专利名称：具有生产1，4-丁二醇能力的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种能够生产l，4-丁二醇的突变体微生物，以及使用该突变体微生 物制备1，4_ 丁二醇的方法。
背景技术：
可生物降解的聚合物已经被建议作为合成聚合物的替代品，合成聚合物是严重环 境污染的重要原因之一。在目前正在开发的各种可生物降解的聚合物中，聚羟基丁酸 酯(poly-ii-hydroxybutyrate)是各种微生物在营养不平衡状态下储存的一种可生物降 解的聚合物，其具有优良的特性，如生物可降解性、水抗性、压电性和生物相容性。尤其是 4_羟基丁酸酯，其是聚羟基链烷酸酯(PHA)的一个例子，具有聚酯样特性，并显示从结晶塑 料到高弹性橡胶的特性的许多特性。因此，目前正在对微生物可生物降解的塑料进行大量 研究。此外，4-羟基丁酸酯可以很容易被转变成具有4个碳原子的各种化学制品，如1， 4_ 丁二醇、Y-丁内酯(GBL)和THF。尤其是，1，4_ 丁二醇是一种以如聚合物、溶剂和精细 化学制品中间体多种形式存在的重要的工业化学制品。虽然具有4个碳原子的大多数化学 制品目前是从1，4_ 丁二醇、马来酐等等合成的，但是由于油价格的增加而导致的增加的生 产成本，需要开发用于补偿和替代常规的化学生产方法的另一种方法。生物学方法已经被 建议作为这种替代方法。同时，琥珀酸(succinate)，具有4个碳原子的二羧酸，是在厌氧条件下培养微生 物时产生的一种有机酸。现在，多种微生物被用作生产琥珀酸的细胞，而且由于有效的发酵 方法以及分离和纯化方法的发展，它的生产成本变得更低。还可以由琥珀酸生产4-羟基丁 酸酯，而且具有4个碳原子的各种有机酸可以源自4-羟基丁酸酯。PCT公开第WO 2005/052135号是公开了一种有效生产琥珀酸的方法的专利申 请的一个例子，其中，腔细菌(Lumen bacterial)突变体在不产生其他有机酸的情况下 生产高浓度的琥珀酸，和一种使用该突变体制备琥珀酸的方法。另外，韩国专利申请第 10-2004-60149中公开了一种制备能够生产高浓度的琥珀酸的大肠杆菌突变体的方法，并 且韩国专利申请第 10-2005-0076301 号、第 10-2005-0076317 号和第 10-2005-0076348 号 中公开了一种使用新基因制备琥珀酸的方法。如上面所解释的，迫切需要一种能够生产1，4_ 丁二醇的突变体和使用该突变体 制备1，4- 丁二醇的生物学方法，1，4- 丁二醇是一种具有4个碳原子的工业上重要的化学制品。
发明内容
技术问题本发明旨在提供一种能够高效生产1，4_ 丁二醇的突变体微生物，以及使用该突变体微生物制备1，4_ 丁二醇的方法。技术方案一个方面，提供了一种能够生产琥珀酸的微生物和使用该微生物制备1，4_ 丁二 醇的方法，所述微生物优选为显示出高1，4_ 丁二醇产量的突变体，其中，引入或增强编码 把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因和编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4- 丁二醇的 酶的基因。另一个方面，提供了 SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9的丁基-辅酶A脱氢酶基因和 具有该基因的重组载体，该基因将4-羟基丁基-辅酶A有效生产为1，4- 丁二醇。在下文中，将更详细地描述本发明。作为使用能够生产琥珀酸的微生物制备1，4_ 丁二醇的努力的结果，本发明人通 过在能够生产琥珀酸的微生物中诱导或增强与4-羟基丁酸酯生物合成相关的基因和/或 与1，4_ 丁二醇生物合成相关的基因，开发了一种生产1，4_ 丁二醇的突变体微生物，并发 现，该突变体微生物有效生产1，4_ 丁二醇。该发现导致了本发明。这里使用的术语“增强”指与原始表达水平相比基因表达水平的增加。如果在突 变之前微生物中没有待增强的基因，那么可以向该微生物中引入至少一个基因，然后增强。 并且，如果在突变之前在微生物中有待增强的基因，可以通过如上所述的相同的方法向该 微生物中引入至少一个基因，或者可以通过遗传工程技术对原来存在于微生物中的基因进 行操作以增加基因表达。例如，当增强表达的基因存在于待突变的微生物中时，可以用更强 的启动子代替用于操纵基因表达的原始启动子，从而增强基因表达。能够生产琥珀酸的微生物可显示出高琥珀酸产量，该微生物优选为选自细 菌、酵母和真菌中的一种，更特别地为细菌，例如，腔细菌(Lumen bacteria)、棒状杆菌 (Corynebacterium species)、短杆菌(Brevibacterium species)和大肠杆菌(E. coli)。所述腔细菌可具有失活的编码乳酸脱氢酶(IdhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl) 的基因，并在厌氧条件下在不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。这里使用的术语“失活”指由于突变基因没有被转录，或者转录的mRNA没有适当 地被翻译成原始蛋白质。为了使基因失去活性，可通过丢失基因或改变基因的核酸序列来 进行突变。此外，所述腔细菌可具有失活的编码乳酸脱氢酶(IdhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶 (pfl)、磷酸转乙酰酶(Pta)和乙酸激酶(ackA)的基因，并在厌氧条件下在基本上不生产其 他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。做为选择，所述腔细菌可具有失活的编码乳酸脱氢酶(IdhA)、丙酮酸_甲酸裂解 酶(pfl)和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸 的情况下高浓度生产琥珀酸。所述腔细菌可选自Mannheimia sp、放线杆菌(Actinobacillus sp.)和厌氧螺菌 (Anaerobiospirillum sp.)，但是本发明不局限于这些例子。Mannheimia sp.是优选的， M5.Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)等Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP)、LPK4 和 LPK7 (KCTC 10626BP)是更优选的。