专利名称：：RAGEGly82Ser突变体在制备胃癌筛查试剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体地说涉及一种基因突变体的新应用。技术背景胃癌的发生是一个复杂、多阶段、多因素的过程[1，2]。与许多恶性肿瘤相似，胃癌是环境因素和宿主遗传因素交互作用的结果[3]，世界上近42%的胃癌发生在中国[1]。我们过去的流行病学研究也提供证据表明胃癌风险与基因突变相关[4-6]。晚期糖基化终产物受体(receptorforadvancedglycationendproducts,RAGE)是免疫球蛋白超家族的成员之一[7]。它参与许多重要的病理学反应，包括Alzheimer's病、糖尿病、炎症和癌症[8-11]。RAGE刺激癌症生长、生存和转移[ll]。此外，RAGE表达与胃癌侵袭和转移密切相关[12]。而且，有报道表明阻断RAGE可抑制胃癌细胞侵袭[12]。有报道Ser82通过细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶(MAPK)和核因子kB(NF-kB)增强配体亲和力，上调受体信号[15，16]。RAGE与晚期糖基化终产物(AGEs)、S100蛋白等相作用[IO]。配体与受体RAGE的作用激活重要细胞通路，包括MAPK,Cdc42/Rac和NF-kB信号通路[11，17，18]。RAGE的基因位于第6条常染色体短臂21.3，包括11个外显子[13]。迄今为止，一些遗传性变异已在WG五基因鉴别[14],相对高频率的变异之一为Gly82Ser(rs2070600,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp—ref.cgirs=2070600)[15，16]。它位于WG五外显子3的密码子82(GGC—AGC)。这个变异致使其蛋白质配体结合域内的甘氨酸转变为丝氨酸，它是一个有功能的变异现象，与增强RAGE信号相关[16]。目前没有涉及iL4G五Gly82Ser突变与癌症风险关系的研究报道。也未见/MGEGly82Ser基因突变试剂盒应用于胃癌筛查中报道。
发明内容本发明的目的是提供上述WG五突变体Gly82Ser在制备胃癌筛查试剂中的新用途。技术方案iL4G五Gly82Ser基因突变试剂盒包括一对引物(正义5'-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3'，反义5'-GGCCAAGGCTGGGGTTGAAGG-3')，r叫酶，PCRbuffer,MgCl2,dNTPs,限制性内切酶^/"，琼脂糖。通过病例-对照研究，用PCR-RFLP方法测定WGi:Gly82Ser变异。胃癌病例和对照的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律。病例和对照组的基因型频率有统计学差别(Pearson=6.552，尸=0.038)。而且，病例组Ser82等位基因频率较对照组高(Pearson=5.855，P=0.016)。用82Gly/Gly基因型作为参照，变异基因型(82Gly/Ser和82Ser/Ser)的OR值，在校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病后，》1.47(95%CI:1.05-2.06,P=0.024)。而且，82Gly/Ser杂合子增加了41%的胃癌风险(校正OR值:1.41;95%CI:1.00-1.99),82Ser/Ser纯合子增加了150°/。的胃癌风险(校正OR值2.50;95%CI:1.01-6.17)。在此研究中，我们也分析了iL4Gi;变异基因型与胃癌病人临床病理学特征的相互关系。我们发现变异基因型和肿瘤浸润(T4)相关(校正OR值3.20;95%CI:1.40-7.29)。通过上述研究，可以确定WG五基因突变Gly82Ser与胃癌的发生关系密切，若检测i^G五基因发生突变，则可确定被检测人属于胃癌危险人群。WG5Gly82Ser基因突变试剂盒完全可以用于对胃癌危险人群进行检测筛査中。有益效果本发明开拓了突变体Gly82Ser在制备胃癌危险人群检测筛査试剂中的应用价值，通过检测位于WM基因外显子3的突变(Gly82Ser),以引起受检者和临床医生的高度警惕。图1是代表性的82Gly/Gly,82Gly/Ser和82Ser/Ser的基因型PCR图。PCR产物用^wl限制性内切酶消化，然后在2%琼脂糖凝胶电泳分析。M:DL2000marker;泳道1，3和5:82Gly/Gly纯合子；泳道2,7and8:82Gly/Ser杂合子；泳道4和6:82Ser/Ser纯合子。具体实施方式以下具体说明本发明。1、材料和方法(1)受试者'这是一个病例-对照研究，包括了283位胃癌病人和283位无癌对照者。研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准。