术人员也将明了，XPDH或APDH多肽的一些氨基酸序列可以被改变而不会显著影响蛋白质的结构或功能。技术人士将明了蛋白质上有决定活性的关键区域。因此，本发明还包括XPDH或APDH多肽的各种变体，它们显示了XPDH或APDH多肽的基本活性，或者它们包含了XPDH或APDH多肽中诸如那些保持XPDH或APDH酶活性的区域。这样的突变体包括缺失、插入、倒位、重复、以及类型替代。对于哪一种氨基酸变化可能是表型沉默的，其有关指导参见Bowie，J.U.等，″解译蛋白质序列中的信息对氨基酸替代的耐受性″Science 2471306-1310(1990).
因此，SEQ ID NO49或69所示多肽的片断、衍生物、或类似物可以(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基，更优选至少一个但小于10个保守氨基酸残基)替代，并且这些替代氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的残基；或者(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基团；或者(iii)其中成熟或可溶性的细胞外多肽与另一个化合物融合，如一个能够提高该多肽的半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)；或(iv)其中将附加氨基酸融合到前导或分泌序列上或用于纯化成熟多肽的序列上或原蛋白序列上。从本文的教导，这些片断、衍生物和类似物被认为属于本领域技术人员的范围。
因此，本发明的XPDH或APDH可以包含即可以来自天然突变也可以由人为操作引起的一个或多个氨基酸的替代，缺失或添加。正如所说明的，优选地变化具有次要性质，如不会显著影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸替代，见下示。
本发明XPDH或APDH蛋白中的功能所必需的氨基酸可以通过本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989))。后一种方法在分子中的每一个残基位置引入单丙氨酸突变。然后检测所得突变分子的生物活性如受体结合或体外繁殖的活性。
本发明的多肽优选以分离的形式进行提供。“分离的多肽”是指从天然环境中被转移出来的多肽。根据本发明，由重组宿主细胞产生的多肽和/或含在重组宿主细胞内的多肽被认为是分离的。“分离的多肽”也可以指已经从重组细胞中被部分地或基本上地纯化出来的多肽。例如，重组产生的XPDH多肽可以利用纯化鼠李糖乳杆菌天然XPDH蛋白的方法进行基本上的纯化，该方法描述在Hausman和London，J.Bacteriol169(4)1651-1655(1987))。优选将本发明的多肽纯化到足以进行序列分析的程度，或者纯化到一定程度以便它代表了制剂中99％的蛋白质性物质。
本发明人发现了XPDH基因、APDH基因、并发现可以将它们重组应用于微生物宿主中生产木糖醇和/或阿拉伯糖醇。尤其是，XPDH酶可以用于被XPDH将木糖醇-5-P转化成木糖醇-1-P、然后利用例如磷酸酶将木糖醇-1-P转化成木糖醇的途径。木糖醇优选从细胞中分泌出来，并以纯化和分离的形式进行回收。在其它实施方案中，XPDH类似物，如SEQ ID NOs50，51、52和53也可以作为XPDH的替代物用于本发明的方法，尤其是用于木糖醇的重组生产。而且，特别的是，APDH活性在用于生产阿拉伯糖醇的方法中是有用的，并且APDH类似物如SEQ ID NO70可以代替APDH应用于其中。
本发明包括与含有SEQ ID NO49或69所示序列的多肽有至少35％同一性、更优选至少55％或75％同一性、再更优选具有至少85％、95％或99％同一性的多肽，本发明还包括具有至少30个氨基酸、更优选至少50个氨基酸的该多肽的一部分。
在实际情况下，任一具体的核酸分子与例如SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的同一性是例如至少35％、55％、65％、75％、85％、95％还是99％，可以常规地利用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析软件包，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)进行测定。当使用Bestfit或者任何其它的序列比对程序来测定一个具体的序列，举例来说，与本发明的参照序列是否具有95％的同一性时，当然对参数进行，以便这种同一性百分数的计算是对参照氨基酸序列的全长进行的，并且允许同源比较中的断缺区不超过参照序列总残基数目的5％。
具有XPDH或APDH活性的本发明多肽可以在体内或体外用于提供这种活性，例如，在对它们进行测试的试验中、或对代谢物如该酶的底物或产物进行测试的试验中、或与更多的多酶系统偶联使用。
因此我们在如下实施例中对本发明进行更详细的描述。下面的实施例只是用于说明的目的并不应认为限制本发明的范围。
实施例
此处提供的实施例对上述讨论进行补充，部分概述如下
实施例1，2和3示例了细菌宿主，宿主中的核糖-5-P异构酶活性被减少或消除。
实施例2和3示例了细菌宿主，宿主中的转酮酶活性被减少或消除。
实施例5示例了细菌宿主，宿主中的核酮糖-5-P 3-差向异构酶活性被增强或修饰。
实施例6示例了细菌宿主，宿主中的木酮糖-5-P向木酮糖的转化被增强或修饰。
实施例7示例了细菌宿主，宿主中的木糖醇脱氢酶活性被增强或修饰。
实施例9示例了细菌宿主，宿主中的塔格糖差向异构酶活性被增强或修饰，用于核酮糖向木酮糖的转化。
实施例10示例了细菌宿主，其中利用基于ATP依赖性激酶的己糖吸收和磷酸化系统对葡萄糖PTS(PEP依赖运输)系统活性进行修饰，替代或补充。
实施例11示例了细菌宿主，其中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡糖酸脱氢酶的活性被增强或修饰。
实施例12示例了酵母宿主，其中转酮酶和木酮糖激酶活性被消除，并且引入木糖醇脱氢酶活性。
实施例13示例了酵母宿主，其中5-碳糖磷酸的累积被增强。
实施例14，15，17，20和22示例了酵母宿主，其中多元醇和/或戊糖的累积被增强。
实施例15示例了酵母宿主，其中通过具有不同底物特异性的木糖醇脱氢酶使产生的木糖醇和核糖醇的比率发生改变。
实施例16和17示例了酵母宿主，其中引入了作用于5-碳糖磷酸的去磷酸化酶，并且多元醇和戊糖的累积被增强，多元醇和戊糖的比率发生改变，以及葡萄糖进入PPP的碳流被增强。
实施例18示例了酵母宿主，其中葡萄糖磷酸异构酶活性被减少或消除。
实施例19示例了酵母宿主，其中转酮酶和葡萄糖磷酸异构酶活性被消除。
实施例20示例了酵母宿主，其中6-磷酸果糖-2-激酶活性被消除。
实施例21示例了酵母宿主，其中电子库被增强或修饰用于再生NADP+。
实施例21和22示例了酵母宿主，其中细胞辅因子平衡被修饰用于再生NADPH+。
实施例23示例了酵母宿主，其中利用传统诱变获得增强的多元醇和戊糖的生产。
实施例25描述了对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhammosus)的木糖醇磷酸脱氢酶(XPDH)的克隆。
实施例26描述了表达载体pGTK74(LRXPDH)和pGTK74(BHDH)的构建。
实施例27描述了对鼠李糖乳杆菌和R.Halodurans的木糖醇磷酸脱氢酶基因(XPDH)的表达。
实施例28例证了利用表达XPDH的重组枯草芽孢杆菌菌株生产木糖醇的方法。
实施例29例证了枯草芽孢杆菌glcUgdh操纵子的过表达。
实施例30描述了鸟肠球菌(Enterococcus avium)的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的纯化和部分序列分析。
实施例31描述了枯草芽孢杆菌中来自鸟肠球菌和B.halodurans的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的表达。
实施例32描述了利用枯草芽孢杆菌重组菌株生产阿拉伯糖醇。
实施例1
编码D-核糖-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌rpi基因的克隆
在此工作开始时，还没有获得枯草芽孢杆菌完整的基因组序列。而且，还不知道枯草芽孢杆菌中是否包含一个或多个D-核糖-磷酸异构酶基因(已知大肠杆菌中含有两个)。因此，克隆rpi基因的对策是基于大肠杆菌中D-核糖营养缺陷型突变的功能互补，而不是PCR。目前，优选的克隆rpi基因的方法是根据PCR进行的技术而不是如下面示例了方法。然而，本实施例描述的方法足以实施本发明。
从枯草芽孢杆菌(ATCC 6051)的DNA构建一个基因文库。利用限制性内切酶Sau 3A对此菌株进行部分酶切并利用制备型琼脂糖凝胶电泳分离出大小超过3kb的片断。除非其它说明，本发明的研究使用的是已知的标准基因工程方法(Maniatis，T.，等，(1982，Molecular cloning，ColdSpring Harbor Laboratory)。通过ZAP表达预消化载体/Gigapack克隆试剂盒(Stratagene，USA)，利用此片断构建枯草芽孢杆菌基因文库。除了以大肠杆菌AS11菌株(rpiA-从遗传贮藏中心http//cgsc.biology.yale.edu获得的D-核糖营养缺陷型)取代厂商建议的菌株之外，根据厂商的说明将文库转变成质粒形式。将质粒形式文库的等分试样转移到含有标准的大肠杆菌矿物培养基(M9)。从生长于该培养基上的菌落分离出质粒并进行限制性分析。通过限制性分析，大部分质粒显现出重叠。对最高丰度的群体的一个克隆进行详细限制性分析，表明它是从枯草芽孢杆菌染色体的已测序部分衍生出来的。这一区域包含一个开放阅读框，它与大肠杆菌的rpiB编码区具有较强同源性。
实施例2
构建包含rpi-和tkt-突变的枯草芽孢杆菌菌株
从获自芽孢杆菌遗传贮藏中心(BGSC，Ohio，USA)的质粒pMK4中分离出氯霉素抗性基因。以DraI和EcoRI对pMK4进行消化，利用制备型琼脂糖凝胶电泳从消化物中分离出1.9kb的片断，并利用Sau3A对其进行进一步消化。从此消化物中分离出纯化的0.83kb片断，在所有四种脱氧核苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶I的Klenow片断对纯化的0.83kb的片断处理。然后将此片断与质粒p131(实施例1)进行连接，后者是利用SfuI消化并同样利用Klenow片断处理。在利用连接混合物转化大肠杆菌之后，将包含有被氯霉素抗性基因中断的枯草芽孢杆菌rpi基因的质粒p131-Cm2分离出来(附图2)。
用EcoRI和PstI消化p131-Cm2，并利用枯草芽孢杆菌的天然感受态，用所得的消化物转化枯草芽孢杆菌的菌株BD170(trpC2，thr-5，来源于BGSC)，使之具有氯霉素抗性。转化流程是按照所谓的“Paris方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus，Harwood和Cutting，编，John Wiley and sons，Chichester，NY(1990)，pp.148-149)进行的。以单个克隆的染色体DNA制备物(Molecular Biological Methods for Bacillus，Harwood和Cutting，编，John Wiley and sons，Chichester，NY(1990)，p65)为模板和以寡核苷酸对oCA5(SEQ ID NO1)和oBS-RPI3(SEQ ID NO2)为引物，通过运行PCR反应筛选出转化体。应用于此处以及随后实施例中的标准PCR条件(除了特别说明的)是在93℃反应3分钟，接下来的反应进行25个循环60℃反应45秒，72℃反应3分钟以及93℃反应30秒。对此试验(产生一个大约1.35kb的PCR产物)呈阳性的转化体进行进一步克隆，而且对所得的亚克隆的染色体DNA通过利用不同寡核苷酸对(oBS-RPI5(SEQ ID NO3)和oBS-RPI3(SEQ ID NO2))为引物的PCR反应进行检测。选择能够产生预期大小(大约2.1kb，而在野生型枯草芽孢杆菌中为1.25kb)的DNA片断的一个克隆并检验其D-核糖的营养缺陷性。实际上，发现此克隆是D-核糖营养缺陷的，这一点有力地说明枯草芽孢杆菌仅存在一个D-核糖磷酸异构酶基因。此克隆被命名为GX1。
根据已知的枯草芽孢杆菌染色体DNA的序列，对编码转酮酶的枯草芽孢杆菌的tkt基因通过PCR进行克隆。寡核苷酸oBS-TKT5(SEQ ID NO18)作为有义引物，oBS-TKT3(SEQ ID NO19)作为反义引物。将PCR片断克隆到标准实验室载体pUC19得到质粒pUC(TKT)。随后将存在于质粒pDG647中1.6kb BamHI片断(来自BGSC)上的红霉素抗性基因插入pUC(TKT)的MluI位点。质粒pUC(TKT)和pTKTE1的构建说明见附图10。
以SalI和SmaI对质粒pTKTE1进行消化，利用所得的消化物转化枯草芽孢杆菌菌株BD170和GX1获得红霉素抗性。利用oBS-TKT5和oBS-TKT3为引物进行PCR对一套随机的转化克隆进行分析，并筛选出能够产生大约4kb DNA片断的克隆。利用此程序，从BD170衍生的枯草芽孢杆菌菌株被命名为GX4，GX1的相似衍生菌株被命名为GX5。
实施例3
D-核酮糖生产菌株枯草芽孢杆菌的构建
通过实施例2中的方法(除了以十二烷基硫酸钠替代原方案中的十二烷基肌氨酸钠)从菌株GX1中分离出染色体DNA。采用基于天然感受态的方法(实施例2)，用此DNA对生产D-核糖的枯草芽孢杆菌菌株31094(U.S.专利No.3,970,522)进行转化。通过实施例2描述的PCR方法，以及研究这些菌株的葡萄糖发酵产物，筛选转化株。筛选出的一个克隆能够在利用寡核苷酸对oBS-RPI5和oBS-RPI3进行的PCR中产生预期大小的片断，并保持了亲本菌株将葡萄糖转化成五碳糖的能力。rpi被破坏的ATCC 31094衍生菌株被命名为GX2。
实施例4
利用枯草芽孢杆菌重组菌株生产核酮糖
将枯草芽孢杆菌菌株ATCC 31094，GX2，GX4和GX5在LB培养基(细菌用蛋白药(Difco)1％，酵母提取物(Difco)-0.5％，NaCl 1％)上预培养过夜，然后接种到额外添加10％葡萄糖的相同培养基中至最初的OD600为1。将含有约10ml的培养物的20ml试管以水平成约30°角放置在旋转摇床上，在37℃，200rpm培养3天。利用HPLC分析发酵液中的碳水化合物。HPLC分析是在配备有折射率探测器的Hitachi 665A-12液相色谱上进行的。使用了Bio-Rad HPX87P 7.8×200mm柱。在70℃以水平衡柱子并以0.9ml/min流速的水洗脱。HPLC的标准溶液是利用获自Sigma化学公司的试剂制备的。既可以直接从干燥的晶体糖，也可以将糖浆在NaOH片上进行真空干燥直到恒重，然后利用获得的糖制备这些溶液(木酮糖和D-核酮糖)。
从表1的数据可以看出，rpi-突变显著改变了枯草芽孢杆菌菌株产生的五碳糖的谱系。不再产生D-核糖而且D-核酮糖成为主要发酵产物。D-木酮糖的产生变得明显，虽然其产量比D-核酮糖的产量低很多，而在亲本菌株中难以探测到D-木酮糖。通过基因破坏获得的tkt突变体GX4和GX5，产生了与具有化学诱导的tkt突变的菌株ATCC 31094和GX2性质上相似的五碳糖谱系。然而，GX4和GX5比ATCC 31094及其衍生菌的生长稍慢。最可能的解释是菌株ATCC 31094中“代偿性”突变的累积。因此，将这些菌株在葡萄糖丰富的培养基上培养几个周期，然后进行亚克隆(在相同培养基上)并筛选较大、生长较快的克隆，就能够改进GX4和GX5的发酵性能。表1利用具有tkt和rpi基因突变的枯草芽孢杆菌菌株从葡萄糖生产五碳糖(mg/ml).(*)n.d.-低于可信的检测极限(对枯草芽孢杆菌发酵培养基此极限是大约0.15-0.25mg/ml)(**)发酵时间-5天
实施例5
过表达D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的枯草芽孢杆菌菌株的构建
利用下列成分构建用于在枯草芽孢杆菌中过表达D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的载体-pBS(AR2T) ·质粒pGDV1中的革兰氏阳性复制子和氯霉素抗性标记(《芽孢杆菌的分子生物学方法》(Molecular Biology Methods for Bacillus)，
Harwood和Cutting编，John Wiley and Sons，Chichester，NY，82-83
页)(从BGSC获得)； ·质粒pMOB中的大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性标记(Strathmann，
M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881247-1250(1991))； ·质粒pDG783中的卡那霉素抗性基因(Guérot-Fleury等，Gene
167335-336(1995))； ·枯草芽孢杆菌醛缩酶基因(tsr，又称fba)启动子，通过利用寡核
苷酸oALDOP5(SEQ ID NO4)和oALDOP3(SEQ ID NO5)的PCR
克隆得到； ·大肠杆菌中的D-核酮糖5-磷酸差向异构酶基因的编码序列，通过
利用寡核苷酸oRPE5(SEQ ID NO6)和oRPE32(SEQ ID NO7)的
PCR克隆得到； ·枯草芽孢杆菌的糖酵解操纵子的转录终止子，也是通过PCR利用寡
核苷酸oENOT5(SEQ ID NO8)和oENOT3(SEQ ID NO9)克隆得
到的；质粒pBS(AR2T)-Kan的构建由附图.3，4和5进行说明。
利用实施例2和3中描述的方法，以pBS(AR2T)-Kan转化枯草芽孢杆菌菌株GX2。使两株随机选择的转化体的约50ml培养物在250mlErylenmeyer烧瓶中生长过夜(旋转摇床，37℃，200rpm。LB培养基，含有25mg/l卡那霉素)。枯草芽孢杆菌菌株GX2作为对照菌株。除了省去卡那霉素之外，在同样的条件下对其进行培养。制备出细胞提取物并利用已知的方法对D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的活性进行测定(Sasajima，K.和Yoneda，M.，Agr.Biol.Chem.381297-1303(1974))。发现转化体表达的D-核酮糖5-磷酸差向异构酶水平比野生型对照的表达水平(0.3-0.4U/mg蛋白)高约30-50倍(10-20U/mg蛋白)。葡萄糖对醛缩酶启动子活性的影响在后面的独立试验(实施例8)中进行了研究。当培养基中存在葡萄糖时，发现这个启动子(在多拷贝质粒pGT24(MXD2)上控制木糖醇脱氢酶基因的表达)受到适度地抑制(大约3-10倍)。
