专利名称：：新构建的高产富马酸基因工程菌及其生产富马酸的方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一抹产富马酸重组菌抹的构建，还涉及利用该菌抹发酵生产富马酸的方法。
背景技术：
：富马酸(又称延胡索酸)作为一种重要的四碳平台化合物，在医药、食品以及表面活性剂等行业有着广泛的用途，可以通过酶催化转化、酯化、加氬等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1,4-丁二醇、y-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。目前富马酸主要通过顺丁烯二酸酐异构化和糠眵氧化法生产，化学合成富马酸因成本高和环境污染等原因使得富马酸作为基本化工原料的广泛应用受到限制。富马酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以马来酸为底物，在马来酸异构酶作用下制备富马酸，但原料马来酸供应不足，且价格昂贵。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备富马酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、酵母及细菌。其中根霉菌朋/zo/7^为重点研究的对象，具体包括米根霉/Wzo/^w7zae、少才艮才艮霉//z/zo/iMwr/z/zi^以及黑才艮霉i/7/zopiww'gr/ca/w等。在这一时期，我国牙牛学家对微生物发酵法生产富马酸的研究工作也进行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等筛选出了具有产富马酸能力的少根根霉，当振荡培养于含有12%葡萄糖的培养基时，富马酸产量为53.15g/L,得率为45%,同时产生了较多的副产物如苹果酸等，但发酵周期较长，需要ll天左右(食品与发酵工业，1988)。美国Purdue大学的Tsao教授等利用米根霉发酵产富马酸，98g/L初始葡萄糖发酵48h,其富马酸产量为33g/L,得率为33.7%(BioprocessBiosystEng,2002,25:179~181)。发酵法生产富马酸可以利用可再生资源和二氧化碳，不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径。因此，以微生物发酵法生产富马酸的研究与开发正在美国、日本等国家深入地进行着。但霉菌生长速度慢，产品生产强度偏低。开发对营养条件需求简单、生长迅速、收率高的C4有机酸生产菌抹是加速生物法替代石化法生产的关键。利用大肠杆菌来发酵生产富马酸，是利用了大肠杆菌生长快速、生长周期短、培养条件简单、安全性好、价格低廉等诸多优点，实现富马酸优质高产工业化生产的方向。而提高大肠杆菌的发酵产酸能力，可以用多种方法，包括重新筛选优良菌林、通过传统的物理化学方法进行菌种诱变以及用现代遗传育种技术、基因工程方法来提高菌种的产酸能力等。SoonHoHong等人报道了构建产琥珀酸基因工程菌的方法，原理是敲除野生大肠杆菌中的丙酮酸曱酸裂解酶基因(PFL)和乳酸脱氢酶基因(LDH),减少甚至不产副产物曱酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代谢流流向琥珀酸(BiotechnolBioeng:2001,74:89-95)。在此基础下，如果能够敲除FRD,则可以阻断最后一步富马酸到琥珀酸的反应，使产物以富马酸的形式积累。采用基因工程手段构建高产富马酸的大肠杆菌菌以及利用该基因工程菌用于厌氧发酵生产富马酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进富马酸产业的进步和发展。
发明内容本发明的目的在于提供一种能高产富马酸的基因工程菌林及其构建方法，并利用该菌林厌氧生产富马酸，达到菌抹的构建方法简单方便，构建得到的菌林发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强，从而大大降低生产成本，提高经济效益。为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案1、高产富马酸基因工程菌林Esc&hcWaco//JM125的构建本发明构建到的基因工程菌林，分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌Esc/zen'cWflco//JM125,其保藏号登记号为CGMCCNo.2301。本发明以缺乏乳酸脱氢酶基因(LDH),丙酮酸曱酸裂解酶基因(PFL)活性的菌抹NZNlll为出发菌抹，利用同源重组技术敲除富马酸还原酶FRD基因，并过量表达苹果酸酶后，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得fod^mc/^aco//JM125,重组菌抹的代谢途径如图1所示。具体步骤如下(1)利用同源重组技术敲除富马酸还原酶FRD基因本发明以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有FRD同源片段的扩增引物，成功扩增出线性DNA同源片段；同时，在出发菌林中导入能够诱导表达X重组酶的质粒，使在电转入线性DNA片段后，可以抑制菌体内部的核酸外切酶，防止线性片段的分解，同时进行同源重组。通过抗性筛选获得阳性重组子。然后，利用FRT位点的存在，敲除抗性基因。本发明利用诱导表达FLP重组酶后成功将抗性基因敲除，达到无痕敲除的目的，其中实现过程如下导入能够谦导产生FLP重组酶的质粒，在诱导后，利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌抹。(2)过量表达苹果酸酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得co/z扁25:合成一对5'端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-s/cA将质粒pTrc99a"/d导入之前消除安普霉素抗性菌抹的感受态，获得的阳性转化子即为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在成功敲除FRD基因后，超量表达苹果酸酶，恢复在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。2、基因工程菌抹Eyd7m'c/z/aco/fJM125的发酵生产富马酸厌氧发酵过程中产生大量诸如乙酸等对菌抹有毒害作用的副产物，因此考虑采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段进行发酵产酸。也可选择性地采用膜分离技术，达到分离菌体的目的，再进而用于厌氧发酵。具体步骤为采用两阶段发酵模式，按1°/。(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD6oo至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD6(X)=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。