病例是新近从组织学上诊断为胃癌的入院病人，连续从南京医科大学附属医院招募得来。那些有继发的、再生的肿瘤病例被除外。对照者为同时期的入院病人，没有任何癌症和遗传病史。他们年龄(5岁内)和性别匹配。所有受试者是无亲戚关系的汉族人。年龄、性别、吸烟情况、居住地、体重和个人医疗史的信息通过调査表收集得来[4-6]。以前或最近平均每天吸烟dO支被定义为吸烟者。所有的胃癌根据国际抗癌联合会(UICC)TNM分类标准分类[19]。(2)iL4G五基因型检测iL4G五Gly82Ser基因突变试剂盒包括一对引物(正义5'-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3',反义5'-GGCCAAGGCTGGGGTTGAAGG-3')，7^酶，PCRbuffer,MgCl2，dNTPs，限制性内切酶^/wI，琼脂糖。采集受试者外周静脉血3ml，EDTA-K2抗凝，用经典酚-氯仿法抽提基因组DNA[4]。用PCR-RFLP方法测定WG五Gly82Ser变异。PCR在20^1反应混合物中进行，包括1.625mMMgCl2,0.14mMdNTPs，1U&《酶(MBIFermentas，Vilnius,Lhhuania)，2^10xPCRbuffer(MBIFermentas)，200ng基因组DNA和0.25的引物(正义5'-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3',反义5'-GGCCAAGGCTGGGGTTGAAGG-3')。最初95。C变性5分钟之后，94。C30秒，62。C40秒，72。C45秒，共35个循环扩增DNA，最后72°C10分钟延伸。得到的397bp的PCR产物被限制性内切酶j/wI(NewEnglandBioLabs,Waltham,MA，USA)5个单位在37°C消化16小时，紧接着2%琼脂糖凝胶电泳。对临床资料未知的两位研究者单独检测基因型以互相验证。随机选择大约10%的样本做重复测验，结果100%—致。(3)统计学方法用StataVersion8.0(STATACorporation,CollegeStation,TX)进行所有的统计分析。所有的检验都是双侧的，尸<0.05被定义为有统计学意义。不符合正态分布的数值变量，用中位数表示，且用Mann-Whitney秩和检验分析。用Pearson/检验来分析分类变量分布的差别。用拟合优度检验评估WG五基因型的Hardy-Weinberg平衡。变异与胃癌风险的相关性用OR值和95%可信区间来表示。野生基因型82Gly/Gly携带者为参照组。粗的OR值通过Woolf近似法计算得到，校正的OR值通过非限制性logistic回归来校正年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病等情况。2、结果(1)WG五基因型检测PCR产物用Awl限制性内切酶消化，然后在2%琼脂糖凝胶电泳分析，有249bp，123bp和26bp三个片段的为82Gly/Gly纯合子，有249bp，181bp，123bp，67bp和26bp五个片段的为82Gly/Ser杂合子，有181bp,123bp，67bp和26bp四个片段的为82Ser/Ser纯合子，结果见图1。(2)胃癌病例和对照组基本情况胃癌病例和对照组的基本情况见表l。胃癌病例和对照的性别和年龄(5岁以内)匹配良好。两组的吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病史相似。胃贲门癌和非贲门癌病人分别为83和200。绝大多数病例为腺癌(97.88%)。在275位可获取临床病理资料的胃癌病例中，48，31，133和63个分别为T1，T2，T3，和T4;38，129和108个分别为高，中，低分化。177个病例为淋巴结转移阳性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>中位数(25th-75thpercentiles)(3)胃癌病例和对照组基因型分布和风险评估基因型分布和胃癌风险评估见表2。病例和对照的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律。病例和对照组的基因型频率有统计学差别(Pearson/=6.552，P=0.038)。而且，病例组Ser82等位基因频率较对照组高(Pearson/=5.855，尸=0.016)。用82Gly/Gly基因型作为参照，变异基因型(82Gly/Ser和82Ser/Ser)的OR值，在校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病后，为1.47(95%CI:1.05-2.06，P=0.024)。