利用枯草芽孢杆菌菌株过表达D-核酮糖5-磷酸差向异构酶生产五碳糖
在实施例4描述的条件下培养转化了pBS(AR2T)-Kan的GX2。亲本菌株GX2作为对照。培养3-7天之后，通过计算培养液中D-木酮糖和D-核酮糖的比率，检测D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶的表达效果。实际上，此比率增加，虽然只是适度增加(典型地约2倍，从大约5-7％增加到10-12％，表2)。
实施例6
筛选产生增加量的D-木酮糖的枯草芽孢杆菌突变株
将0.1-1ml(每个90mm培养皿)过夜培养(生长于含有25mg/I卡那霉素的LB培养基)的转化了pBS(AR2T)-Kan的GX2置于选择性平板(添加10％ D-木糖和25mg/l卡那霉素的LB)上。平板在37℃下培养约一天。利用亚克隆对出现于平板上的独立菌落(典型地有几十到几百个)进行纯化，然后在LB-葡萄糖培养基上培养，再利用HPLC对产生的五碳糖谱系进行分析。发现利用上述程序筛选出来的一些突变体比亲本菌株产生了明显高水平的D-木酮糖。除了将抗生素从含有木糖的选择性培养基中去除之外，利用同样的筛选/选择程序处理GX2，也得到非常相似的结果。这些试验的结果总结在表2中。菌株GX2的一种过量产生D-木酮糖的突变株被命名为枯草芽孢杆菌GX7，并应用于随后的研究。表2.利用转化了pBS(AR2T)-Kan的枯草芽孢杆菌菌株GX2和GX2的D-木糖抗性突变株从葡萄糖生产D-核酮糖和D-木酮糖。(*)近似值.在此低范围内D-木酮糖浓度的测量只是半定量的。
实施例7
构建过表达木糖醇脱氢酶的枯草芽孢杆菌菌株
质粒pGTK24(MXD2)的构建包括两步。首先，构建通用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌(E.coli-B.subtilis)表达载体pGTK24，它具有枯草芽孢杆菌醛缩酶基因的启动子和烯醇化酶基因的转录终止子。质粒pGTK24的构建涉及以下遗传工程操作
·大肠杆菌的复制起点通过以pUC19为模板和利用两种寡核苷酸oOR15
(SEQ ID NO10)和oORI32(SEQ ID NO11)为引物的PCR进行扩
增；PCR片断利用EcoRI和BclI进行消化，并且与使用同种酶消化的
pGDV1进行连接。所得的质粒被命名为pGT21。
·利用SalI和EcoRI消化pGT21并与一对合成的寡核苷酸oPLI5(SEQ ID
NO12)和oPLI3(SEQ ID NO13)进行连接，得到质粒pGT22。
·利用以枯草芽孢杆菌的染色体DNA为模板和两种寡核苷酸oENOT5
(SEQ ID NO8)和oENOT3(SEQ ID NO9)进行的PCR分离出枯草芽
孢杆菌糖酵解操纵子(烯醇化酶基因)转录终止子。PCR产物利用BamHI
和HindIII消化并克隆到由同种限制性内切酶消化的pGT22的多聚
接头区。所得的质粒命名为pGT23。
·利用混合的SalI和EcoRI消化质粒pGT23，并与含有醛缩酶启动子
并利用同种酶消化的PCR片断(PCR模板枯草芽孢杆菌染色体DNA，
PCR引物oALDOP5(SEQ ID NO4)和oALDOP3(SEQ ID NO5))
进行连接。所得到的构建体(质粒pGT24)是便利的小型穿梭(大肠杆
菌-枯草芽孢杆菌)载体，它提供了转录起始和终止信号及一个核糖体
结合位点其紧接位于唯一的EcoRI位点前，EcoRI位点后面接着几个其
它的唯一限制性位点(XbaI，XhoI，BamHI))。质粒pGT24的醛缩酶启
动子可以容易地与利用SalI和EcoRI限制性位点的任何其它启动子
进行交换。氯霉素抗性标记可以既在大肠杆菌又在枯草芽孢杆菌中作
筛选之用。
·质粒pGTK24是pGT24的一种衍生质粒，其中氯霉素抗性基因被卡那霉
素抗性基因代替。这是通过使用两种寡核苷酸引物oKAN5(SEQ ID
NO14)和oKAN3(SEQ ID NO15)的PCR对质粒pDG783的卡那霉素抗
性基因进行扩增、利用ScaI和BamHI消化PCR产物并与利用BclI和
SnaBI消化的pGT24进行连接来实现的。
质粒pGT24和pGTK24的构建通过附图6，7和8说明。在合成的第二部分，利用革兰氏阴性菌摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)ATCC 25829的木糖醇脱氢酶(XDH)基因的已知序列(GenBank编号，L34345)通过PCR对该基因的编码序列进行克隆。应用于此PCR的有义和反义寡核苷酸是oMXD52(SEQ ID NO16)和oMXD32(SEQ ID NO17)。将PCR扩增的XDH基因的编码序列插入到表达载体pGTK24的启动子和转录终止子之间(详细情况如附图9所示)。发现所得到的质粒pGTK24(MXD2)包含一个插在EcoRI位点中的附加99bp DNA片断。此DNA片断(具有序列GAATTCTATGTGGTTATCGAAGGCGGTATGACCAACCTGGAACGTCAGCAGATCCTGACTGAAGAGCAGTATCTGGACGCGCTGGAAGAGTTCGGTGAC)明显来自大肠杆菌染色体的rpoBC区。尽我们所知，此片断在pGTK24(MXD2)中没有功能只是一个人为造成的克隆产生物。它似乎对于木糖醇脱氢酶基因在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达没有大的影响。利用上述程序将pGTK24(MXD2)引入枯草芽孢杆菌菌株D170和GX7(实施例6)中(枯草芽孢杆菌菌株BD170作为转化GX7的中间宿主)。
使菌株BD170[pGTK24(MXD2)]以及未转化的菌株BD170在LB或含有10％葡萄糖的LB上生长过夜，制备出细胞提取物并测定XDH活性。测定XDH活性的试验条件是30℃，50mM Tris-HCI，pH7.0，0.2mM NADH和10mM D-木酮糖。记录340nm下的吸光度改变；一个活性单位定义为在试验条件下每分钟催化一摩尔底物还原的酶量(假定NADH/NAD+的差别吸收系数等于6.25×104M-1cm-1)。下列水平的XDH活性是在生长于两种介质上的BD170[pGTK24(MXD2)]菌株中测定的LB-0.5U/mg蛋白，LB-葡萄糖0.05-0.15U/mg蛋白。因此，葡萄糖显示出使醛缩酶启动子的活性减小3-10倍。在生长于两种介质的任一种上的菌株BD170中均没有检测到XDH活性。
实施例8
利用表达木糖醇脱氢酶的枯草芽孢杆菌菌株生产五碳糖和糖醇
除了变化不同发酵中的通气条件和使用较长的培养时间之外，基本上如实施例3的描述，将包含质粒的枯草芽孢杆菌菌株GX7[pGTK24(MXD2)]在包含10％葡萄糖的LB培养基中培养。通气水平的变化是定性的，是通过改变培养体积和摇动条件来达到的。“高”通气可以通过如下方式得到将装有3ml培养液的20ml试管与摇床平台成30°角固定，并在200rpm下摇动；“中度”通气可以通过在相同条件下培养10ml培养液得到；“低”通气条件与“中度”通气条件相同，只是将试管垂直固定。实验结果的总结见表3。
表3中的数据清楚显示了通过调节发酵条件和通过在细菌细胞内表达适当的多元醇脱氢酶，可以宽范围地控制由重组枯草芽孢杆菌生产的五碳糖/糖醇的性质。以表3中的结果为例，可以看到在发酵产品混合物中酮糖向糖醇的转化量从基本为零变化到约80％。表3XDH的表达和通气条件对于D-木酮糖和木糖醇在枯草芽孢杆菌菌株GX7的培养基中累积的影响(*)在低通气条件下发酵7天后，再在高通气条件下发酵3天
应当注意的是表达载体pGTK24(MXD2)在重组B subtilis细胞中提供了仅中等水平的XDH。利用比醛缩酶启动子更强的启动子将能够提高XDH的表达水平和D-核酮糖-核糖醇生物转化的效率。对此系统进一步的改进可以通过更精确地控制发酵条件(具体来说，补料分批发酵中的溶解氧的浓度，葡萄糖浓度和补料速率等来完成)。在本实施例描述的实验中葡萄糖转化成木糖醇的慢速度可以利用简单的批式发酵进行解释。可以利用其中具有较高密度的枯草芽孢杆菌培养物的补料分批式发酵(例如，对于枯草芽孢杆菌可以获得的细胞密度为大约或超过每升100g细胞干重)或者将细胞高密度地固定在固相载体上来提高此速率。
实施例9
利用枯草芽孢杆菌发酵葡萄糖生产其它五碳糖和糖醇
本发明已经建立了葡萄糖生物转化成五碳糖的一般效率和灵活性并通过实施例1-8来举例说明。相同的概念可以进一步扩展到生产和获得除了被用作本研究的模型的D-核酮糖，D-木酮糖和木糖醇之外的五碳糖。
一种这样的扩展是以核糖醇脱氢酶基因代替用于我们实验中的木糖醇脱氢酶基因。例如，将产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)(Loviny，T.，等Biochem.J.230579-585(1985))的核糖醇脱氢酶基因在菌株GX2中表达，并收集，如果需要的话分离产生的核糖醇。通过控制或调节发酵时的通气条件，如上所示，使核糖醇的生产量最大化。在本实施例中，利用以核糖醇脱氢酶基因转化的菌株指导碳流从葡萄糖流向D-核酮糖或核糖醇。利用已知的程序分离产生的核糖醇。
阿拉伯糖醇的生产可以利用重组枯草芽孢杆菌菌株发酵葡萄糖进行，此菌株是利用编码下列两种酶之任一种的基因转化得到的形成的D-木酮糖的阿拉伯糖醇脱氢酶基因例如来自土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)的[U.S.专利No.5,631,150]或者形成D-核酮糖的阿拉伯糖醇脱氢酶基因例如来自树干毕赤酵母的[(Hallborn，J.，等，Yeast11839-847(1995)，Genbank序列编号.Z46866)]。在前一种情况下，优选的用于转化的宿主是产生D-木酮糖的菌株如GX7，在后一种情况下，是产生D-核酮糖的菌株如GX2。利用已知的程序分离产生的阿拉伯糖醇。
产生核酮糖的宿主，例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC31094、GX2或GX7，还可以通过在宿主内(过)表达编码酮糖3-差向异构酶的基因进行进一步修饰(此酶也称为塔格糖差向异构酶)。如此修饰的结果是，提高了这类宿主中的木酮糖产量。来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)的适当酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列可以从GenBank编号AB000361获得。
类似地，产生核酮糖的宿主，如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 31094、GX2或GX7，也可以进一步修饰以有效生产木糖醇。在这种情况下，应当在这种宿主中共表达两种基因，一种编码木糖醇脱氢酶(例如，来自摩氏摩根氏菌的木糖醇脱氢酶，GenBank编号L34345)的基因和一种编码酮糖3-差向异构酶的基因(如前段中描述的基因)。
本发明的另一个实施方案是在产酮戊糖的枯草芽孢杆菌菌株中表达多种已知醛糖异构酶基因中的一种，并由此指导发酵朝向例如D-木糖的方向进行(在产木酮糖的菌株GX7中表达大量已知D-木糖异构酶中的任一种)。
类似地，D-来苏糖的生产，可以通过在产D-木酮糖的芽孢杆菌属(Bacillus)宿主中表达D-甘露糖异构酶基因来进行(Stevens，F.J.，等，J.Gen.Microbiol.124219-23(1981)；Allenza，P.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.24-25171-182(1990))。利用已知的程序分离D-来苏糖。
编码L-果糖异构酶的基因如大肠杆菌基因fucI(它的序列在GenBank编号U29581下)可以在D-核酮糖生产菌株GX2中表达。结果导致生产出D-阿拉伯糖—一种较为常见的L-阿拉伯糖的不寻常的立体异构体(Garcia-Junceda，E.，等，Bioorg.Med.Chem.31349-1355(1995)).
实施例10
在枯草芽孢杆菌中增加进入戊糖磷酸途径的葡萄糖碳流
并且修饰葡萄糖吸收系统
已经知道破坏枯草芽孢杆菌的糖酵解途径上部分的许多突变(Sonenshein，L.，等，编.，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其它革兰氏阳性菌，American Society for Microbiology，1993，第173页)，包括例如，葡糖磷酸异构酶、果糖磷酸激酶和果糖二磷酸醛缩酶基因中的突变。利用相应基因(pgi，fruB，fbaA(tsr)，iolJ)的已知序列和基因破坏技术，可以相对容易地在任一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株中构建这样的突变。
优选地，枯草芽孢杆菌的葡萄糖特异性PTS系统的失活通过利用随机诱变对ptsG基因进行突变，或优选地通过基于重组DNA的技术(基因破坏)来完成。获得ptsG基因的DNA序列(例如，在国际互联网网址(http//genomeweb.pasteur.fr/GenoList/SubtiList/))可以简化后一种技术的使用。
已知许多葡糖激酶和己糖激酶基因并且它们能够用于本发明。例如，枯草芽孢杆菌的同源葡糖激酶(由glck基因编码)可以利用本说明书已描述的技术进行过表达。己糖激酶的优点是可以以葡萄糖和果糖作为底物。例如，众所周知的编码己糖激酶I和II的酵母HXK1或HXK2基因，可以被利用并在PTS缺陷的宿主中表达。
具有修饰的葡萄糖吸收系统的细菌菌株的附加葡萄糖运输能力可以通过两种方法获得。首先，对基于葡萄糖的培养基上快速生长的克隆的筛选，提供了强有力的筛选方法，这种方法与适当的诱变技术结合(如化学或UV诱变)将容易地提供具有所需性能的突变体。或者，同源的(例如，由g1cT1基因编码)或来自其它生物(优选原核生物，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的glf基因Weisser，P.，等，J.Bacteriol.177(11)3351-3354(1995))的异源葡萄糖转运蛋白/促进因子(facilitator)可以在芽孢杆菌属(Bacillus)宿主中表达。
实施例11
提高PPP氧化阶段的能力
通过过表达编码PPP途径中的关键酶的同源或异源基因可以提高本发明宿主的PPP的能力，所述酶包括葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(以及任选地磷酸葡糖内酯酶)。在本发明的一个实施方案中，利用的葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因是来自只能够通过6-磷酸葡糖酸代谢葡萄糖的生物(如异型发酵乳酸菌)。这样一个基因的适宜的实例是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的zwf基因(Barnell，W.O.，等，J.Bacteriol.174(12)7227-7240(1990))。
实施例12酿酒酵母的TKL1和TKL1，2缺陷型菌株的遗传构建；木糖醇脱氢酶(XDH)
编码基因的转化以及木酮糖激酶(XK)编码基因的缺失
从Dr.I.Schaaff-Gerstenschlger获得同时具有被破坏的TKL1和TKL2编码基因的酿酒酵母菌株W303-1B(Thomas，B.J.和Rothstein，R.，Cell 56619-630(1989)。此菌株被重命名为H1055。
利用以下的常规方法构建不同的酵母菌株
将目的DNA片断从琼脂糖凝胶切离出来并放进eppendorf管中(大约200-300μl)。利用粗的无菌玻璃棒将琼脂糖凝胶压碎。加入200μl的10mMTrisHCl pH7.5，1mM EDTA-缓冲液(TE)。任选地将压碎的琼脂糖/TE放置在4℃下过夜以提高产量。加入300μl苯酚，旋转混合一分钟并立即放置到液氮中冰冻。在室温下将冰冻管离心15分钟。将水相转移到一个干净的试管中，用300μl氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，旋转混合0.5分钟，离心3分钟。将水相转移到一个干净的试管中。DNA利用1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体积的94％冷乙醇在20℃下过夜(或-70℃，30分钟)进行沉降。将沉淀物在4℃离心15-20分钟。以70％乙醇洗涤沉淀并干燥。将DNA溶解于TE或水中。或者利用QIAquick方法，按照用于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen GmbH，德国)的QIAquick Spin手册的说明来进行。
按照Bio-Rad基因脉冲仪器的说明，通过电穿孔转化大肠杆菌。所有酵母的转化通过醋酸锂方法进行(Hill，J.，等，Nucl.Acids Res.195791(1991)；Gietz，D.，等，Nucl.Acids Res.201425(1992))。构建的所有酵母菌株和质粒列于附录1和2。
常规地，所有的酵母培养既可以使用1％酵母提取物，2％蛋白胨(YP)的培养基，也可以使用包含所提及碳源(D是葡萄糖，F是果糖)的经过修改的酵母人工完全培养基(其中具有必需氨基酸和碱基)[SC；Sherman等，Methods in yeast genetics.A laboratory manual.Cold SpringHarbor Laboratory.Cold Spring Harbor，NY，USA(1983)]，在通气摇瓶中30℃，250rpm摇床上进行。酵母的极限培养基中包含6.7g/l酵母氮碱(Merck，德国)、所提及碳源、仅由于菌株的营养缺陷而被需要的氨基酸和碱基。TKL1，2缺陷型菌株不能在没有芳香族氨基酸时生长。
构建一个酵母菌株，其中只有TKL1编码基因被破坏。菌株CEN.PK2-1D[重命名为H1346，Boles，E.，等，Mol.Microbiol.2065-76(1996)]用作宿主菌株。从Jrg Hauf(Darmstadt，德国)获得包含TKL1编码基因的破坏片断的质粒并重命名为B1087。其是携带了被URA3编码基因破坏的TKL1编码基因的pUC19载体[Schaaff-Gerstenschlger，I.和Zimmermann，F.K.，Curr.Genet.24373-376(1993)]。利用SacI和BamHI消化质粒B1087，释放出该破坏片断，并从琼脂糖凝胶中将其分离出来。利用此片断转化H1346菌株，并在缺少尿嘧啶的平板上筛选转化体得到URA3阳性克隆。通过RNA印迹分析证实了基因的缺失。所得到的菌株被命名为H1764。