或者，采用两阶段发酵模式，按1%(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD6oo至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD6(K)=3左右时，经膜处理后，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。发酵结果表明新构建的重组大肠杆菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>能大量积累富马酸，丁二酸积累较少，相比出发菌抹的终产物为丁二酸，且无富马酸积累的特征，新构建的重组大肠杆菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>产酸特征变化巨大。而采用膜过滤后转接厌氧发酵48h，17.5g/L初始葡萄糖可产10.7g/L富马酸。未经膜处理的也能达到9.1g/L的富马酸，得率52%，生产强度0.19g/(L'h)。当以80g/L葡萄糖为初始糖浓度时，富马酸产量最高，为30.5g/L。本发明的有益效果在于利用代谢工程手段，对大肠杆菌进行目标产物途径的强化，以及切断副产物的生成途径，使代谢流更多地流向富马酸。并利用该菌林进行两阶^C酵实验，结果显示可生产较高浓度的富马酸，为利用大肠杆菌工业化生产富马酸打下基础。图1Esc/im'cWaco//JM125的代谢途径图2线性DNA片段的电泳鉴定图图3同源重组阳性重组子的电泳鉴定4NZN111(pTrc99a-s/c4)敲除富马酸还原酶前后的有才几酸产物比较本发明的微生物保藏日期为2007年12月27日，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通孩i生物中心，简称CGMCC,保藏编号CGMCCNo.2301。具体实施方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。实施例1本实施例说明利用同源重组技术敲除亲本大肠杆菌NZN111中富马酸还原酶>^基因，得到消除安普霉素抗性菌抹的过程。1、利用LB培养基，于37。C、有氧条件下培养大肠杆菌NZN111至OD6(W=0.4~0.6,制备成电转感受态。2、将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌NZNlll。电击条件为200Q,25^F,电击电压2.3kv,电击时间4~5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1mL的SOC培养基，150r/min、30。C培养1h之后涂布于带氨爷青審素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子NZNlll(pKD46)。3、在LB培养基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30"C下诱导质粒pKD46表达出5i重組酶，制成电转感受态。4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有FRD同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下上游带同源臂引物HI-PI,下划线为同源片段:CCGGGGATCCGTCGACC-3，下游带同源臂引物H2-P2,下划线为同源片段:GGCTGGAGCTGCTTC-3'反应体系:带同源臂的上下游引物(100pmol/nl)各0.5pi;模板DNA(100ng尔l)0.5pl;10xbuffer5pl;dNTPs(10mM)各1(J;DMSO(100%)2.5pl;PyrobestDNA聚合酶(2.5U1)1^1;ddH2036/35.5^1;总体积50^1。反应条件94°C，2min;(94°C,45sec;5(TC,45sec;72°C,90sec;10个循环)；(94。C>45sec;55°C,45sec;72。C,卯sec;15个循环)；72。C，5min。线性DNA片段的鉴定如图2。5、电转线性DNA片段至已诱导表达X重组酶的NZNlll(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定，电泳图如图3所示。6、阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20,于42'C热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌抹。敲除了富马酸还原酶后的有机酸产物比较如图4所示。实施例2本实施例说明构建超量表达苹果酸酶的表达质粒，恢复重组菌抹在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到菌抹j&c/zen'c/^co//JM125的过程。1、构建超量表达苹果酸酶的表达质粒，其过程包括(1)合成带有/^01和州>/111酶切位点的引物，上游引物5，-CATGCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGTG-3，，下游引物5，-CCCAAGCTTTTAGATGGAGGTACGGC-3，(2)以大肠杆菌K12为模板，菌落PCR,反应条件为95。C,1.5min，63°C,l.Omin，72'C，1.5min,共35个循环。纯化扩增出的^/^基因后，表达质粒pTrc99a分别用MroI和历"dIII双酶切、连接荻得重组质粒pTrc99a"/d。2、将质粒pTrc99a-s/d导入实施例1中消除安普霉素抗性菌抹的感受态。获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌抹」foc/zer/c/n'aco//JM125。实施例3本实施例说明新构建的重组大肠杆菌Eyc/zeWc/z/flco//JM125与出发菌林NZN111发酵产酸能力的对比。大肠杆菌NZN111(CGSC7726)当导入质粒pTrc99a-;y/cvi,过量表达苹果酸酶基因，恢复了NZN111在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，且有高产量的琥珀酸积累。构建的重组大肠杆菌EscfehcWflco//JM125,在无氧条件下生长时，它产富马酸，琥珀酸，乙酸的混合酸，其中富马酸是主要产物。为了考察富马酸还原酶活性降低后对产酸的影响，采用两阶段发酵模式，按1%(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD6oi)至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD6QQ=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。有氧阶段培养基为LB+kan(卡那霉素30吗/mL)+amp(氨苄青霉素100吗/mL)厌氧阶段培养基为LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸镁(15g/L)十kan(30ng/mL)+amp(脚g/mL)发酵结果见表l。