而且，82Gly/Ser杂合子增加了41%的胃癌风险(校正OR值1.41;95%CI:1.00-1.99)，82Ser/Ser纯合子增加了150%的风险(校正OR值:2.50;95%CI:1.01-6.17)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>'基因型分布符合Hardy—Weinberg平衡定律，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>.f校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病.fGG:82Gly/Gly;GS:82Gly/Ser;SS:82Ser/Ser.(4)变异的iL4G五基因型和胃癌病人的临床病理学特征的关系在此研究中，我们也分析了i^G五变异基因型与胃癌病人临床病理学特征的相互关系见表3。我们发现变异基因型和肿瘤浸润(T4)相关(校正OR值3.20;95%CI:1.40-7.29)。表3GSt+SS卞GGf粗OR户校正OR*户肿瘤浸润程度(95%CI)(95%CI)Tl183011T214171.37(0.50-3.79)0.4981.45(0.54-3.89)0.465T364691.55(0.75-3.24)0.2051.63(0.81-3.30)0.171T440232.卯(1.24-6.80)0.0073.20(1.40-7.29)0.006i校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病.TGG:82Gly/Gly;GS:82Gly/Ser;SS:82Ser/Ser.参考文献1.ParkinDM.Internationalvariation.Oncogene2004;23:6329-40.2.CorreaP.Humangastriccarcinogenesis:amultistepandmultifactorialprocess—FirstAmericanCancerSocietyAwardLectureonCancerEpidemiologyandPrevention.CancerRes1992;52:673540.3.WuMS,ChenCJ,LinJT.Host-environmentinteractions:theirimpactonprogressionfromgastricinflammationtocarcinogenesisandondevelopmentofnewapproachestopreventandtreatgastriccancer.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2005;14:1878-82.4.ZhuHJ，YangL,ZhouB,YuRB,TangNP,WangB.MyeloperoxidaseG-463Apolymorphismandtheriskofgastriccancer:acase-controlstudy.Carcinogenesis2006;27:2491-6.5.GuHJ，YangL,TangNP,etal.Associationofendothelin-convertingenzyme-lbC-338Apolymorphismwithgastriccancerrisk:Acase-controlstudy.EurJCancer2008Inpress;doi:10.1016/j.ejca.2007.09.013.6.YangL,GuHJ,ZhuHJ,etal.Tissueinhibitorofmetalloproteinase-2G-418CpolymorphismisassociatedwithanincreasedriskofgastriccancerinaChinesepopulation.EurJSurgOncol2008Inpress;doi:10.1016/j.ejso.2007.09.003.7.NeeperM,SchmidtAM，BrettJ，etal.CloningandexpressionofRAGE:acellsurfacereceptorforadvancedglyeosylationendproductsofproteins.JBiolChem1992;267:14998—50048.GeroldiD,FalconeC,EmanueleE.Solublereceptorforadvancedglycationendproducts:fromdiseasemarkertopotentialtherapeutictarget.CurrMedChem2006;13:1971-8.9.SternDM,YanSD，YanSF,SchmidtAM.Receptorforadvancedglycationendproducts(RAGE)andthecompl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