将编码树干毕赤酵母[Ktter，P.，等，Curr.Genet.18493-500(1990)]的木糖醇脱氢酶(XDH)的XYLZ基因克隆到pMA91表达载体的BglII位点(Mellor，J.，等，Gene 241-14(1983))，得到质粒pAOS63(附图11)。将表达盒，也就是位于PGK启动子和终止子之间的XYL2基因作为HindIII片断从pMA91载体释放出来，用Klenow酶对其进行处理，并克隆到酵母多拷贝载体pRS423的EcoRV位点(Christianson，T.W.，等，Gene110119-122(1992))得到质粒pAOS67(附图12)，或者克隆到YEp24H的PvuII位点(Aalto，M.，等，EMBO Journal 124095-4104(1993))得到质粒pAOS64(附图13)。
载体pAOS66(附图14)(其中包含来自树干毕赤酵母的受PGK1启动子调控的编码木糖还原酶(XR)的XYL1基因和受修饰的ADH1启动子调控的编码木糖醇脱氢酶(XDH)的XYL2基因)(Ruohonen，L.，等，J.Biotechnol.39193-203(1995))以BamHI进行消化，从琼脂糖凝胶中分离出包含了用于XYL2基因的表达盒的2.2kbp片断，并利用Klenow酶产生平末端。利用NcoI消化质粒B713(URA3基因是1.2kbp片断，位于细菌克隆载体Bluescript KS(+)(Stratagene，CA，USA)多克隆位点的HindIII位点中；URA3编码乳清酸核苷-5′-P脱羧酶)，用Klenow酶处理并将XYL2表达盒连接到载体中。所得的质粒B995(附图15)具有位于修饰的ADH1启动子和ADH1终止子之间的XYL2基因，该基因两末端接有用于靶向宿主菌株的URA3座位的URA3序列，利用PvuII和HindIII酶对此质粒进行消化。利用QIAquick法(Qiagen GmbH，德国)从琼脂糖凝胶中提纯HindIII片断。利用此片断转化TKL1，2缺陷型酵母菌株H1055，使转化体在YPD平板上生长过夜，然后将影印物铺在FOA(5-氟乳清酸)平板上，筛选尿嘧啶阴性转化体(Cold Spring Harbor Laboratory Press，酵母遗传学方法(Methods in yeast genetics)，1994，pp.188-189)。通过测定粗细胞抽提物(对于细胞提取物制备和XDH活性测定，参见实施例15)中的XDH活性以及Southern印迹分析来验证转化体中的整合情况。所得到的整合菌株被命名为H1506。
Trichoderma reesei的XYL2同源物来自在载体pAJ401中构建的cDNA文库(Saloheimo，A.，等，Mol.Microbiol.13219-228(1994))，在载体中cDNA位于PGK1启动子和终止子之间。从在含有几种植物多糖的培养基上进行培养的T.reesei Rut-C30分离出Poly(A)+mRNA(Stal brand，H.，等，Appl.Environ.Microbiol.611090-1097(1995))。利用ZAP-cDNA合成试剂盒(stratagene，CA，USA)合成cDNA，并连接到质粒pAJ401中(Margolles-Clark，E.，等，Appl.Environ.Microbiol.623840-3846(1996))。以大约120μg cDNA库DNA转化酿酒酵母菌株H475，此菌株在多拷贝质粒pMA91上携带来自树干毕赤酵母编码木糖还原酶(XR)的XYL1基因[Hallborn，J.，等，Bio/Technology 91090-1095(1991)]。获得含有3.7×105独立克隆的酵母cDNA库。如果细胞中同时存在XR和XDH编码基因，则在含有20g/l葡萄糖的SC-leu-ura培养基上收集酵母库，并在含有20g/l木糖的SC-leu-ura平板上铺平板(5×105个细胞/平板)，以筛查在纯的木糖平板上的生长能力。从生长在木糖平板上的九个克隆菌落中分离出cDNA库质粒，利用四个克隆对H475再次进行转化，再次验证在纯木糖上生长的能力。对六个克隆的5′末端测序，其中四个克隆显示出与编码树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶的XYL2基因同源。
利用BamHI和HindIII从载体中释放出在pAJ401中位于PGK启动子和终止子之间的T.Reesei的XYL2同源物的表达盒(大约2.5kbp片断)，并使用QIAquick方法从琼脂糖凝胶上回收该片段。将此片断连接到YEplac 195相应的位点，得到质粒B1070，它被转化到宿主H1052中，得到酵母菌株H1748。为了构建整合盒，将此片断与利用HindIII和BamHI消化的质粒B955连接。质粒B955(Toikkanen，J.和Kern en，S.，待发表(1999))是携带两个片断的URA3基因的Bluescript SK(-)载体；来自该基因编码区的第71-450位和第781-1135位碱基对分别位于多聚接头区域的SacI-XbaI位点和XhoI-Asp718位点。该克隆载体中剩余的多接头位点HindIII和BamHI被用于在两个URA3片断之间通过粘性末端连接头位点HindIII和BamHI被用于在两个URA3片断之间通过粘性末端连接引入XYL2表达盒。所得的质粒B1068(附图16)是6.2kbp。通过SacI-Asp718消化从Bluescript SK(-)中释放出此表达盒(5′URA3 71-450bp-XYL2表达盒5′-3′-URA3 781-11353′)，并从琼脂糖凝胶分离出来。1μg的片断用于转化TKL1，2缺陷型菌株H1055。转化体的筛选和验证如上文所描述，并将其命名为H1741。
开放阅读框(ORF)YLR070c与树干毕赤酵母的XYL2基因具有高同源性，并且已被证明编码具有木糖醇脱氢酶活性的酶[Richard，P.，等，FEBSLetters 457135-138(1999)]。通过PCR从酵母W303-1B(重命名为H1104)的基因组DNA，利用寡核苷酸对oSCXYL21(SBQ ID NO20)和oSCXYL22(SEQ ID NO21)对ORF YLR070c进行扩增。得到的PCR产物以BamHI进行消化，从琼脂糖凝胶中纯化并连接到pMA91表达载体的PGK启动子和终止子之间的BglII位点中。用得到的克隆B1163转化酵母菌株H1104，得到菌株H1886。
利用寡核苷酸对oSCXKS11(SEQ ID NO22)和oSCXKS12(SEQ ID NO23)，通过PCR从酵母菌株H1104的全DNA中扩增木酮糖激酶(XK)的编码基因(XKS1，ORF YGR194c)。以EcoRV消化PCR产物并从琼脂糖凝胶中纯化出来。将XK编码片断连接进克隆载体pRSETC(Invitrogen，TheNetherlands)的PvuII位点，得到质粒B1025。缺失盒的构建方式是首先将XKS1的1kbp EaeI片断从B1025转移到pZErOTM-1载体(Invitrogen)的相容位点NotI，然后ScaI消化从XKS1序列中间去除一个500bp的片断。将利用ScaI进行过缺失的XKS1片断作为NsiI片断从这个载体上转移到Bluescript SK(-)的PstI位点。来自pFA6-kanMX2质粒[Wach，A.，等，Yeast 101793-1808(1994)]的kanMX2片断作为一个PvuII-SpeI片断从该载体中释放出，并且通过平末端连接将该片段克隆到XKS1序列的BstEII位点，得到质粒B1154(附图17)。通过PCR利用寡核苷酸对oSCXKS13(SEQ ID NO24)和oSCXKS14(SEQ ID NO25)对B1154的破坏盒进行扩增。用片断转化TKL1，2缺陷型菌株(H1506)，此菌株具有整合在基因组中的树干毕赤酵母的XDH编码基因。在含有200mg/l抗生素G418的YPD平板上筛核酮糖激酶缺陷型转化体。通过PCR和Sonthern印迹验证此破坏。所获菌株命名为H1854。
实施例13
在酿酒酵母的转酮酶缺陷型菌株中的五碳糖磷酸的累积
在TKL1，2缺陷型菌株(H1055)和宿主菌株(H1104)中测定糖磷酸。细胞在SCD培养基上生长分别达到1.4(H1055)和4.0(H1104)的光密度(OD)600，收集细胞，用水洗涤一次并悬浮于PBS缓冲液(磷酸缓冲盐，150mM NaCl，pH6.7)中，得到的密度为0.2g湿重/ml。加入葡萄糖使其终浓度为20g/l，20分钟后在冷甲醇中将细胞迅速破碎并利用甲醇/氯仿程序进行抽提(de Koning，W.，和van Dam，K.，Anal.Biochem.204118-123(1992))。
利用酶学分析量化5-碳糖磷酸。主要按照Bergmeyer[Methods inenzymatic analysis，Vol.3(1974)Verlag Chemie，Academic Press]描述的方法测定木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸。木酮糖-5-磷酸的测定在0.1M TEA(三乙醇胺)缓冲液中进行，该缓冲液pH7.2并含有0.15mM核糖-5P、0.22mM NADH、25U甘油醛-3-磷酸异构酶(TPI)、0.85U甘油-3P脱氢酶(G3PDH)。以终浓度为1.2U/ml的转酮酶(TKL)(Sigma，USA)起始反应。监测340nm下吸光度的减少。所有酶，除了转酮酶都从Boehringer Mannheim(德国)购买。核酮糖-5P的测定如用于测定木酮糖-5P的所述方法，不同的是此反应以木酮糖-5P差向异构酶(Sigma USA)进行起始，此酶能够将核酮糖-5-磷酸转化成木酮糖-5-磷酸。木酮糖-5P差向异构酶的终浓度是2U/ml。除了加入木酮糖-5P(sigma)以代替使用过量的核糖-5P外，核糖-5P的测定如木酮糖-5P的测定。根据Gancedo和Serrano[Gancedo，C.和Serrano，R.，TheYeasts，vol 3，端Rose A.H.和Harrison J.S.，pp 205-260，AcademicPress Ltd.，London，(1989)]方法计算糖磷酸的细胞内浓度。结果如表4所示。表4.在TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104中的5-碳糖磷酸的累积
在这个具体实验中，与宿主菌株相比，TKL缺陷型菌株中的木酮糖-5P(X5P)水平高25倍，核酮糖-5P(Ru5P)和核糖-5P(Ri5P)浓度高2-3倍。实验表明与宿主酵母菌株相比，五碳糖磷酸在TKL缺陷型菌株中累积到达较高水平。
实施例14
通过酿酒酵母的
转酮酶缺陷型菌株生产多元醇和戊糖
将宿主菌株H1104和TKL1，2缺陷型菌株H1055在酵母极限培养基上进行培养。预培养物在SCD培养基进行生长，达到OD600为3-5，离心收集细胞并以水洗涤一次，然后将细胞重新悬浮使得OD600为0.1，以用于在酵母极限培养基上的培养实验。培养过程中在指示的时间点抽取样品，测定OD600值，离心去除细胞并利用Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇比色法分析生长培养基样品中的多元醇。结果如表5显示。应用于此分析试剂盒的山梨糖醇脱氢酶(SDH)能够氧化D-山梨糖醇和木糖醇，并且以较慢的速率(例如，不是定量地)氧化其它多元醇如核糖醇，艾杜糖醇和阿洛糖醇。OD600 1.0相当于0.3g/l的细胞干重。表5.TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104生产的多元醇
1)多元醇的测定利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒进行
2)抽取生长培养基样品的时间点以小时计算可以观察到TKL1，2缺陷型菌株H1055的多元醇的产量比宿主菌株H1104提高了15-20倍。
还通过HPLC对29h，53h和101h时间的生长培养基样品进行分析。分析之前，通过冻干将样品浓缩5倍。使用具有CarboPac PA-10柱的DIONEXDX-500装置(30℃，流速1 ml/min；洗脱液A＝水，B＝100mM NaOH，C＝300mM醋酸钠/100mM NaOH，D＝300mM NaOH；梯度洗脱如下100％A在21h，100％B在40h，50％B+50％C在60h，100％C在60.10h，100％C在64h，100％D在64.10h，100％D在67h，100％A在67.10h，100％A在82h)。在所用的分析条件下，对核酮糖和木酮糖进行共洗脱。结果如表6所示。表6.TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104产生的羟基化合物(木糖醇和核糖醇)和5-碳糖。1)抽取生长培养基样品的时间点以小时计算；2)木糖醇+核糖醇g/g细胞干重；3)核糖g/g细胞干重；4)核酮糖+木酮糖g/g细胞干重
HPLC结果显示，在TKL1，2缺陷型菌株中多元醇的产量比宿主菌株中的提高了40倍。另外，5-碳糖的产量也明显增加，对核糖和核酮糖+木酮糖来说分别增加了175和40倍。含量小于1-2％的多元醇有阿拉伯糖醇，甘露醇或山梨糖醇(后者的测定在另一实验中进行，数据没有显示)，表明由TKL1，2缺陷型菌株生产的多元醇是核糖醇和木糖醇。
实施例15利用含有木糖醇脱氢酶(XDH)编码基因的酿酒酵母转酮酶缺陷型菌株生产多元醇和戊糖，其中所述基因或来自树干毕赤酵母并既可以位于多拷贝的质粒上也可以整合在基因组中，或来自属Trichoderma Reesei并整合在基
因组中。a)利用酿酒酵母的TKL1缺陷型菌株进行多元醇的生产，其中此菌株含有位于多拷贝质粒上来自树干毕赤酵母的XDH编码基因
转酮酶活性缺陷的酵母菌株是芳香族氨基酸的营养缺陷型，因为芳香族氨基酸的合成前体赤藓糖-4-磷酸在TKL1，2缺陷型菌株中不能合成。如果部分葡萄糖也能够支持细胞的维持，则可能是有益的。在只有转酮酶的主要异构型TKL1被破坏的菌株中这是可能的。
利用含有树干毕赤酵母的XDH编码基因的多拷贝载体(pAOS67；附图12)转化TKL1缺陷型菌株H1764及其相应的宿主菌株H1346(参见附录I，表32)，分别得到菌株H1765和H1766。将得到的菌株在缺少组氨酸的SCD培养基上培养以进行质粒筛选。在指示的时间点取样，离心细胞并利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒分析生长培养基中的多元醇。结果显示见表7。表7由载有具树干毕赤酵母的XDH编码基因的多拷贝载体pAOS67的TKL1缺陷型菌株H1765和宿主菌株H1766产生的多元醇(木糖醇+核糖醇)。1)生长培养基的取样时间点以小时计算
在整个70h的培养期中，观察到TKL1缺陷型菌株与野生型相比生产的多元醇(g多元醇/g细胞干重)提高到2倍。本实验表明多元醇产量的提高可利用只缺陷一种转酮酶异构型TKL1的酵母菌株获得。b)利用酿酒酵母的TKL1，2缺陷型菌株进行多元醇和戊糖的生产，其中此菌株含有位于多拷贝质粒上的树干毕赤酵母的XDH编码基因
利用含有树干毕赤酵母的XDH编码基因的多拷贝载体(pAOS67；附图12)转化宿主菌株H1104和TKL1，2缺陷型菌株H1055，分别得到菌株H1160和H1057(附录I，表32)。所得的菌株在酵母极限培养基上进行培养。在用于筛选质粒的缺少组氨酸的SCD培养基上培养预培养物，使OD600达到3-5，离心收集细胞并以水洗涤一次，然后将细胞重新悬浮使得OD600为0.1，以用于在酵母极限培养基上的培养实验。培养过程中在指示的时间点抽取样品，离心去除细胞并利用Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒和HPLC(见实施例14)分析生长培养基样品中的多元醇。结果如表8显示。表8.由TKL1，2缺陷型菌株H1055和宿主菌株H1104，以及载有具树干毕赤酵母XDH编码基因的多拷贝载体pAOS67的分别相应的菌株H1057和H1160产生的多元醇(木糖醇+核糖醇)1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行2)利用Boehringer Mannheim山梨糖醇/木糖醇试剂盒测定多元醇核糖醇+木糖醇(g/g细胞干重)3)利用HPLC(DIONEX DX 500，CarboPack PA-10)测定木糖醇和核糖醇(g/g细胞干重)
如在实施例14中的讨论，可以观察到TKL1，2缺陷型菌株H1055与宿主菌株H1104相比多元醇的产量提高了15-40倍。当树干毕赤酵母的XDH编码基因在TKL1，2缺陷型菌株中的多拷贝质粒上进行表达时，该产物产量又增加大约5倍。本实验中，多元醇组分由木糖醇和核糖醇构成，主要是核糖醇，仅有约10到15％的多元醇是核糖醇。
利用HPLC(参见实施例14)，也分析了生长培养基样品中5-碳糖。结果如表9所示。表9.由载有携带具树干毕赤酵母XDH编码基因的多拷贝载体pAOS67的TKL1，2缺陷型菌株和宿主菌株，分别为H1057和H1160产生的多元醇(木糖醇+核糖醇)和5-碳糖。1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行2)木糖醇+核糖醇g/g细胞干重(结果来自表8)3)核糖g/g细胞干重4)核酮糖+木酮糖g/g细胞干重5)TKL1，2缺陷型菌株与宿主菌株比较，产量增加(x-倍)
TKL1，2缺陷型菌株中多元醇(核糖醇+木糖醇)、核糖和核酮糖+木酮糖的增加比例分别是40，175，和40倍(参见实施例14)，而在XDH编码基因存在时分别增加220，130和75倍，证明这些比率向着多元醇和木酮糖+核酮糖移动。
同单纯TKL1，2缺陷型菌株相比，多拷贝载体上的树干毕赤酵母的XDH编码基因的过表达，使得多元醇和5-碳糖的比率发生明显改变。5-碳糖的量从减少1.4倍到2倍，而多元醇增加4倍(参加表10)。表10.TKL1，2缺陷型菌株H1055和载有具树干毕赤酵母XDH编码基因的多拷贝载体pAOS67的该菌株H1057中多元醇(木糖醇+核糖醇)和5-碳糖的比率。1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行2)木糖醇和核糖醇占产生的总多元醇和5-碳糖的％比率3)核糖占产生的总多元醇和5-碳糖的％比率4)木酮糖和核酮糖占产生的总多元醇和5-碳糖的％比率c)通过表达编码具有不同底物特异性的XDH酶的基因，改变TKL1，2缺陷型菌株产生的多元醇的比率。