表l过量表达苹果酸酶对NZNU1发酵产酸的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注ND表示未检测到实施例4本实施例说明将膜处理方法应用到新构建的重组大肠杆菌&c/^hcWflco//JM125发酵生产富马酸的产酸能力比较。大肠杆菌￡yc/^enc/2/aco//JM125,在有氧发酵阶段产生一定量乙酸，会影响第二阶段厌氧发酵过程菌体的生长，因此采用膜过滤处理，截流下菌体后，经洗脱后作为接种物进行厌氧发酵。为了考察其对菌体生物量及产物的影响，采用两阶段发酵模式，按l。/。(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD6otr3左右时，经膜处理后，转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h,并以不经膜处理的接种物作为对照。有氧阶段培养基为LB+kan(30昭/mL)+amp(100吗/mL)厌氧阶段培养基为LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸镁(15g/L)+kan(30ng/mL)+amp(100pg/mL)发酵结果见表2。表2膜处理后对JM125发酵产酸及菌体生物量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注ND表示未检测到实施例5本实施例中考察了大肠杆菌Esc/^n'c/n'aco//JM125对葡萄糖耐受性。随着起始葡萄糖浓度的提高，80g/L葡萄糖下，单位体积的菌体量基本不变，进一步提高葡萄糖浓度，菌体生长受到抑制，见图5。同时对不同浓度下富马酸的产量进行了考察。采用两阶段发酵模式，按1%(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.8~1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD6M=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。有氧阶段培养基为LB+kan(30昭/mL)+amp(100吗/mL)厌氧阶段培养基为LB+葡萄糖(20g/L)+碳酸镁(l5g/L)+kan(30吗/mL)+amp(100ng/mL)发酵结果见表3。表3不同葡萄糖浓度下JM125的产富马酸能力<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、一种高产富马酸的基因工程菌，其分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌EscherichiacoliJM125，其保藏号登记号为CGMCCNo.2301。2、一种构建权利要求1所述高产富马酸的基因工程菌的方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因(LDH),丙酮酸曱酸裂解酶基因(PFL)活性的菌抹NZNlll为出发菌林，利用同源重组技术敲除富马酸还原酶(FRD)基因，并过量表达苹果酸酶后，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得大肠杆菌Esc/zen'cWaco//JM125。3、根捧权利要求2所述的构建大肠杆菌￡^/^^/7&0)//]^125的方法，其特征包括以下构建步骤1)利用同源重组技术敲除富马酸还原酶(FRD)基因以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有FRD同源片段的扩增引物，成功扩增出线性DNA同源片段；在出发菌抹中导入能够诱导表达人重组酶的质粒，使在电转入线性DNA片段后，可以抑制菌体内部的核酸外切酶，防止线性片段的分解，同时进行同源重组。通过抗性筛选获得阳性重组子；导入能够诱导产生FLP重组酶的质粒，在诱导后，利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌林。2)过量表达苹果酸酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得大肠杆菌Escte"'c/z/aco/ZJM125。合成一对5'端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的s/c^基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a"/d;将质粒pTrc99a-^/^4导入之前消除安普霉素抗性菌抹的感受态。获得的阳性转化子即为Esc/ze〃'c/7/aco/z'JM125;在成功敲除FRD基因后，超量表达苹果酸酶，恢复在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。4、一种利用如权利要求1所述的高产富马酸的基因工程菌&dzen'c/7/aco//JM125发酵生产富马酸的方法，其特征在于釆用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。5、根据权利要求4所述的采用两阶段发酵方式，其特征在于按1%(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD6oo至0.8-1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD6oo=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。6、一种利用如权利要求4所述的高产富马酸的基因工程菌Eyc/^hc/z/aJM125发酵生产富马酸的方法，其特征在于发酵在经历有氧发酵阶段后采用膜分离过程，再进而用于厌氧发酵。7、根据权利要求6所述的采用两阶段发酵方式，其特征在于按1%(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD,至0.8-l.O左右用0.7mM的IPTG诱导至OD6otr3左右时，经膜处理后，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。8、根据权利要求6和7所述的膜分离过程，其特征在于采用的膜为微滤膜。全文摘要本发明公开了一种构建产富马酸基因工程菌株EscherichiacoliJM125的方法及其产酸的方法，其构建过程主要包括失活或敲除兼性微生物中具有还原富马酸及降解丙酮酸能力的酶，并超量表达NAD再生的酶。利用已构建的一株大肠杆菌进行两阶段发酵实验，其步骤如下(1)将活化的大肠杆菌接种于富集培养基，好气培养，提高生物量；(2)将有氧培养得到的菌液膜处理后，转接于含有20～100g/L葡萄糖，一定浓度碳酸盐的LB培养基中，厌氧发酵生产富马酸。文档编号C12N1/21GK101240259SQ20081001921公开日2008年8月13日申请日期2008年1月16日优先权日2008年1月16日发明者丽于,岷姜,王益娜,马江锋,黄秀梅申请人:南京工业大学