对树干毕赤酵母，Trichoderma reesei和酿酒酵母的木糖醇脱氢酶对于糖底物的特异性进行了研究。使每一个XDH编码基因分别在多拷贝载体pAOS67、B1070和B1163上表达(参见实施例12)。将包含其中一种多拷贝载体的酵母菌株H1104(pAOS67，B1163)和H1052(B1070)，以及H1160、H1886和H1748分别在缺少适当选择性标记(分别是组氨酸，亮氨酸，尿嘧啶)的SCD培养基上培养。离心收集细胞并以100mM磷酸钠盐缓冲液pH7.0洗涤两次。在同种缓冲液中重新悬浮细胞使浓度为500mg/ml湿重，大约相当于75mg/ml干重。4℃利用1g玻璃珠(0.5mm )对1ml此悬浮液进行15分钟涡旋，在Eppendorf离心管中离心(13,000rpm)然后检测上清液。在含有50mM Pipes KOH pH7.0，0.2mM NADH的介质中检测XDH活性。通过加入D-木酮糖或D-核酮糖至终浓度为1mM，起始反应。由340nm下的NADH吸收值来测定活性。结果如表11所示。表11.三种真菌XDH酶对于浓度1mM的D-木酮糖和D-核酮糖的比活性。以D-木酮糖活性为100％对活性进行标化。
本实施例表明与树干毕赤酵母的XDH酶相比，T.Reesei和酿酒酵母的XDH酶对于D-木酮糖具有更高的特异性。
如在实施例12中的描述，将来自树干毕赤酵母和T.reesei的同源XDH编码基因整合到TKL1，2缺陷型菌株H1055的基因组中，分别得到H1506和H1741。在SCD培养基中培养细胞并在指定的时间点取样。对细胞进行离心并且分析生长培养基样品中的多元醇(木糖醇和核糖醇)。利用Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒分析总的多元醇，通过加入0.07U/ml纯化的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)核糖醇脱氢酶(RDH)定量测定核糖醇的量(Bergmeyer H.U.，“酶学分析方法”，Verlag Chemie Vol 3′，Academic Press(1974)，pp.1356-1358)单独利用RDH测定核糖醇，木酮糖的量通过从总多元醇的量中减去核糖醇的量获得。核糖醇的检测条件如下包含450mM TrisHCl pH8.7、5mM NAD和0.07U/ml核糖醇脱氢酶的200μl试剂中，加入样品并且补加水使总体积为250μl。将此溶液在37℃下孵育20分钟。将加入样品之前和孵育之后的吸光度差值与在完全相同条件下测定的标准曲线，包括零对照进行比较。所有的分析都在Cobas Mira Plus自动分析仪(Roche)上进行。结果如表12所示。表12.由含有整合在基因组上的树干毕赤酵母(H1506)或T.reesei(H1741)的XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株H1055产生的木糖醇和核糖醇(g/g细胞干重)。1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行2)木糖醇(Xol)或核糖醇(Rol)g/g细胞干重3)木糖醇/核糖醇的比率
本实验公开了如何能够通过选择适当的多元醇脱氢酶控制多元醇产物的谱系，以及如何能够通过体外测定表征多元醇脱氢酶。通过过表达适当脱氢酶的基因，可以按照需要的方向操纵Xol/Rol的比率。d)利用XK编码基因失活的TKL1，2缺陷型菌株生产多元醇
将木酮糖激酶(XK)编码基因从含有染色体整合的树干毕赤酵母XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株H1506中破坏掉，得到菌株H1854，参见实施例12所述。
细胞在SCD培养基上生长2天。将预培养物以1∶50稀释转移到新鲜培养基中并继续再生长20h。离心收集细胞，水洗涤细胞一次，重新将细胞悬浮于1ml水中。通过加入细胞达到0.2的OD600，开始在SCD培养基上的培养。培养100h之后，收集样品，测OD600，通过离心去除细胞，并且通过Boehringer Mannheim的D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒利用RDH并通过特异性的核糖醇实验(参见前面的实施例)分析生长培养基样品中的木糖醇和核糖醇。结果如表13所示。表13.由具有整合在基因组中的树干毕赤酵母XDH编码基因(H1506)和此外还具有失活的XK编码基因(H1854)的TKL1，2缺陷型菌株产生的木糖醇和核糖醇(g/g细胞干重)
1)木糖醇或核糖醇g/g细胞干重
2)木糖醇/核糖醇比率
同H1506菌株相比较，XK缺陷型菌株H1854产生较多量的木糖醇和较少量的核酮糖。木糖醇的比例从18％增加到40％。本实验中，核糖醇和木糖醇的总量没有显著变化，但是比率偏向木糖醇。本实验表明XK编码基因的破坏改变了多元醇的比率。
实施例16
酿酒酵母的DOG1编码基因以及酿酒酵母和
Zygosaccharomyces Rouxii的LTP1同源基因的克隆
从Dr.SanZ获得位于YEplac 181载体(YEp11HP，[SanZ，P.等，Yeast10195-1202(1994)]重命名为B1016)上的2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DOG1)编码基因DOG1。利用寡核苷酸对oDOG11(SEQ ID NO26)和oDOG12(SEQ ID NO27)通过PCR对B1016质粒的DOG1基因进行扩增。以HindIII消化PCR片断并从琼脂糖凝胶中纯化出来。将此片断连接到Bluescribe M13(B609附录I，表33)中的位于被修饰的ADH1启动子和ADH1终止子之间的HindIII位点。所得到的克隆以BamH1和PvuII消化，从琼脂糖凝胶中抽提出包含ADH1启动子-DOG1-ADH1终止子的BamHI-片断，并将它克隆到YEplac 195多拷贝载体(Gietz和Sugino，Gene74527-534(1988))的BamHI位点得到质粒B1020。用质粒B1020转化TKL1，2缺陷型菌株(H1506)，此菌株含有整合在基因组中的树干毕赤酵母的XDH编码基因，得到菌株H1520。对照菌株包含不具有DOG1的同样载体(YEplac 195)，命名为H1524。将质粒B1020也转化到宿主菌株H1104中，得到菌株H1514。
为了构建Zygosaccharomyces rouxii的基因组文库，利用标准方法将Z.rouxii的染色体DNA分离出来，以Sau3A进行部分消化，将消化物中大于2kb的DNA片断通过制备型琼脂糖凝胶电泳分离出来。将从K.Sasnauskas(Institute of Biotechnology，Vilnius，Lithuania)获得的大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pL3(Ianushka，A.P.，Genetika.24(5)773-80(1988))以BamHI进行消化，利用牛小肠磷酸酶处理并且与Z.rouxii染色体DNA的Sau3A片断连接。连接混合物用于转化大肠杆菌菌株HB101(Stratagene，La Jolla USA)。得到约20,000个转化体，其中估计有60-70％的克隆插入了Z.rouxii DNA。将转化体集中成库，并通过标准方法从几个这样的库中分离质粒DNA。利用它在酿酒酵母的实验菌株中对几个标准营养缺陷型突变(HIS3，URA3，ADE1)的补充能力检测文库的质量。
将Z.rouxii基因组文库转化到酿酒酵母的TKL1缺陷型菌株(H1764，参见实施例12)中，得到10,000独立的克隆。我们已经观察到TKL1缺陷型菌株H1764不能在含有0.3％或更高浓度D-木酮糖的2％半乳糖平板上生长(可能是由于累积的5-碳糖磷酸的毒性浓度)。将独立克隆铺在具有0.5％D-木酮糖的平板上(合成的完全培养基，包含2％半乳糖、0.5％木酮糖和3％木糖并缺少亮氨酸，用于筛选文库质粒)并在这些平板上就互补生长对这些克隆进行筛选。
对Z.rouxii基因组文库的筛选得到六个阳性克隆，它们能够在上述平板上生长7天。从酵母菌落中拯救出文库质粒并利用限制性酶消化和测序对其进行分析。根据限制性酶图谱和序列数据，六个质粒包含两个不同的Z.rouxi基因组片断。两个基因组片断中都含有与酿酒酵母的TKL1编码基因具有高同源性的ORF。两个ORF被命名为Z.Rouxii的TKL1和TKL2。
基因组克隆的序列分析提示(两个TKL基因的下游280bp)另一个长度为483bp的ORF，其编码一条160个氨基酸残基的多肽。这两个ORF的同一性是94％(一个来自一个基因组克隆；分别命名为PPPase 1(SEQ IDNO38)(它来自Z.rouxii的TKL1下游)和PPPase2(SEQ ID NO40)(它来自Z.rouxii的TKL2下游))。利用由Z.rouxii的PPPase 1(SEQ IDNO39)和PPPase2(SEQ ID NO41)编码的氨基酸序列为模板，进行Blast检索(Altschul，S.F等，http//www.ncbi，nlm，nih.goviblast/(1997))，得到几个来自其它物种(包括酵母)的同源物(表14)。所有这些同源氨基酸序列的特征是1)由这些同源基因编码的蛋白质属于蛋白质-酪氨酸磷酸酶(EC 3.1.3.48)和/或酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)蛋白质家族，2)由此基因编码的蛋白质的大小约为17-20kDa，以及3)由此基因编码的蛋白质与低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶具有共同的活性位点基序CXXXXXR(C＝半胱氨酸，X＝任何氨基酸，R＝精氨酸)，位于该蛋白质的氨基末端。表14.其它酵母中Z.Rouxii的PPPase1和PPPase2的最同源对应物1)与Z.rouxii PPPase 1的同一性。2)与Z.rouxii PPPase 2的同一性。
为了构建具有酿酒酵母的LTP(低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶)编码基因的过表达质粒，以HindIII消化表达载体pMA91，并从琼脂糖凝胶中分离出包含PGK1启动子和终止子的1.8kb片断。将启动子-终止子盒连接到YEplac195载体中(此载体已在它的多克隆位点处被HindIII进行了线性化)，得到质粒B1181。表达载体中的启动子-终止子片断的方向是HindIII-PGK1启动子-PGK1终止子EcoRI。利用寡核苷酸对oScLTP5(SEQID NO28)和oScLTP3(SEQ ID NO29)为引物通过PCR从H475(附录I，表32)的基因组DNA中扩增酿酒酵母(YPR073C)的LTP1编码基因。PCR反应是30个循环，95℃下45sec，45℃下45sec和72℃下2min，并72℃下最终延伸10min。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，德国)对PCR产物进行纯化，然后以BglII进行消化(在PCR合成中引入该片段的位点)，并将其连接到B1181的BglII位点，得到质粒B1449(附图18)。将这个质粒转化到酿酒酵母的TKL1，2缺陷型菌株(H1741)中，该菌株具有整合到基因组中的来自T.reesei的XDH编码基因(参见实施例12)。含有B1449质粒的酵母转化体被命名为H2422。为获得一个对照菌株，将过表达质粒B1181转化到H1741中，所得的菌株命名为H2421。
利用表达载体B1181构建具有Z.rouxi的PPPase2编码基因的过表达质粒。PCR片断是利用包含PPPase2基因的Z.rouxi基因组片断为模板，寡核苷酸对oZrPPPase5(SEQ ID NO30)和oZrPPPase3(SEQ ID NO31)为引物制备的。PCR反应后(30个循环，95℃下45sec，45℃下45sec，72℃下2min，72℃下最终延伸10min)，利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，德国)对PCR产物进行纯化，然后以BamHI进行消化(在PCR合成中引入该片段的位点)，并将其连接到B1181的BglII位点，得到质粒B1450。将这个质粒转化到酿酒酵母的TKL1，2缺陷型菌(H1741)中，该菌株含有整合到基因组中的来自T.reesei的XDH编码基因(参见实施例12)。含有B1450质粒的酵母转化株被命名为H2424。
实施例17
过表达编码磷酸酶DOG1和LTP1的基因提高
酿酒酵母菌株中戊糖和戊糖醇的产量a)在过表达编码磷酸酶的DOG1基因的TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的产量增加
将编码2-脱氧葡萄糖-6-磷酸酶的酿酒酵母的DOG1基因在具有整合到基因组中的树干毕赤酵母的XDH编码基因TKL1，2缺陷型菌株(H1506，表32)中进行过表达。将包含了DOG1编码基因的多拷贝载体(B1020，参见实施例16)转化到上面提到的菌株和宿主菌株H1104中，分别得到菌株H1520和H1514。另外，将空载体YEplac 195转化到该菌株中得到对照菌株H1524。也将B1020转化到H1741中，H1741是具有整合到基因组中的T.reese s的XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株，得到菌株H2425。
利用20mM的底物浓度测定DOG1对木酮糖-5-P，核酮糖-5-P，核糖-5-P和2-脱氧葡萄糖-6-P的特异性。除使用50mM咪唑-HCl，10mM MgCl2缓冲液，pH6.0外，按照实施例15的描述制备酵母细胞提取物。将10μl提取物和210μl底物(20mM)在同种缓冲液中30℃孵育30分钟。利用终浓度2％的TCA终止反应，并以钼酸铵(15mM)，醋酸锌(100mM)，pH5.0为试剂，测定释放出来的磷酸盐。在350nm下测定形成的钼蓝，并利用磷酸盐标准对其进行定量(Sanz，P.等，Yeast 101195-1202(1994)；Bencini，D.A.等，Anal.Biochem.132254-258(1983))。结果如表15所示。表15.含有位于多拷贝质粒(H1514)上的DOG1编码基因的宿主菌株的酵母细胞提取物中DOG1的特异性，显示的活性是以2-脱氧葡萄糖-6-P为100％的相对活性值。1)本实验应用的底物浓度。2)未测定3)Randez-Gil，F.等，Yeast 111233-1240(1995)
预培养物在用于质粒筛选的缺少尿嘧啶的SCD培养基上生长，收集细胞，水洗一次，并重悬浮于同种生长培养基中使OD600约为0.2。细胞的培养是在250rpm的摇床上，30℃下进行。在培养期间，在指定的时间点取样，测定OD600，并通过离心去除细胞。利用HPLC分析生长培养基样品中的多元醇和戊糖。HPLC分析的进行利用了配有折光率探测器(Waters 410差示折光计)的Waters 510 HPLC泵，Waters 712 WISP和Water SystemInterfase Module液相色谱仪。所用Shodex-Pb柱(Shodex SP0810，ShowaDenko K.K.，Tokyo，日本；80℃，流速0.6ml/min，水作为洗脱液)导致核糖和木糖醇的共洗脱，另外对木糖醇进行定量。结果如表16所示。表16.由包含整合的树干毕赤酵母XDH编码基因和位于多拷贝质粒上的DOG1编码基因的酿酒酵母TKL1，2缺陷型菌株产生的多元醇和戊糖(g/g细胞干重)。1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行。2)核糖醇+核糖+木糖醇g/g细胞干重3)核糖醇或(核糖+木糖醇)g/g细胞干重
多元醇和戊糖的产量与在培养过程中消耗的葡萄糖相关。结果如表17所示。表17.消耗单位葡萄糖(g/l)产生的多元醇和戊糖(核糖醇，木糖醇，核糖；g/l)。而且显示单位细胞干重消耗的葡萄糖。1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行。2)消耗单位葡萄糖(g/l)产生的多元醇和戊糖(核糖醇，木糖醇，核糖；g/l)，以％表示。3)每细胞干重(g/l)消耗的葡萄糖(g/l)4)同对照菌株H1524相比较增加的％
利用TKL1，2缺陷型菌株(含有整合到基因组中的T.Reesei的XDH编码基因和多拷贝质粒携带的DOG1编码基因H2425)还研究了多元醇和戊糖的产生(对于培养条件和分析方法的详细描述；HPLC和酶实验参见下一段有关酿酒酵母的LTP1编码基因的实施例)。结果如表18所示。表18.含有整合的T.reesei XDH编码基因和过表达多拷贝质粒上的DOG1编码基因的TKL1，2缺陷型菌株产生的戊糖醇和戊糖
1)利用酶检测测定核糖醇，木酮糖，核酮糖或核糖醇+木酮糖+核酮糖的总量(g/g细胞干重)
2)利用HPLC测定总的核糖醇，核糖和核酮糖(g/g细胞干重)
本实施例表明从多拷贝质粒表达的DOG1磷酸酶使TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的产量增加1.5-4倍(参见表16)。表18中的结果表明木酮糖和核酮糖的产量也增加2-3倍。葡萄糖向产物的转化显著增强(参见表17)，也就是从葡萄糖出发所得产物的产量增加，证明进入PPP的碳流增加。b)在过表达编码磷酸酶的LTP1基因的TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的产量的增加。
利用载有低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶(LTP1，参见实施例16)的多拷贝质粒转化含有整合到基因组中的T.reese的XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株(H1741)，得到菌株H2422，并以缺少LTP1编码基因的对照质粒进行转化，得到菌株H2421(参见实施例16)。菌株是在缺少尿嘧啶的SCD培养基上从单菌落培养的。在30℃培养42小时后，离心去除细胞，收集培养基上清液。通过HPLC(参见下文)或者通过使用COBAS Mira自动分析仪(Roche)的酶检验分析上清液中的戊糖和戊糖醇。
核糖醇和木糖醇的测定按照实施例15部分“C”中的描述进行。在37℃孵育20分钟过程中取样，对样品中的核酮糖的测定是通过分析反应中核糖醇脱氢酶(0.07U/ml)引起的NADH减少来进行的，所述反应中含有100mM KH2PO4，pH7.0和0.2mM NADH。测定木酮糖和核酮糖的合并量的方法同测定核酮糖的量的方法相似，只不过在此反应中还使用了山梨糖醇脱氢酶(0.2U/ml)。从木酮糖和核酮糖的合并量中减去核酮糖的量就获得木酮糖的量。根据以前描述的实验方案(Bergmeyer，1974)，从肺炎克雷伯氏菌(E-87293，VTT菌株保藏)纯化出应用于酶检测的核糖醇脱氢酶。
HPLC分析的进行利用了配有折光率探测器(Waters 410差示折光计)的Waters 510 HPLC泵，Waters 712 WISP和Water System Interfase Module液相色谱仪。在55℃下以水中的5mM H2SO4对所用的Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad)进行平衡，并用水中的5m H2SO4以0.3ml/min流速洗脱样品。利用Sigma化学品公司的干燥晶体糖制备标准溶液。结果如表19-21所示。表19利用酶检测法测定的由过表达LPT1编码基因的菌株产生的核糖醇，木糖醇，核酮糖以及木酮糖(g/g细胞干重)。1)n.d.-可信检测限以下表20.利用酶检测法测定的由过表达LTP1编码基因的菌株产生的不同戊糖醇和戊糖的比率(％)。1)n.d.-可信检测限以下表21.利用HPLC测定的由过表达LPT1编码基因的菌株产生的核糖醇，核酮糖，木酮糖以及核糖(g/g细胞干重)。1)n.d.-可信检测限以下
表19-21的结果显示过表达LTP1编码基因的菌株(H2422)比LTP1编码基因不过表达的菌株(H1741和H2421)产生更多的木酮糖(分别2.5倍和2.5倍)和核酮糖(分别2.2倍和2.7倍)。H2422也产生木糖醇(14mg/g细胞干重)，这一点与H1741和H2421不同，在本具体实验中它们不产生木糖醇。本实验中，与H1741和H2421菌株相比，菌株H2422产生的戊糖和戊糖醇(核糖醇，木糖醇，木酮糖和核酮糖)总量提高了80-100％。
在H2422菌株中，不同戊糖和戊糖醇的比率也发生变化(表20)与H1741(44％)和H2421(32％)菌株相比，它产生更多的核酮糖(54％)。所观察到的“木酮糖+木糖醇”的情况是相同的H2422产生的“木酮糖+木糖醇”占戊糖和戊糖醇总量的20％，而H1741和H2421只分别产生了戊糖和戊糖醇总量10％和9％的“木酮糖+木糖醇”。与其它的戊糖和戊糖醇不同，H2422产生的核糖醇(26％)的量比H1741(46％)和H2421(59％)菌株所产生的量减少。
对培养42h时消耗的葡萄糖进行了测定并证实流λPPP途径的葡萄糖增加。对照菌株H2421将1.0％消耗的葡萄糖转化成戊糖醇和戊糖，但是在LTP1编码基因过表达的菌株(H2422)中，转变了1.7％消耗的葡萄糖，证明提高了70％。
本实施例表明在含有整合的T.Reesei的XDH编码基因的酿酒酵母TKL1，2缺陷型菌株中，过表达LTP1编码基因提高了戊糖醇和戊糖的产量，倍数为1.6-1.8。而且，戊糖醇和戊糖的比率发生变化而有利于木酮糖(木糖醇)和核酮糖的产生。由于进入PPP途径的碳流增加，葡萄糖向产物的转变增强了70％。
实施例18
酿酒酵母菌株和菌株构建体用于研究减少的糖酵解活性
从Dr.Eckard Boles(Düsseldorf，德国)获得酿酒酵母的两个不同菌株，它们中的葡糖磷酸异构酶编码基因(PGI1)被破坏，将它们重命名为H1053[EBY22，Boles，E.，等，Eur.J.Biochem.217469-477(1993)]和H1054[EBY44，Boles，E.，等，Mol.Gen.Genet.243363-368(1994)]。
为了构建具有较低活性的葡糖磷酸异构酶的酿酒酵母菌株，从Dr.Eckard Boles[Rose，M.，等，Eur.J.Biochem.199511-518(1991)]获得用于产生部分PGIl启动子缺失的质粒。利用部分启动子缺失的已经被HpaI线性化的质粒pBR4和pBR5，转化PGIl缺陷型菌株H1054。筛选亮氨酸原养型。所得的菌株分别命名为H1768和H1770。
从Dr.Susanne Müller(Darmstadt，德国)获得编码6-磷酸果糖-L-激酶(PFK26和PFK27)的基因出现缺陷的菌株，并重命名为H1347。利用包含树干毕赤酵母的XDH编码基因的酵母多拷贝载体pAOS64(参见实施例12)转化此菌株并将所得的菌株命名为H1759。
将菌株H1055(TKL1，2缺陷型菌株)和H1053(PGI1缺陷型菌株)混合为一批用于在YPF平板上接合。两天以后检测此批中的接合子。在YPF和SCD-tyr-phe平板上对这批培养中的单菌落进行划线接种。将来自每一类型平板的24个大的菌落分别转移至平板上划线接种。利用对照菌株H5和H6进行接合实验，证实所有48个菌落都是双倍体(附录I，表32)。再将4个菌落转移到极限培养基平板上进行单克隆划线接种[YNB(酵母氮源基质6.7g/l；Merck，德国)+2％葡萄糖]。将四个平板上的一个单克隆作为一批，在孢子形成前平板(5％葡萄糖)上划线接种培养两天。再将此批培养物转移到孢子形成平板(减少了C-和N-源)上以便在饥饿条件下刺激孢子形成。9天后检测平板上四分体的形成。挑选出具有40-50％四分体的两批克隆用于随机的孢子分离。蜗牛酶gluculase以1比10用水进行稀释，将来自孢子形成平板的相当于一半火柴头大小的酵母悬浮物与200 l酶稀释溶液混合。将混合物在摇床上温育2小时。加入1ml水并剧烈涡旋混合物。将稀释液-3，-4和-5在YPF上铺平板培养3天。挑出440个菌落在SC+2％果糖+0.05％葡萄糖的平板上划线接种培养2天。将接种的划线在YPD(PGI1缺陷型突变株不生长)和SC+2％果糖+0.05％葡萄糖-tyr-phe(TKL1，2缺陷型突变株不生长)的平板上进行复制。
获得4个阳性候选菌落(在YPD和SC+2％果糖+0.1％葡萄糖-tyr-phe上都不生长)。通过DNA印迹检测候选菌落是否保持了PGI1和TKL1，2的破坏。以BglII(TKL1)，ClaI(TKL2)或BglI(PGI1)消化染色体DNA，所用的探针来自PGI1基因(+100到+1640核苷酸)，TKL1基因(+115到+1060)和TKL2基因(+810到+1870)。利用PCR制备探针，以毛地黄毒苷标记的dNTP混合物(Boehringer Mannheim，德国)对其标记，利用QIAquick柱进行纯化。同亲本菌种比较印迹表明图式没有变化。在4个菌落中，挑选编号I的菌落用于进一步的实验并命名为H1451。
为了将树干毕赤酵母的XDH编码基因引入上文提到的菌种H1451，将质粒pAOS67利用SalI酶消化，用Klenow酶处理，然后再利用虾碱性磷酸酶处理。利用SalI和SpeI从pFA6-kanMX2质粒[Wach，A.，等，Yeast101793-1808(1994)]中释放出kanMX2片断，通过凝胶电泳进行纯化并通过酚-液氮法从凝胶中将片断抽提出来。以Klenow酶处理纯化的片断以产生平末端。将kanMX2片断克隆到pAOS67 SalI位点。具有遗传霉素(genenticin)抗性基因的质粒pAOS67被命名为B1003(附图19)，并将其引入TKL1，2；PGI1缺陷型菌株H1451中得到菌株H1453。
实施例19
在缺少PGI1和/或TKL1，2活性的酿酒酵母菌株中
葡萄糖向戊糖醇的转变增强
将包含树干毕赤酵母XDH编码基因和卡那霉素抗性标记基因(pAOS67+kanr，附图19)的多拷贝质粒B1003转化到TKL1，2；PGI1缺陷型菌株H1451中得到菌株H1453(附录I，表32)。所得的菌株和各种对照菌株在含有2％果糖和0.15％葡萄糖的人工完全培养基上生长。在培养过程中的指定时间点取样，测定OD600以监测菌株的生长，离心去除细胞，利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒检测生长培养基样品中的多元醇(木糖醇和部分核糖醇；参见实施例14)，并利用BoehringerMannheim GOD-Perid试剂盒检测样品中的葡萄糖。结果如表22所示。表22.由含有位于多拷贝质粒上的树干毕赤酵母XDH编码基因的TKL，PGI1缺陷型菌株产生的多元醇。1)产生的多元醇以mg/g细胞干重计算2)产生的多元醇以mg/g消耗的葡萄糖计算3)未测定4)转化成多元醇的葡萄糖所占的分数以％表示
以上结果显示含有XDH编码基因的TKL1，2；PGl1缺陷型菌株中，每g葡萄糖产生约0.2g多元醇，这比含有XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株的葡萄糖向多元醇的转化高3-6倍。这个具体的菌株生长缓慢，所以它产生多元醇的速率也慢。本实施例表明糖酵解(PGI1缺陷)和戊糖磷酸途径(TKL1，2缺陷)同时受阻断使得酿酒酵母中葡萄糖向多元醇的转化增强。
实施例20
在酿酒酵母中糖酵解的部分阻断使碳流(葡萄糖)转向
戊糖磷酸途径a)减少葡糖磷酸异构酶的活性引起多元醇产量的增加
从Dr.Eckard Boles(Düsseldorf，德国)获得了一系列质粒，它们包含葡糖磷酸异构酶(PGI1)编码基因的全长编码区和不同长度的这个基因的启动子。利用这些质粒转化PGI1缺陷型酵母菌株所产生的转化株具有不同的PGI1活性[Rose，M.，等，Eur.J.Biochern.199511-518(1991)]。利用由Rose等构建的PGI1-启动子缺失。在着丝粒质粒上具有连续的启动子缺失的八个不同质粒，以PstI和DraI进行消化。将载有PGI1基因和不同大小的启动子的片断，亚克隆到整合型质粒YIplac128(Gietz和Sugino，Gene 74527-534(1988))中。利用HpaI对得到的质粒pRB1到pRB8进行线性化，将分别它们转化到菌株H1054并测定葡糖磷酸异构酶的比活性。(E.Boles，个人交流)。假定具有全部PGI1活性的10％能够维持在葡萄糖上的生长，挑选出给出8％(pRB4)和5％(pRB5)PGI1活性的两个质粒，用于构建PGI1活性减少的酵母菌株。将质粒pRB4和pRB5引入PGI1缺陷型菌株H1054，分别得到菌株H1768和H1770(附录I，表32)。利用含有树干毕赤酵母XDH编码基因的多拷贝质粒pAOS67(附图12)对这两个菌株进行转化，分别得到菌株H1772和H1774。这些菌株在含有2％果糖和0.05％葡萄糖的培养基上生长，作为对照含有多拷贝质粒pAOS67的完全PGI1缺陷型菌株(H1117)也包括在培养的菌株之中。在指定的时间点取样，通过测定OD600监测生长情况。离心去除细胞并通过D-山梨糖醇/木糖醇Boehringer Mannheim试剂盒分析生长培养基样品中的多元醇(木糖醇和部分核糖醇；参见实施例14)。结果如表23所示。表23.由含有位于多拷贝质粒上的树干毕赤酵母XDH编码基因的、PGI1活性减少的酿酒酵母产生的多元醇。
1)利用Boehringer Manneheim D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒测定木糖醇+部分核糖醇(mg/g细
胞干重)
2)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行
本实施例表明PGI1活性减少的酵母菌株同完全缺失PGI1活性的菌株相比较，多元醇的产量增加约2倍。b)利用缺失6-磷酸果糖-2激酶活性的酿酒酵母生产多元醇
已知证明果糖-2，6-二磷酸(F2，6P)是6-果糖磷酸激酶的一种有效的激活剂，同时是果糖-1，6-二磷酸-1磷酸水解酶的强抑制剂，因此它是糖酵解途径的重要调节因子。在酿酒酵母中F2，6P由两种6-磷酸果糖-2-激酶编码基因PFK26和PFK2合成。具体来说，F2，6P对于快速消耗糖是必需的[Boles，E.，等，Mol.Microbiology 2065-76(1996)]。我们的兴趣是研究如果缺失这两个基因是否会由于糖酵解中的碳流减少引起的进入PPP的葡萄糖增加而造成多元醇的产量增加。
利用一个多拷贝载体转化PFK26，PFK27缺陷型菌株，此载体含有位于多拷贝载体(pAOS64)上的树干毕赤酵母XDH编码基因。将细胞在具有20g/l葡萄糖的人工完全培养基上进行培养，并且省去了尿嘧啶用于质粒筛选。通过测定OD600监测细胞的生长，利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒分析培养基样品中的产生的多元醇。结果如表24所示。表24.由含有位于多拷贝质粒上的树干毕赤酵母XDH编码基因的PFK26，PFK27缺陷型菌株产生的多元醇(部分核糖醇+木糖醇)(mg/g细胞干重)
1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行。
本实施例表明多元醇能够在PFK26，27缺陷型菌株中产生，并且过表达树干毕赤酵母的XDH编码基因能够提高多元醇的产量2-3倍。c)减少甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性引起多元醇的产量和流向戊糖磷酸途径的碳流增加
已知增加醋酸碘(IA)的量能够逐渐抑制甘油醛-3-磷酸脱氢酶，因此导致流入糖酵解途径下部分的葡萄糖减少。在25M IA(Fluka Chemie AG，Switzerland)存在时培养携带多拷贝质粒PAOS67的TKL1，2缺陷型菌株H1055(H1057)，其中所述携带的多拷贝质粒pAOS67含有树干毕赤酵母的XDH编码基因。生长培养基是用于质粒筛选的不含组氨酸的SCD和7.65g/lKNO3。在指定的时间点取样，测定OD600，离心去除细胞，利用BoehringerMannheim D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒检测生长培养基样品中的多元醇，并利用Boehringer Mannheim GOD-Perid试剂盒检测样品中的葡萄糖。结果如表25所示。表25.在醋酸碘存在的条件下由含有位于多拷贝质粒上的树干毕赤酵母的XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株产生的多元醇在醋酸碘存在时，可以观察到多元醇的产量增加了大约30％，使得1.2％消耗的葡萄糖代谢为多元醇(木糖醇+部分核糖醇)。本实施例表明由醋酸碘引起的甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的减少，导致戊糖醇产量和流向戊糖磷酸途径的葡萄糖增加。
实施例21
构建具有改变的氧化还原平衡的酿酒酵母菌株
编码NAD依赖性谷氨酸脱氢酶的基因作为一个SstI-XbaI片断，从质粒YEpMSP3-T[Boles，E.，等，Eur.J.Biochem.217469-477(1993)]被克隆到YEplac195多拷贝质粒上[Gietz，R.D.和Sugino，A.，Gene74527-534(1988)]，得到质粒B1007。将质粒B1007分别转化到含有树干毕赤酵母和T.reesei XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株(分别为H1506和H1741)中，分别得到菌株H1499和H1743。
采用另一种方法(参见实施例18)构建PGI1；TKL1，2缺陷型菌株(它含有整合在基因组中的T.reesei的XDH编码基因)，以便获得有用的选择标记用于在质粒上表达其它基因。通过将酿酒酵母的HIS3基因整合进PGI1编码基因来破坏此基因。利用寡核苷酸对oPGI11(SEQ ID NO32)和oPGI12(SEQ ID NO33)，通过PCR对PGI1基因进行扩增，并克隆到Blaesuipt SK(-)载体的SalI-PstI位点，得到质粒B1186。HIS3基因作为一个DrdI片断从载体pRS423被克隆到Bluescript SK(-)的EcoRV位点，得到质粒B1185。利用EcoRI和BstBI对含有PGI1的载体B1186进行消化，这样从PGI1开放阅读框去除一个700bp片断，并利用来自HIS3-Bluescript SK(-)载体B1185的作为EcoRI-ClaI片断的HIS3基因替代这个片断，得到质粒B1187(附图20)。利用SalI-MunI消化从B1187中释放出PGI1-HIS3-PGI1片断，从琼脂糖凝胶中提纯，并将它转化到含有整合在基因组中的T.reesei XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株(H1741)中。转化体中的正确整合通过PCR，Southern印迹，具有在不含组氨酸的培养基上的生长能力和不能在葡萄糖上生长的能力进行证实。获得的菌株被命名为H1857。将上述包含GDH2编码基因的质粒(B1007)转化到H1857菌株中，得到菌株H1915。为了获得对照菌株，将载体YEplac195转化到菌株H1857中，得到菌株H1916。
将包含受PGK1启动子调控的树干毕赤酵母的XR编码基因和受修饰的ADH1启动子调控的树干毕赤酵母的XDH编码基因的酵母表达载体pAOS66(附图14)，转化到PGI1缺陷型菌株H1053中，得到菌株H1115。
为了破坏胞质NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因(IDP2)[Loftus，T.M.，等，Biochemistry 339661-9667(1994)；Sazanov，L.A.和Jackson，J.B.，FEBS Letters 344109-116(1994)]，利用PCR构建一个破坏盒；菌株H1346的基因组DNA作为模板DNA。寡核苷酸对是oIDP21(SEQ ID NO34)和oIDP22(SEQ ID NO35)被用于5′末端，寡核苷酸对oIDP23(SEQID NO36)和oIDP24(SEQ ID NO37)被用于3′末端。扩增的5′末端片段长为415bp。以SalI和HindIII消化5′末端片断，以HindIII和PstI消化3′末端片断(注意，3′末端片断包含一个非特异性HindIII星号活性位点，所得到3′片断只有158bp) 以及利用SalI和PstI消化pBluescript SK(-)载体。在一步反应中将这三种组分连接在一起，得到质粒约为3.8kbp(B1009)。通过HindIII消化，将URA3基因以一个1170bp片断从质粒B713[Toikkanen，J.，等，Yeast 12425-438(1996)]中释放出来，从琼脂糖凝胶中纯化，并连接到质粒B1009的HindIII位点，得到质粒1011(附图21)。通过SalI和NotI消化，从质粒B1011中释放出IDP2破坏的片断。将这个片断转化到PGI1缺陷型菌株H1053中得到菌株H1576.
实施例22
在具有改变的细胞氧化还原平衡的酿酒酵母菌株中
增加由葡萄糖产生的戊糖醇和戊糖的产量a)在过表达NAD依赖性谷氨酸脱氢酶编码基因的酿酒酵母TKL1，2缺陷型菌株中多元醇的产量增加
将NAD依赖性谷氨酸脱氢酶编码基因在含有整合到基因组中的树干毕赤酵母或T.reesei的XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株中进行过表达。将含有GDH2编码基因(参见实施例21)的质粒B1007转化到酵母菌株H1506和H1741中，分别得到菌株H1499和H1743(附录I，表32)。在含有20g/l葡萄糖的人工完全培养基(不含尿嘧啶，适当条件下用于质粒筛选)上培养这些菌株。在指定的时间点取样，测定OD600，离心去除细胞，利用Boehringer Mannheim D-山梨糖醇/木糖醇试剂盒并向该检测实验中加入核糖醇脱氢酶检测生长培养基样品中的多元醇。结果如表26所示。表26.由包含整合的树干毕赤酵母(P.s)或T.reesei(T.r)的XDH编码基因以及位于多拷贝质粒上的GDH2编码基因的TKL1，2缺陷型菌株产生的多元醇(核糖醇+木糖醇)(g/g干重)。
1)生长培养基的取样在以小时计算的时间点进行
2)未测定
本实施例表明GDH2编码基因的过表达使在含有XDH编码基因的酿酒酵母TKL1，2缺陷型菌株中产生的多元醇(核糖醇+木糖醇)的量提高50-80％。b)在过表达NAD依赖性谷氨酸脱氢酶编码基因的酿酒酵母PGI1；TKL1，2缺陷型菌株中多元醇的产量增加
NAD依赖性谷氨酸脱氢酶(GDH2)编码基因在H1857中进行过表达，H1857是葡糖磷酸异构酶(PGI1)和转酮酶(TKL1，2)缺陷型菌株，它还包含整合到基因组中的T.Reesei的XDH编码基因。利用携带GDH2编码基因的质粒B1007(参见实施例21)以及利用空质粒YEplac195转化H1857，分别得到菌株H1915和H1916。
对菌株H1915和H1916进行培养使其进入对数生长期。收集细胞并悬浮于不含组氨酸和尿嘧啶的人工完全培养基中，使平均密度为20的OD600的。加入葡萄糖使其终浓度为20g/l并立即取样。细胞在30℃的摇床(250rpm)上培养2.5h，然后取第一个样品。再加入H2O2使其浓度约为0.5mM，再继续进行培养1.5h，此时取第二个样品。测定OD600，离心去除细胞，利用HPLC分析生长培养基样品(Waters device，Aminex HPX-87H离子排阻柱，参见实施例17)。结果如表27所示。表27.由含有整合的T.reesei XDH编码基因和位于多拷贝质粒上的GDH2编码基因的PGI1；TKL1，2缺陷型菌株产生的多元醇和戊糖。
1)多元醇+戊糖mg/g细胞干重
可以看到在过表达GDH2编码基因的菌株H1915中，PPP衍生的化合物(木酮糖/核酮糖/核糖/核糖醇)的产量增加2倍。两种菌株中加入过氧化氢对多元醇和戊糖的总产量具有积极的作用；可以看到在具有和不具有GDH2编码基因过表达的TKL1，2；PGI1缺陷型菌株中，都增加2倍。令人感兴趣的是，H2O2特异性地使得只有过表达GDH2编码基因的菌株能够产生木酮糖。
在实验过程中，测定菌株消耗的葡萄糖，从消耗的葡萄糖产生的多元醇和戊糖的比率如表28所示。表28.消耗单位葡萄糖(g/l)产生的多元醇和戊糖(核糖醇，核酮糖，木酮糖；g/l)
1)与对照菌株H1916比较增加的产量的％。
本实施例说明在酿酒酵母中氧化还原酶的过表达或者氧化还原平衡的改变引起流向戊糖磷酸途径的碳流增强，这样导致PGI1；TKL1，2缺陷型菌株中戊糖醇和戊糖的产量进一步增加。还说明从葡萄糖获得的产物量增加，证明了进入PPP的葡萄糖增加。c)在缺少NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶活性的酿酒酵母菌株中进入戊糖磷酸途径的葡萄糖增加
胞质NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶(IDP2)催化异柠檬酸氧化脱羧得到酮戊二酸，并伴随着NADP的还原。这样此反应与利用NADP的戊糖磷酸途径氧化阶段的酶(也位于细胞的胞质中)竞争同种辅因子NADP。因此，破坏编码IDP2的基因可以提高进入PPP的葡萄糖，因为在此受损菌株中对胞质中NADPH产生的需求可以仅由该途径的酶来提供。
PGI1缺陷型菌株的生长在高于0.2％葡萄糖的培养基中受到抑制。在突变菌株中过表达GDH2编码基因，能够使其恢复在接近宿主菌株所用的高水平的葡萄糖上生长的能力。为了检验我们的假设，我们将IDP2编码基因从PGI1缺陷型菌株H1053(参见实施例21和表32)中破坏掉，并且研究其在含有2％果糖的不同浓度的葡萄糖上的生长情况。结果如附图22所示。
同PGI1缺陷型菌株相比，PGI1，IDP2缺陷型菌株能够在0.25％葡萄糖中生长到较高的细胞密度。另外，延长培养时间之后，可以看到PGI1，IDP2缺陷型菌株能够在0.5％和1.0％葡萄糖浓度中生长，而这两种浓度对PGI1缺陷型菌株具有毒性。这些结果支持了这一假设，即当缺失IDP2编码基因后，流入PPP的葡萄糖增加。d)在过表达NAD(P)H依赖性木糖还原酶的酿酒酵母菌株中进入戊糖磷酸途径的葡萄糖增加
PGI1缺陷型菌株H1053(参见附录1，表32)利用包含树干毕赤酵母的木糖还原酶(XR)和XDH编码基因的多拷贝质粒pAOS66(附图14)进行转化，得到菌株H1115。
细胞的培养在不含亮氨酸，并补充20g/l果糖和0.5g/l葡萄糖的人工完全培养基中进行。洗涤细胞并重新悬浮于100mM磷酸缓冲液pH5.0中，使OD600为130。加入总糖浓度为20g/l的D-葡萄糖和D-木糖混合物，利用商业化的酶试剂盒(Boehringer Mannheim)测定乙醇产量。结果如表29-30所示。表29.加入糖之后不同时间的乙醇浓度(mM)，其中2％的糖中包含不同比率的D-木糖和D-葡萄糖。在顶栏中给出葡萄糖的量。表30.根据D-葡萄糖D-木糖比率为0.2的最大速率标化的乙醇产生速率。
与单独使用纯糖相比，使用两种糖的混合物时，乙醇生产速率较高。当只有葡萄糖或只有木糖存在时乙醇产量低。这可能是由于辅酶因子的损耗所致。D-葡萄糖通过戊糖磷酸途径进行代谢时，利用NADP；D-木糖转化成木糖醇时，利用NADPH。NADP或NADPH的损耗限制了进入戊糖磷酸途径的碳流，即限制了乙醇生产速率。只有当两种糖同时代谢时，才能有效地再生这些辅因子；一个葡萄糖将两个NADP转化成两个NADPH，后者然后被用于从D-木糖形成木糖醇。乙醇的生产速率反映出经过戊糖磷酸途径的碳流，因为这是唯一可能的路线。当葡萄糖和木糖的混合物同时进行发酵时，能够有效再生辅因子，可以观察到最高的乙醇生产速率。当葡萄糖分数是1/3，即木糖对葡萄糖的比率是2时，乙醇生产速率最高。这一点反映了该辅因子再生的化学计量，即需要2当量的木糖再生出用于1当量葡萄糖的辅因子。
本实施例证明经过戊糖磷酸途径的葡萄糖发酵受到NADP再生系统如需要NADPH的木糖还原酶反应的刺激。
根据对辅因子的需求，仅过表达XR编码基因的菌株能够产生相似的效果，增强葡萄糖转化成PPP衍生产物。
类似地，在TKL1，2缺陷型菌株或即使在非缺陷型菌株中，也能够增强葡萄糖向多元醇和戊糖的转变。因为在此途径中木酮糖-5-磷酸不能被进一步转化，所以包含如上所述的用于PGI1缺陷型菌株的异源XR和XDH编码基因的TKL1，2缺陷型菌株仍旧不能利用木糖为碳源。在宿主菌株中，木糖通过木糖还原酶被还原为木糖醇，该酶同时氧化NAD(P)H。木糖醇进一步被氧化形成木酮糖并且木酮糖被磷酸化得到木酮糖-5P，一种戊糖磷酸途径的中间物。
然而，木糖醇向木酮糖的转变在热动力学上是不利的，通常情况在木糖培养物中木糖醇出现累积。XR编码基因的表达引起对NADPH的需求增加，NADPH主要在戊糖磷酸途径中产生。我们的假设是当菌株是TKL1，2缺陷型菌株时，碳的唯一出口是作为酮或多元醇；这引起在过表达XR编码基因的TKL1，2缺陷型菌株中多元醇和戊糖的产量增加。
以上描述的实施例还可以导致从木糖和葡萄糖同时生产出木糖醇。
实施例23
筛选增加多元醇和戊糖的产量的酿酒酵母突变株
将TKL1，2缺陷型菌株H1055和H1741(后者含有整合到基因组中的T.reesei的XDH编码基因)(附录I，表32)，在YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)上培养过夜。收获细胞(离心3000rpm，5min)并悬浮在0.1M磷酸钠盐缓冲液(pH7.0)中，密度为2×108细胞/ml。诱变的细胞总量是20ml中4.7×109个。将500μl的细胞取出来作为对照。将600μl的诱变剂(甲基磺酸乙酯(EMS)，Sigma)加入到细胞悬浮液中。在对照细胞中不加入诱变剂。细胞在30℃下搅拌(250rpm)孵育60min。然后收获细胞，用20ml水洗一次，用5％硫代硫酸钠(每次20ml)洗两次，并重新悬浮于1ml的水中。将经过诱变的细胞在包含2％半乳糖、0.1％木酮糖、0.6％木糖、酵母提取物和蛋白胨的平板上铺平板(每种菌株铺9个平板)。将对照和诱变细胞的稀释溶液(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)在YPD平板上铺平板用于生存力的检验。诱变后的生存力约为60％。培养6天之后，菌株H1055和H1741分别在平板上生长了20和13个菌落。再培养8天之后，在平板上生长的菌落分别增加了40和21个。将菌落在含有3ml SCD培养基的试管中，30℃，250rpm培养4天。测定培养物的OD600，离心去除细胞并利用HPLC(HPX-87H柱，BioRad，分析条件55℃，流速0.3ml/min，洗脱液5mM H2SO4)分析培养物的上清液中产生的戊糖醇和戊糖。结果如表31所示。表31.菌株H1055和H1741以及木酮糖抗性突变菌产生的多元醇和戊糖(g/g细胞干重)。
1)总量；核酮糖，核糖醇，核糖和木酮糖g/g细胞干重。
2)同亲本菌株H1055和H1741相比较，核酮糖，核糖醇，核糖产量增加的％比率。
3)同亲本菌株H1055和H1741相比较，核酮糖，核糖醇，核糖和木酮糖产量增加的％比率。
所获得的一些突变株明显地产生更多的戊糖醇或戊糖。在本具体实验中，没有检测到亲本菌株产生了木酮糖，但是几个突变株除了产生增加量的核酮糖，核糖或核糖醇之外，也生产出木酮糖。在某些突变株中，比率从木酮糖，核糖和核糖醇向木酮糖移动。本实施例表明经典的诱变具有获得能够从葡萄糖产生增加的戊糖醇和戊糖的酿酒酵母菌株的潜力。
实施例24
利用表达木糖醇磷酸脱氢酶或核糖醇磷酸脱氢酶的重组微生物菌株
生产木糖醇或核糖醇
从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Hausman，S.Z.和London，J.，J.Bacteriol.1691651-1655(1987))中纯化出木糖醇5-磷酸脱氢酶和核糖醇磷酸脱氢酶。已知相似的酶也存在于某些其它的微生物中，如鸟链球菌(London，J.，FEMS Microbiol.Reviews 87103-112(1990))。可以通过本领域已知的方法分离出编码这些酶的基因。这些基因在累积木酮糖5-磷酸和/或核酮糖5-磷酸的本发明宿主(如枯草芽孢杆菌菌株GX7或酿酒酵母H1055)中进行表达时，细胞内产生相应的戊糖醇5-磷酸。累积的木糖醇5-磷酸或核糖醇5-磷酸最终被去磷酸化(例如，利用木糖醇-5-磷酸酶)并从细胞中分泌出来。木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸之间的快速平衡可以通过核酮糖5-磷酸差向异构酶的过表达相对容易地获得。利用戊糖醇5-磷酸脱氢酶催化的反应的平衡取决于宿主细胞中氧化还原的能力(NADH/NAD+比率)。在适当条件下(高NADH/NAD+比)(已知存在于例如酵母细胞中)，平衡非常有力地向有利于戊糖醇磷酸的方向移动。因此，对代谢流进行较好地全面控制是可能的，意思是说最终生产的一种产物(木糖醇或核糖醇)中只有最少量的副产物形成。
实施例25
克隆鼠李糖乳杆菌的木糖醇磷酸脱氢酶(XPDH)基因
主要利用Hausman和London(J.Bacteriol.169(4)1651-1655(1987))的方法从鼠李糖乳杆菌ATCC 15820中纯化出XPDH。
对同源蛋白进行N-末端序列分析得到如下序列MKASMLEDLNKFSVKEIDIPSPKKD[SEQ ID NO42]。还从XPDH胰蛋白酶的消化物中分离出几个肽并进行测序。测定出的序列如下EWTNSIQLVR[SEQ IDNO43]，FGGFEQYVSVPAR[SEQ ID NO44]，GLDEGCTHVINSAK[SEQ ID NO45]。
根据XPDH的部分氨基酸序列合成几种简并寡核苷酸，并利用鼠李糖乳杆菌染色体DNA为模板在PCR中对其进行检测。利用组合的两种引物oLRXPD 53(ATGAARGCITCIATGTTIGARGATTT[SEQ ID NO46]，有义引物)和oLRXPD 31(GCRTTIACIAR-YTGIATIGARTTNGTCCAYTC[SEQ ID NO47，反义引物]获得最大的PCR产物(表观大小约为850bp)。利用32P对此PCR产物进行放射性标记并作为探针筛选鼠李糖乳杆菌染色体DNA文库。
利用基于噬菌体的载体(ZAP ExpressTM，Stratagene)构建此文库。更具体地，用经过预消化(BamHI/CIAP-处理)的ZAP ExpressTM载体试剂盒从鼠李糖乳杆菌染色体DNA的Sau3A部分消化物克隆约2-5kb的DNA片断组分。文库的大小超过105个原始重组体。根据厂商的建议进行文库的构建，贮藏和筛选(除了文库在-70℃，20％的甘油中冰冻冷藏)。
将上述的能够与PCR产物进行强杂交的几个噬菌斑分离出，纯化并利用Stratagene提供的方法将它们转变为噬菌粒。在分离的噬菌粒内XPDH基因编码区的位置利用PCR进行测定，其中PCR是以噬菌粒克隆为模板，oLRXPD 53(在编码区的5′末端退火)为有义引物并且使用在噬菌粒的载体部分退火的两个通用引物之一。根据这些实验筛选出一个克隆(pBK-CMV(LRXPDH)-21)，它含有完全的XPDH基因编码序列(假定这种酶属于中等链长脱氢酶家族并具有大约350个氨基酸残基的一条多肽链)。制备出此克隆的限制性图谱。经鉴定KpnI位点位于所估计的XPDH编码区的下游大约200bp。根据此信息，构建质粒pBK-CMV(LRXPDH)-21的一个较小的衍生物，它仍包含XPDH基因的全长序列。对pBK-CMV(LRXPDH)-21进行KpnI水解产生两个DNA片断(约6和0.9kb)，较大的片断利用琼脂糖凝胶电泳进行纯化并自身进行连接。将所得的质粒命名为pBK(LRXPDH)并进行DNA序列分析。
插入质粒pBK(LRXPDH)中的DNA序列(SEQ ID NO48)包含一个349个密码子的开放阅读框，以较不常用的起始密码子TTG起始。推导出的N-末端氨基酸序列与实验测定的XPDH的N-末端氨基酸序列精确地匹配。推导出的鼠李糖乳杆菌XPDH的一级序列(SEQ ID NO49)与许多中等链长的脱氢酶的序列同源。尤其是，可以观察到与在B.halodurans和艰难梭菌的基因组序列测定工程中鉴定的几种推测的脱氢酶的序列(SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53)有高度的同源性。虽然这些脱氢酶的序列是已知的，但是具有这些序列的酶的底物特异性在以前或是被错误地确定，或者还未确定。例如，来自B.halodurans的酶(SEQ ID NO8)一直被注释为山梨糖醇脱氢酶(GenBank PIDg10172799)。
实施例26
构建表达载体pGTK74(LRXPDH)和pGTK24(BHDH)
表达载体pGTK74(LRXPDH)和pGTK74(BHDH)从pGTK24分两步进行构建。
第一步，存在于pGTK24中的枯草芽孢杆菌醛缩酶启动子被来自同种生物的经过修饰的degQ启动子取代。同野生型degQ启动子相比，其中一种修饰是引入已知的degQ36突变[Msadek T，等，J.Bacteriol.1732366-2377(1991)]。通过以枯草芽孢杆菌的染色体DNA为模板和两个寡核苷酸ODEGQ 5(SEQ ID NO54，GGAGTCGAC-CATGGGAGCACCTCGCAAAAAAGG)和DEGQ 3(SEQ ID NO55，GGAGAATTCACCTCCTTTCAGAGTCCCGGGTATTTGATCTGTTACTAATAGTGTATCGTCTTTCGG)为引物的PCR对修饰的degQ启动子进行扩增。以限制性内切酶SalI和EcoRI消化此PCR产物，并与用同种酶消化的pGTK24的大片断连接。所得的质粒构建体命名为pGTK74(附图23)。
第二步，通过以鼠李糖乳杆菌的染色体DNA为模板和两个寡核苷酸oLRXPD 501(SEQ ID NO56，GGTGAATTCATGAAAGCATCAATGTTGGAAA)和oLRXPD 301(SEQ ID NO57，GGTTCTAGACCATTATAAAATGCCTCCAATTTCACC)为引物的PCR对鼠李糖乳杆菌XPDH基因的编码区进行扩增。此反应产生的DNA片断以EcoRI和XbaI消化并与以EcoRI和XbaI消化的pGTK74连接。所得的枯草芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭载体pGTK74(LRXPDH)的构建示图和结构通过附图24A进行说明。
类似地，表达载体pGTK74(BHDH2)的构建是在两个寡核苷酸引物oBHDH2 51(SEQ ID NO58，GGTCAATTGATGA-AAGCCCTTAATTTATACGGCATT CAAGAC)和oBHDH2 31(SEQ ID NO59，GCATCTAGAGTATAGTTGATCATCCTCGTGTTCGG)的协助下，通过扩增与鼠李糖乳杆菌XPDH同源的B.halodurans基因的编码区进行的。所得的DNA片断以MfeI和XbaI消化并连接到以EcoRI和XbaI水解的pGTK74上，产生表达载体pGTK74(BHDH2)(附图24B)。
实施例27
鼠李糖乳杆菌和B.Halodurans的木糖醇磷酸脱氢酶基因的表达
利用pGTK74(LRXPDH)和pGTK74(BHDH2)转化枯草芽孢杆菌菌株BD170。转化体在含有25mg/l卡那霉素的LB培养基上生长过夜，通过超声制备细胞提取物并测定XPDH的活性。除了以木酮糖5-磷酸代替木酮糖作为底物(通常浓度为5mM)不同外，测定XPDH活性的条件与用于测定木糖醇脱氢酶活性的条件相似。鼠李糖乳杆菌的XPDH的活性约为0.3U/mg蛋白质，B.halodurans的酶约为0.5U/mg蛋白质。
通过以下程序证实B.halodurans XPDH对木酮糖磷酸的还原具有立体专一性。D-木酮糖5-磷酸和NADH之间的反应在37℃进行几个小时，条件如下100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0，10mM木酮糖5-磷酸，10mMNADH，5μl酶裂解液。以碱性磷酸酶对反应产物进行去磷酸化，并利用HPLC进行分析。反应混合物中只发现木糖醇和木酮糖(相应于未反应的木酮糖5-磷酸)而没有阿拉伯糖醇，证明B.halodurans的“木酮糖5-磷酸还原酶”(SEQ ID NO50)实质上就是木糖醇磷酸脱氢酶。应当注意的是在鼠李糖乳杆菌XPDH的最高得分的四种同源物中，B.holodurans的酶是同源性最少的。这一点可以说明其它三种同源物(SEQ ID NO51，52和53)极可能也是木糖醇磷酸脱氢酶。
实施例28
利用表达XPDH的重组枯草芽孢杆菌菌株生产木糖醇
枯草芽孢杆菌菌株GX7以pGTK74(LRXPDH)进行转化，并将转化体置于含有20％葡萄糖的LB培养基的试管中，“中等通气”的条件(如实施8的定义)下培养10天。此时，通过HPLC分析培养液的等分试样，发现其中含有大约35g/l的木糖醇。在同样条件下进行培养的对照菌株(未转化的GX7)的培养基中没有检测到木糖醇。
实施例29
枯草芽孢杆菌glcUgdh操纵子的过表达
利用两个寡核苷酸引物oGDH52(SE ID NO60，GGTGAATTCATGGATTTTTATGGCTCTTCTCCC)和oGDH3(SEQ ID NO61，GGTAGATCTAGACATTACAGGATGGTGCTGTC)通过PCR对枯草芽孢杆菌的完全glcUgdh操纵子进行扩增。在PCR中获得的DNA片断以EcoRI和XbaI消化，既可以连接到以EcoRI和XbaI消化的pGTK24上也可以连接到以相同的酶对消化的pGTK74上。实验结果获得两个表达载体pGTK24(GDOP)和pGTK74(GDOP)(分别通过附图25A和25B说明)。将两个质粒用于转化枯草芽孢杆菌菌株BD170。
枯草芽孢杆菌BD170[pGTK24(GDOP)]和BD170[pGTK74(GDOP)]菌株在7℃ LB(25mg/l卡那霉素)中过夜培养。收获培养物并按照如上所述制备细胞提取物。葡萄糖脱氢酶活性通过利用葡萄糖为底物30℃ 340nm下NAD+的还原速率来测定。反应条件是50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM NAD+，2mM MgCl2，10mM葡萄糖。发现两种类型的转化体含有相似水平的葡萄糖脱氢酶活性(大约1.5-2U/mg蛋白质)。在没作转化的BD170中没有检测到酶活性(已知野生型枯草芽孢杆菌中葡萄糖脱氢酶只有在芽孢形成期间进行表达)。
将枯草芽孢杆菌BD170[pGTK24(GDOP)]在37℃高通气的条件下在LB(25mg/l卡那霉素)中过夜培养。离心收获15ml的培养液并用冰冻的反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH6,5；150mM NaCl)洗细胞。将细胞重新悬浮于800μl的反应缓冲液中。37℃下利用14C-葡萄糖(在不同的未标记葡萄糖浓度存在的条件下)检验糖的吸收。在t＝0时加入14C-葡萄糖，每分钟取一个等分试样(100μl)。将等分试样加在硝化纤维素滤膜(0.2m)上，并利用3ml冰冻的反应缓冲液洗涤。干燥滤膜并利用闪烁计数器对放射活性进行定量。在所有检测的条件下，发现以pGTK24(GDOP)转化的枯草芽孢杆菌具有高得多的葡萄糖吸收。例如，在含有1％葡萄糖的溶液中，转化菌株的吸收速率比未转化的野生型菌株大约高四倍(附图26)。
这些结果表明当从植物启动子表达glcUgdh操纵子时，它在枯草芽孢杆菌中仍具有功能，而且实际上这个操纵子可以用于增强葡萄糖流入戊糖磷酸途径。
实施例30
鸟肠球菌的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的纯化和部分序列分析
将鸟肠球菌ATCC 35655在30℃ 5升的培养基中进行培养，培养基中包含蛋白胨-10g/l，酵母提取物-5g/l，牛肉膏10g/l，K2HPO42g/l，NaCl-5g/l，MgSO4-0.02g/l，MnCl2-0.05g/l，柠檬酸铵2g/l，Tween 20-1.1ml/l，木糖醇-20g/l，pH6.5。当培养物到达稳定期早期时(典型地是发酵48小时之后)终止培养，通过离心分离细胞(3000_g，20min)，用水洗涤并重新悬浮在含有3mM二硫苏糖醇的20mM Tris盐酸，pH7.2(缓冲液A)中。将细胞与0.3％溶菌酶(w/v)在20℃下培育60min，通过超声(3_20sec)裂解并通过离心对提取物进行澄清(12,000_g，20min)。将得到的上清液在缓冲液A中透析，然后加至以同种缓冲液平衡的Toyopearl DEAE 5PW柱(21.5_159mm)上，以线性梯度(0至1M)的NaCl对其进行洗脱。汇集含有阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶活性的组分(分析方法如实施27的描述，在Amicon PM-30膜上浓缩为10ml，然后在缓冲液A中透析。利用同种缓冲液中的线性梯度(0-1M)NaCl在Mono Q HR(5/5)柱(Pharmacia LKB)上进行层析，对制备物进行进一步分级分离。汇集活性组分，并加至以50mM Tris HCl缓冲液，pH8.0、100mM NaCl、3mM DTT平衡的Sepharose Blue CL6B(Pharmacia)柱(10_50mm)上，以同种缓冲液中的3mM NADH进行洗脱。最后，汇集Sepharose Blue层析得到的活性组分，将其加到以30mM Tris HCl，pH7.4、1.7M(NH4)2SO4平衡的Phenyl Superose HR 5/5(Pharmacia)柱上，以30mM Tris HCl缓冲液，pH7.4进行洗脱。纯化的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶(约为0.2mg，以5mM木酮糖5-磷酸为底物的比活性约为12U/mg蛋白质)在水中进行透析并冻干。
可以通过以下程序验证鸟肠球菌阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶还原D-木酮糖5-磷酸的立体专一性。D-木酮糖5-磷酸和NADH之间的反应在37℃进行几个小时，条件如下100mM Tris-HC缓冲液，pH7.0，10mM木酮糖5-磷酸，10mM NADH，1U酶。以碱性磷酸酶对反应产物进行去磷酸化，并利用HPLC进行分析。反应混合物中只发现阿拉伯糖醇和木酮糖(相应于没有反应的木酮糖5-磷酸)，证明鸟肠球菌的“木酮糖5-磷酸还原酶”是D-阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶。在本领域中没有描述过其它的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶。
通过由Helsinki大学生物技术学院(the Institute ofBiotechnology，university of Helsinki)提供的商业化服务获得了蛋白质序列。下列四种肽序列被用于克隆阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶基因(QYNLCPHR，SEQ ID NO62；EIEYIGSR，SEQ ID NO63；KQGQFIQVGLFANK，SEQ ID NO64；GAINIDEMITK，SEQ ID NO65)。许多简并寡核苷酸是根据这些序列进行设计的，并作为PCR的引物以鸟肠球菌染色体DNA为模板进行了检验。最好的结果是利用引物对oXP-1F(有义引物，CARTATAATTTITGTCCICATMG，SEQID NO66)和oXP-4R，(反义引物，ATCATTTCRTCIATRTTIATIGCICC；SEQID NO67)获得的，产生了一个约为0.65kb的PCR产物。利用此PCR产物作为杂交探针，筛选鸟肠球菌的基因文库，文库构建方法同在实施例25中描述的鼠李糖乳杆菌基因文库的筛选。按照Stratagene推荐的方法，对几个强杂交的噬菌体克隆进行分离，纯化并转变成噬菌粒的形式。将一个克隆(它显示的限制性图谱与起始0.65kb PCR产物的限制性图谱重叠)用于阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的序列测定。序列(SEQ ID NO68)包含一个352个密码子的开放阅读框，该阅读框的前面是典型的核糖体结合位点。推导出的鸟肠球菌的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO69)与许多中等链长脱氢酶的序列具有同源性。尤其可以观察到与来自B.Halodurans的一个蛋白质的推导序列有高的同源性，这个蛋白质在GenBank中被注释为“山梨糖醇脱氢酶”(SEQ ID NO70)。
实施例31
在枯草芽孢杆菌中表达鸟肠球菌和B.Halodurans的
阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶
利用与表达木糖醇磷酸脱氢酶(实施例26)相同的工具和方法对两种阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶基因进行表达。简单地说，利用分离出此酶的微生物的染色体DNA，以及适当的PCR引物对这两个阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶基因的编码区进行扩增。对于鸟肠球菌，引物是oAPDH 51GGTGAATTCATGAGTAAAACAATGAAGGGTGTTTCCAAGC(SEQ ID No26)和反义引物oAPDH 31 GGTGGAT-CCTCTAGAATTTTTGGACAGCTTCCTTGATTC(SEQ ID No27)。对于B.halodurans，有义引物是oBHDH 5(GAGGGAAT-TCATGAAAGCATTAGTAAAAACACAACATGGC，SEQ ID No28)和反义引物是oBHDH 3(CAAAGATCTAGAAG-CTTCGTCCATACGGTCCTCCTTTTCCCTAAT，(SEQ ID No29)。得到的PCR产物以限制性内切酶BamHI和EcoRI的混合物消化，并连接到以同种酶混合物水解的pGTK74上(图27A和27B)。利用所得到的表达载体pGTK74(APDH)(附图27A)和pGTK74(BHDH)(附图27B)转化枯草芽孢杆菌菌株BD170，发现这两种表达载体都能够以高水平表达“D-木酮糖5-磷酸还原酶”。按照实施例30描述的方法测定此以前未知的B.halodurans酶还原D-木酮糖5-磷酸的立体专一性。发现此酶实质上是D-阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶。
实施例32
利用重组枯草芽孢杆菌菌株生产阿拉伯糖醇
利用质粒pGTK74(APDH)转化产戊酮糖的枯草芽孢杆菌菌株GX7。菌株在“中等通气”(如实施例8定义)条件下在含有10％葡萄糖的LB培养液中培养。可以观察到在培养基中累积的阿拉伯糖醇达到约35-40g/l。
附录I-表32和表331)mc＝多拷贝质粒2)int＝整合在基因组中1)多拷贝基因的选择基因
至此我们已对本发明进行了全面的描述，本领域技术人员应理解本发明可以在宽范围的等价条件、参数等等下进行，而不影响本发明或其任何实施方案的精神和范围。本文所引用的所有参考文献均特此完整地并入本文作为参考。
序列表<110>达尼斯科甜味剂股份有限公司<120>五碳糖和糖醇的生产<130>1427.001PC05<140><141><150>US 09/488,581<151>2000-01-21<160>70<170>PatentIn Ver.3.0<210>1<211> 21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>1caatagcgac ggagagttag g 21<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>2cgacgaattc cggcgtcagc ctgaatgg 28<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>3cgacaagctt atcgaatcgg ctgatttgg 29<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>4ccaacgtcga cgaaatcaga gacgccg 27<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>5cccgaattct gtcctcctta tgtagcctg 29<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>6ccgagaattc atgaaacagt atttgattgc cccc 34<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>7cctctagagg atccaaaagc gacgccgcga atatcttcaa ac 42<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>8cccggatcca agtaataaaa agaccgccg 29<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>9cccaagcttt ccctctatca aaaaatgcgg 30<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>10gttgaattcg cgtcgacgcg ttgctggcgt ttttcc 36<210>11<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>11caagtgatca taaaatttat gaacgtatag caaccactga gcgtcagacc ccg53<210>12<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>12aattaagctt tccggatcct cgagtctaga ccgaattccc g41<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>13tcgacgggaa ttcggtctag actcgaggat ccggaaagct t41<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>14cgatagtact tgcttgaaac ccaggacaat 30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>15cgatggatcc gggaccccta tctagcgaac 30<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>16gaggaattca tgaaggcatt agtattagag aaagc35<210>17<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>17gaggaagctt ggatccagca caattttcac atcagtcgc39<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>18ccacggatcc gtcaagagta cttgaaagg 29<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>22ccagtgatat cgaggatgag attagtac 28<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>25cgctaggaac gatctcc 17<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>26tgagtaagct tatggcagaa ttttcagct 29<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
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寡核苷酸<400>36gggcccaagc ttgacgcggt ggaatctag 29<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述
寡核苷酸<400>37cactagtgtc agtggaagc 19<210>38<211>483<212>DNA<213>鼠李糖乳杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(480)<400>38atg act cag ggc gaa aag atc tca gta gca ttc gta tgc ctt ggt aac48Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15atc tgt cgt tcg cct atg gct gaa gcg gtt ttc cgc cac act gta aag96Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys
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35 40 45ggt agt tgg cac acc ggg gag acg cca gac cgc aga tca gtc tct acc192Gly Ser Trp His Thr Gly Glu Thr Pro Asp Arg Arg Ser Val Ser Thr
50 55 60tgt cgc tcc cac ggt gtt cca atc gat cat agg gca aag cag ata agg240Cys Arg Ser His Gly Val Pro Ile Asp His Arg Ala Lys Gln Ile Arg 65 70 75 80cca tcg cat ttc agt gaa ttc gat tac gtc ctc tgc atg gat gac atg288Pro Ser His Phe Ser Glu Phe Asp Tyr Val Leu Cys Met Asp Asp Met
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100 105 110gtg gaa tta ttt ggc aat tgg aac aac agt aac ggt aaa ttt gac acg384Val Glu Leu Phe Gly Asn Trp Asn Asn Ser Asn Gly Lys Phe Asp Thr
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130 135 140ttt cgt caa atc aca cat ttc agc gag tca ttc cta gac agt gaa ttg480Phe Arg Gln Ile Thr His Phe Ser Glu Ser Phe Leu Asp Ser Glu Leu145 150 155 160taa483<210>39<211>160<212>PRT<213>鼠李糖乳杆菌<400>39Met Thr Gln Gly Glu Lys Ile Ser Val Ala Phe Val Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15Ile Cys Arg Ser Pro Met Ala Glu Ala Val Phe Arg His Thr Val Lys
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115 120 125Ser Leu His His Leu Pro Ala Gly Val Asp Asp Arg Ser Ala Ala Met
130 135 140Thr Glu Pro Leu Ala Cys Thr His His Ala Ile Ala Lys Thr Ser Ile145 150 155 160Asn Lys Gly Asp Leu Val Val Val Thr Gly Pro Gly Pro Ile Gly Leu
165 170 175Leu Ala Ala Gln Val Ala Lys Ser His Gly Gly Thr Val Ile Ile Thr
180 185 190Gly Leu Ser Asn Asp Gln Val Arg Leu Lys Lys Ala Lys Glu Val Gly
195 200 205Ile Asp Tyr Ala Ile Asp Thr Gln Glu Val Asp Ile Lys Glu Leu Val
210 215 220Ser Glu Leu Thr Asp Gly Tyr Gly Ala Asp Val Val Leu Glu Cys Ser225 230 235 240Gly Ala Val Pro Ala Ala Lys Gln Gly Ile Asp Leu Leu Arg Lys Lys
245 250 255Gly Gln Tyr Ala Gln Val Gly Leu Phe Ala Gln Pro Glu Ile Gln Phe
260 265 270Asn Phe Glu Lys Ile Ile Gln Lys Glu Ile Ser Val Val Gly Ser Arg
275 280 285Ser Gln Lys Pro Ala Asp Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Leu Asn Glu
290 295 300Lys Lys Val Asn Ala Lys Thr Leu Val Thr His Glu Tyr Thr Ile Ser305 310 315 320Glu Trp Asp Lys Ala Tyr His Ala Ile Lys Ser Gly Glu Ala Ile Lys
325 330 335Val Leu Leu Thr Pro Ile Asp
340
权利要求
1.生产木糖醇的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成份的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培养遗传修饰微生物宿主；
(B)通过利用所述宿主将一种或多种戊糖磷酸途径中间物经
过阿拉伯糖醇不是中间物的途径在所述宿主中转化成所
述木糖醇，在部分(A)的所述培养中生产木糖醇；和
(C)回收部分(B)中产生的所述木糖醇；
其中在所述遗传修饰微生物宿主中所述木糖醇的产量或产率与所述遗传修饰前所述宿主中木糖醇的所述产量或产率相比增加。
2.权利要求1的方法，其中所述代谢途径包含核酮糖-5-P作为中间物。
3.权利要求2的方法，其中所述代谢途径包含核酮糖5-P、木酮糖-5-P和木糖醇-5-P作为中间物。
4.权利要求2的方法，其中所述代谢途径包含(1)核酮糖-5-P、(2)核酮糖、和(3)木酮糖及木糖中的至少一个作为中间物。
5.权利要求1的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核酮糖-5-P 3-差向异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
6.权利要求1的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中木酮糖激酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比降低。
7.权利要求1的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中木糖醇脱氢酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
8.权利要求7的方法，其中所述，木糖醇脱氢酶是T.reesei木糖醇脱氢酶。
9.权利要求1的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中木糖醇磷酸脱氢酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
10.权利要求9的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是鼠李糖乳杆菌木糖醇1-磷酸脱氢酶。
11.权利要求10的方法，其中所述鼠李糖乳杆菌木糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO49的氨基酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述鼠李糖乳杆菌木糖醇磷酸脱氢酶由包含SEQ ID NO48的核酸序列的基因编码。
13.权利要求9的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是B.halodurans木糖醇1-磷酸脱氢酶。
14.权利要求13的方法，其中所述B.halodurans木糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO50的氨基酸序列。
15.权利要求9的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是艰难梭菌木糖醇1-磷酸脱氢酶。
16.权利要求15的方法，其中所述艰难梭菌木糖醇磷酸脱氢酶包含具有选自SEQ ID NO51、52和53的序列的氨基酸序列。
17.生产木酮糖5-P衍生产物的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成份的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培养遗传修饰微生物宿主；
(B)通过利用所述宿主将一种或多种戊糖磷酸途径中间物在
所述宿主中转化成所述木酮糖-5-P，在部分(A)的所述培
养中生产木酮糖-5-P；
(C)将所述宿主在部分(A)的所述培养过程中产生的所述木酮
糖-5-P转化成所述木酮糖-5-P衍生产物；
(D)回收部分(C)中产生的所述木酮糖-5-P衍生产物；
其中在所述遗传修饰宿主中所述木酮糖-5-P的产量或产率与所述遗传修饰前所述宿主中所述木酮糖-5-P的产量或产率相比增加。
18.权利要求17的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核酮糖5-P 3-差向异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
19.权利要求17的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中木糖异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
20.权利要求17的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中甘露糖异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
21.权利要求17的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中木糖醇1-磷酸脱氢酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
22.权利要求21的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是鼠李糖乳杆菌木糖醇1-磷酸脱氢酶。
23.权利要求22的方法，其中所述鼠李糖乳杆菌木糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO49的氨基酸序列。
24.权利要求23的方法，其中所述鼠李糖乳杆菌木糖醇磷酸脱氢酶由包含SEQ ID NO48的核酸序列的基因编码。
25.权利要求21的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是B.halodurans木糖醇1-磷酸脱氢酶。
26.权利要求25的方法，其中所述B.halodurans木糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO50的氨基酸序列。
27.权利要求21的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是艰难梭菌木糖醇磷酸脱氢酶。
28.权利要求27的方法，其中所述艰难梭菌木糖醇磷酸脱氢酶包含具有选自SEQ ID NOs51、52和53的序列的氨基酸序列。
29.权利要求17的方法，其中所述产物是D-木酮糖。
30.权利要求17的方法，其中所述产物是D-木糖。
31.权利要求17的方法，其中所述产物是D-来苏糖。
32.生产核酮糖-5-P衍生产物的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培养遗传修饰的微生物宿主；
(B)通过利用所述宿主将一种或多种戊糖磷酸途径中间物在
所述宿主中转化成所述核酮糖5-P，在部分(A)的所述培
养过程中生产核酮糖5-P；
(C)将所述宿主在步骤(A)的所述培养过程中产生的所述核酮
糖-5-P转化成所述核酮糖-5-P衍生产物；
(D)回收步骤(c)中产生的所述核酮糖5-P衍生产物；
其中所述遗传修饰微生物宿主中所述核酮糖-5-P衍生产物的产量或产率与所述遗传修饰前所述宿主中所述核酮糖-5-P衍生产物的产量或产率相比增加。
33.权利要求32的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核酮糖-5-P 3-差向异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比减少。
34.权利要求32的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核酮糖还原酶(NADPH)的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
35.权利要求32的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核糖醇脱氢酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
36.权利要求32的方法，其中所述遗传修饰宿主表达L-果糖异构酶。
37.权利要求32的方法，其中所述遗传修饰宿主表达塔格糖差向异构酶和木糖异构酶。
38.权利要求32的方法，其中所述产物是核酮糖。
39.权利要求32的方法，其中所述产物是D-阿拉伯糖醇。
40.权利要求32的方法，其中所述产物是D-阿拉伯糖。
41.权利要求32的方法，其中所述产物是核糖醇。
42.权利要求32的方法，其中所述产物是D-木糖。
43.权利要求32的方法，其中所述产物是包含核酮糖、D-阿拉伯糖醇、D-阿拉伯糖和核糖醇的混合物。
44.生产核糖-5-P衍生产物的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培养遗传修饰的微生物宿主；
(B)通过利用所述宿主将一种或多种戊糖磷酸途径中间物在
所述宿主中转化成所述核糖-5-P，在部分(A)的所述培养
过程中生产核糖-5-P；
(C)将所述宿主在部分(A)的所述培养过程中产生的所述核糖
-5-P转化成所述核糖-5-P衍生产物；
(D)回收部分(C)中产生的所述核糖-5-P衍生产物；
其中所述遗传修饰宿主中所述核糖-5-P衍生产物的产量或产率与所述遗传修饰前所述宿主中的所述核糖-5-P衍生产物的产量或产率相比增加。
45.权利要求45的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核糖-5-P异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
46.权利要求44的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中所述宿主缺少转酮酶。
47.权利要求44的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核酮糖-5-P 3-差向异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比减少。
48.权利要求47的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中所述宿主缺少转酮酶活性。
49.权利要求44的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核酮糖还原酶(NADPH)的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
50.权利要求44的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中核糖醇脱氢酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
51.权利要求44的方法，其中所述遗传修饰宿主表达L-果糖异构酶。
52.权利要求44的方法，其中所述产物是核糖-5-P。
53.权利要求44的方法，其中所述产物是核糖醇。
54.权利要求44的方法，其中所述产物是核糖。
55.权利要求1、17、32或44之任一项的方法，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，所述宿主使得进入戊糖磷酸途径氧化阶段的碳流增加。
56.权利要求55的方法，其中所述宿主经遗传修饰含有使用ATP作为磷酸供体的葡萄糖吸收系统。
57.权利要求56的方法，其中所述系统是葡糖激酶-己糖激酶系统。
58.权利要求55的方法，其中所述宿主经遗传修饰使glcUgdh操纵子的表达增加。
59.权利要求58的方法，其中所述glcUgdh操纵子是枯草芽孢杆菌glcUgdh操纵子。
60.权利要求55的方法，其中所述宿主以一定方式进行了遗传修饰，使得在部分(A)的所述培养过程中糖酵解途径中葡萄糖-6-P的利用与所述遗传修饰前所述宿主中的所述利用相比减少。
61.权利要求60的方法，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培养过程中所述宿主缺少葡糖磷酸异构酶活性。
62.权利要求60的方法，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培养过程中所述宿主缺少果糖磷酸激酶活性。
63.权利要求60的方法，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培养过程中所述宿主缺少果糖二磷酸醛缩酶活性。
64.权利要求1、17、32或44的方法，其中通过在所述宿主中引入至少一个基因对所述宿主进行遗传修饰，其中所述基因能够表达能够在戊糖磷酸途径氧化阶段中参与NADPH再生的酶。
65.权利要求64的方法，其中所述酶是转氢酶。
66.权利要求64的方法，其中所述酶选自NAD(P)H依赖性脱氢酶和NAD(P)H依赖性还原酶。
67.权利要求1、17、32或44之任一项的方法，其中所述遗传修饰宿主转化了编码葡糖激酶或己糖激酶的基因。
68.权利要求1、17、或32之任一项的方法，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培养过程中所述遗传修饰宿主缺少核糖-5-P异构酶活性。
69.权利要求1、17、32或44之任一项的方法，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培养过程中所述遗传修饰宿主缺少转酮酶活性。
70.权利要求1、17、32或44之任一项的方法，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，在部分(A)的所述培养过程中所述遗传修饰宿主缺少转醛醇酶活性。
71.权利要求1、17、32或44之任一项的方法，其中所述遗传修饰宿主的遗传修饰使得在部分(A)的所述培养过程中去磷酸化酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
72.权利要求71的方法，其中所述去磷酸化酶蛋白选自DOG1、DOG2、LPT1、PPase1、PPase2和低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶。
73.权利要求71的方法，其中所述去磷酸化蛋白由包含选自SEQ ID NO38和SEQ ID NO40的序列或其部分的基因编码。
74.权利要求1、17、32或44之任一项的方法，其中所述遗传修饰宿主缺少戊糖激酶、戊酮糖激酶、或两种均缺少。
75.通过权利要求1、17、32或44之任一项的方法生产的产物。
76.生产D-阿拉伯糖醇的方法，所述方法包括
(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、
及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚
物以外的碳源上，培养遗传修饰的微生物宿主；
(B)通过利用所述宿主将一种或多种戊糖磷酸途径中间物在
所述宿主中转化成所述D-阿拉伯糖醇，在部分(A)的所述
培养过程中生产D-阿拉伯糖醇；
(C)回收部分(B)中产生的所述D-阿拉伯糖醇；
其中所述遗传修饰微生物宿主中所述D-阿拉伯糖醇的产量或产率与所述遗传修饰前所述宿主中所述D-阿拉伯糖醇的产量或产率相比增加。
77.权利要求76的方法，其中所述微生物宿主被编码阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的基因转化。
78.权利要求77的方法，其中所述阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶来自鸟肠球菌。
79.权利要求78的方法，其中所述阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO69的氨基酸序列。
80.权利要求78的方法，其中所述阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶由包含SEQ ID NO68的核酸序列的基因编码。
81.权利要求77的方法，其中所述阿拉伯糖醇5-磷酸脱氢酶来自B.halodurans并且其中所述阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO69的氨基酸序列。
82.权利要求76-79之任一项的方法，其中所述宿主还被编码木糖醇磷酸脱氢酶的基因转化。
83.权利要求82的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是鼠李糖乳杆菌、B.halodurans、或艰难梭菌的木糖醇磷酸脱氢酶。
84.权利要求83的方法，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO49、50、51、52或53之任一个的氨基酸序列。
85.权利要求1、17、32、44或76之任一项的方法，其中所述微生物宿主是细菌。
86.权利要求85的方法，其中所述微生物宿主是芽孢杆菌。
87.权利要求86的方法，其中所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
88.权利要求1、17、32、44或76之任一项的方法，其中所述微生物宿主是真菌。
89.权利要求88的方法，其中所述真菌是酵母。
90.遗传修饰的微生物宿主，其中当在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培养时，所述宿主能够产生木糖醇，方式是通过阿拉伯糖醇不是中间物的代谢途径将一种或多种戊糖磷酸途径中间物转化成所述木糖醇，并且其中与所述遗传修饰前宿主产生的木糖醇水平相比，所述宿主经遗传修饰产生增加量的木糖醇。
91.遗传修饰的微生物宿主，其中当在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培养时，所述宿主能够产生核酮糖-5-P衍生产物，方式是通过代谢途径将一种或多种戊糖磷酸途径中间物转变成所述核酮糖-5-P衍生产物，其中与所述遗传修饰前宿主产生的水平相比，所述宿主经遗传修饰产生增加量的所述核酮糖-5-P衍生产物。
92.遗传修饰的微生物宿主，其中当在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培养时，所述宿主能够产生木酮糖-5-P衍生产物，方式是通过代谢途径将一种或多种戊糖磷酸途径中间物转变成所述木酮糖-5-P衍生产物，其中与所述遗传修饰前宿主产生的水平相比，所述宿主经遗传修饰产生增加量的所述木酮糖-5-P衍生产物。
93.遗传修饰的微生物宿主，其中当在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培养时，所述宿主能够产生核糖-5-P衍生产物，方式是通过代谢途径将一种或多种戊糖磷酸途径中间物转变成所述核糖-5-P衍生产物，其中与所述遗传修饰前宿主产生的水平相比，所述宿主经遗传修饰产生增加量的所述核糖-5-P衍生产物。
94.权利要求91或93的宿主，其中与所述遗传修饰前所述宿主中发现的核酮糖-5-P 3-差向异构酶活性相比，所述遗传修饰宿主缺少此活性。
95.权利要求90、91、92或93之任一项的宿主，其中与所述遗传修饰前的所述宿主相比，所述宿主使得进入戊糖磷酸途径氧化阶段的碳硫增加。
96.权利要求95的宿主，其中所述宿主经遗传修饰含有使用ATP作为磷酸供体的葡萄糖吸收系统。
97.权利要求96的宿主，其中所述系统是葡糖激酶-己糖激酶系统。
98.权利要求95的宿主，其中所述宿主经遗传修饰使glcUgdh操纵子的表达增加。
99.权利要求98的方法，其中所述glcUgdh操纵子是枯草芽孢杆菌glcUgdh操纵子。
100.权利要求95的宿主，其中所述宿主以一定方式进行了遗传修饰，使得糖酵解途径中葡萄糖-6-P的利用与所述遗传修饰前所述宿主的相比减少。
101.权利要求100的宿主，其中与所述遗传修饰前所述宿主中的葡糖磷酸异构酶活性相比，所述宿主缺少此活性。
102.权利要求100的宿主，其中与所述遗传修饰前所述宿主中的果糖磷酸激酶活性相比，所述宿主缺少此活性。
103.权利要求100的宿主，其中与所述遗传修饰前所述宿主中的果糖二磷酸醛缩酶活性相比，所述宿主缺少此活性。
104.权利要求90、91、92或93之任一项的宿主，其中通过在所述宿主中引入至少一个基因对所述宿主进行遗传修饰，其中所述基因能够表达能够在戊糖磷酸途径氧化阶段参与NADPH再生的酶。
105.权利要求104的宿主，其中所述酶是转氢酶。
106.权利要求104的宿主，其中所述酶是NAD(P)H依赖性脱氢酶或NAD(P)H依赖性还原酶。
107.权利要求90、91、92或93之任一项的宿主，其中所述遗传修饰宿主缺少转醛醇酶。
108.权利要求90、91、92或93之任一项的宿主，其中所述遗传修饰宿主缺少转酮酶。
109.权利要求90、91、92或93的宿主，其中所述遗传修饰宿主使脱磷酸化蛋白的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
110.权利要求109的宿主，其中所述去磷酸化蛋白选自DOG1、DOG2、LPT1、PPase1、PPase2和低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶。
111.权利要求109的宿主，其中所述去磷酸化蛋白由包含选自SEQ ID NO38和SEQ ID NO40的序列或其部分的基因编码。
112.权利要求90的宿主，其中所述遗传修饰宿主使得木糖醇脱氢酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
113.权利要求112的宿主，其中所述木糖醇脱氢酶是T.reesei木糖醇脱氢酶。
114.权利要求90或91之任一项的宿主，其中所述遗传修饰宿主使得塔格糖异构酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
115.权利要求90或92之任一项的宿主，其中所述遗传修饰宿主使得木糖醇1-P脱氢酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
116.权利要求115的宿主，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是鼠李糖乳杆菌木糖醇磷酸脱氢酶。
117.权利要求116的宿主，其中所述鼠李糖乳杆菌木糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO49的氨基酸序列。
118.权利要求117的宿主，其中所述鼠李糖乳杆菌木糖醇磷酸脱氢酶由包含SEQ ID NO48的核酸序列的基因编码。
119.权利要求115的宿主，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是B.halodurans木糖醇磷酸脱氢酶。
120.权利要求119的宿主，其中所述B.halodurans木糖醇磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO50的氨基酸序列。
121.权利要求115的宿主，其中所述木糖醇磷酸脱氢酶是艰难梭菌木糖醇磷酸脱氢酶。
122.权利要求121的方法，其中所述艰难梭菌木糖醇磷酸脱氢酶包含具有选自SEQ ID NOs51、52和53的序列的氨基酸序列。
123.权利要求90或91之任一项的宿主，其中所述遗传修饰宿主缺少戊糖激酶、戊酮糖激酶、或两种均缺少。
124.权利要求90、91、92或93之任一项的宿主，其中所述遗传修饰宿主使得葡糖激酶或己糖激酶的总活性与遗传修饰前所述宿主中的所述活性相比增加。
125.权利要求90、91或92之任一项的宿主，其中与所述遗传修饰前所述宿主中发现的核糖-5-P异构酶活性相比，所述遗传修饰宿主缺少此活性。
126.权利要求90、91或92之任一项的宿主，其中与所述遗传修饰前所述宿主中发现的核糖-5-P异构酶活性和转酮酶活性相比，所述遗传修饰宿主缺少这些活性。
127.权利要求90、91、92或93之任一项的宿主，其中所述微生物宿主是细菌。
128.权利要求127的宿主，其中所述细菌是芽孢杆菌。
129.权利要求128的宿主，其中所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
130.权利要求90、91、92或93之任一项的宿主，其中所述微生物宿主是真菌。
131.权利要求130的宿主，其中所述真菌是酵母。
132.分离的多核苷酸，其包含编码具有SEQ ID NO49的氨基酸序列的木糖醇磷酸脱氢酶或其具有相同功能的同系物的核苷酸序列。
133.包含编码木糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求132的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少95％同一性。
134.包含编码木糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求132的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少85％同一性。
135.包含编码木糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求132的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少75％同一性。
136.包含编码木糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求132的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少65％同一性。
137.包含编码木糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求132的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少55％同一性。
138.包含编码木糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求132的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQ IDNO49的氨基酸序列有至少35％同一性。
139.权利要求132的多核苷酸，其中所述序列编码SEQ IDNO49的氨基酸序列。
140.权利要求132的多核苷酸，其中所述SEQ ID NO49的所述氨基酸序列由SEQ ID NO48的多核苷酸序列编码。
141.包含权利要求132、139和140之任一项的多核苷酸的载体。
142.权利要求141的载体，其中所述多核苷酸可操作地与启动子序列连接。
143.包含权利要求132、139-142之任一项的多核苷酸的宿主细胞。
144.权利要求143的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌。
145.权利要求144的宿主细胞，其中所述细菌是芽孢杆菌。
146.权利要求145的宿主细胞，其中所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
147.制备木糖醇磷酸脱氢酶的方法，所述方法包括在所述脱氢酶能够得以表达的条件下培养权利要求143-146之任一项的宿主细胞，和表达所述脱氢酶。
148.分离的多核苷酸，其包含编码具有SEQ ID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶或其具有相同功能的同系物的核苷酸序列。
149.包含编码阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求148的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQID NO69或S EQ ID NO70的氨基酸序列有至少99％同一性。
150.包含编码阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求148的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少95％同一性。
151.包含编码阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求148的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少85％同一性。
152.包含编码阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求148的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少75％同一性。
153.包含编码阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求148的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少55％同一性。
154.包含编码阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的核苷酸序列的根据权利要求148的分离多核苷酸，其中所述酶的氨基酸序列与SEQID NO69或SEQ ID NO70的氨基酸序列有至少35％同一性。
155.权利要求148的多核苷酸，其中所述序列编码SEQ IDNO69的氨基酸序列。
156.权利要求155的多核苷酸，其中所述SEQ ID NO69的所述氨基酸序列由SEQ ID NO68的多核苷酸序列编码。
157.包含权利要求148、155-156之任一项的多核苷酸的载体。
158.权利要求157的载体，其中所述多核苷酸可操作地与启动子序列连接。
159.包含权利要求148、155-158之任一项的多核苷酸的宿主细胞。
160.权利要求159的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌。
161.权利要求160的宿主细胞，其中所述细菌是芽孢杆菌。
162.权利要求161的宿主细胞，其中所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
163.制备阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的方法，所述方法包括在所述脱氢酶能够得以表达的条件下培养权利要求159-162之任一项的宿主细胞，和表达所述脱氢酶。
164.阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶对于微生物宿主细胞中阿拉伯糖醇的重组生产的用途。
165.阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶对于微生物宿主细胞中木糖醇的重组生产的用途。
166.权利要求165的用途，其中所述生产还利用了阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶。
全文摘要
本发明涉及利用代谢工程化的微生物宿主，从容易获得的底物如己糖，生产五碳糖和糖醇以及其它来源于戊糖磷酸途径的化合物的方法。
文档编号C12P7/02GK1395618SQ01803948
公开日2003年2月5日 申请日期2001年1月22日 优先权日2000年1月21日
发明者A·米亚斯尼科夫, H·奥亚莫, M·波韦拉莱纳, H·格罗斯, M·托伊瓦里, P·理查德, L·罗霍宁, K·科伊武兰塔, J·隆代伯勒夫, A·阿里斯蒂祖, M·彭蒂莱, C·普拉扎内－默尼, J·多伊彻 申请人:达尼斯科甜味剂股份有限公司