所述大肠杆菌可具有失活的编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)和丙酮酸激酶(pykA 和pykF)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。特别地，大肠杆菌突变体优选是在韩国专利公开第10-2006-0011345号中公开的 W3110GFA。在上述高浓度生产琥珀酸的微生物中，可以以PCT公开第WO 2005/052135号中公 开的方法制备腔细菌。也就是说，使Mannheimia succiniciproducens 55E中的乳酸脱氢 酶基因(IdhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶基因(pfl)失活，从而构建突变株，也即Marmheimnia sp.LPK(KCTC 10558BP)。然后，在LPK株中，使磷酸转乙酰酶基因(pta)和乙酸激酶基因 (ackA)的基因和磷酸丙酮酸羧化酶的基因(ppc)分别失活，从而构建突变株(Marmheimia sp. LPK7和LPK4)，然后在厌氧条件下进行培养以高产量生产琥珀酸。另外，在高浓度生产琥珀酸的微生物中，通过韩国专利公开第10-2006-0011345 号中公开的方法构建大肠杆菌。也就是说，通过在用表达噬菌体red操纵子(exo-ii-gam) 的重组表达载体转化的W3110菌株中，使编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)的基因和编码丙酮 酸激酶(pykA和pykF)的两个基因失活，来产生突变体大肠杆菌菌株W3110GFA。然后，当在 厌氧条件下培养突变体大肠杆菌菌株W3110GFA时，可以证实突变体的生产率大于母本菌 株W3110的生产率。把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因和与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关 的酶的基因可以来源于科氏梭菌(Clostridium kluyveri)，而把4-羟基丁酸酯转变成1， 4_ 丁二醇的酶的基因可来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。虽然科氏 梭菌和丙酮丁醇梭菌不生产4-羟基丁酸酯和1，4_ 丁二醇，但是在这些菌株中克隆的酶在 生产4-羟基丁酸酯和1，4_ 丁二醇中发挥重要作用。另外，把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶的基因可选自编码琥珀酰辅酶A转移酶 (Catl)的基因、编码琥珀酸半醛脱氢酶(SucD)的基因、编码4-羟基丁酸脱氢酶(hbD)的基 因、编码4-羟基丁酸脱氢酶(GHB)的基因。优选地，编码Catl的基因具有SEQID NO :1的 碱基序列，编码SucD的基因具有SEQ ID NO :2的碱基序列，编码4hbD的基因具有SEQ ID NO 3的碱基序列，以及编码GHB的基因具有SEQ ID NO 4的碱基序列。例如，根据本发明的突变体微生物可以具有编码Catl的基因、编码SucD的基因和 编码4hbD的基因，或者编码Catl的基因、编码SucD的基因和编码GHB的基因，但是本发明 不局限于这些例子。此外，琥珀酸的有效使用对实现本发明的目标是非常重要的，因此可以从高浓度 生产琥珀酸的微生物重组大肠杆菌中除去与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关的琥珀酸半 醛脱氢酶(GabD)。因此，根据本发明的突变体微生物也可具有失活的与把琥珀酸半醛转变 成琥珀酸相关的基因，其优选是编码琥珀酸GabD的基因。编码GabD的基因具有SEQ ID NO 10的碱基序列，但是本发明不局限于该序列。同时，为了在微生物中有效转运琥珀酸，可以增强与琥珀酸的转运相关的C4-二 羧酸转运蛋白(DctA)酶。因此，突变体微生物可另外具有编码与琥珀酸的转运相关的Dct4 的基因，其被引入到突变体微生物中或被增强，而且编码Dct4的基因优选具有SEQ ID N0 11的碱基序列。所述把4-羟基丁酸酯转变成1，4- 丁二醇的酶的基因可以是编码4-羟基丁酸-辅 酶A转移酶和使4-羟基丁酸-辅酶A还原的醇脱氢酶的基因，或者编码磷酸转丁酰酶、丁 酰激酶和使4-羟基丁酸-辅酶A还原的醇脱氢酶的基因。
所述编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因可以具有SEQ ID NO 5的碱基序列， 其可以用磷酸转丁酰酶(ptb ;SEQ ID NO 6)和丁酰激酶(BuK ；SEQ ID NO :7)取代，以把 4-羟基丁酸酯转变成4-羟基丁酸-辅酶A。所述醇脱氢酶可以是来源于丙酮丁醇梭菌的丁基-辅酶A脱氢酶，而且编码丁 基-辅酶A脱氢酶的基因优选具有SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9的碱基序列(CAP0035或 CAPO162) ο SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9的基因对于在根据本发明的突变体微生物中生产 1，4-丁二醇是非常有用的。因此，本发明提供了一种编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因和含 有该基因的重组载体。术语“载体”指含有与适于在合适的宿主中表达DNA的调控序列可操作连接的DNA 序列的DNA构建体。在本发明中，载体可包括质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、酵母人工染 色体(YAC)载体，而且优选质粒载体。例如，质粒载体可以具有这样的结构，其包括(a)用 于有效复制以在一个宿主细胞中具有几百个拷贝的复制起点，(b)用于筛选用该质粒载体 转化了的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)其中能够插入外源DNA片段的限制性内切酶 位点。即使没有适合的限制性内切酶位点，可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸适体或 接头，很容易地连接载体与外源DNA。因此，本发明提供了一种能够生产琥珀酸的微生物，且优选显示高1，4_ 丁二醇产 量的突变体微生物，其中，使编码GabD的基因失活，而且引入或增强编码Catl的基因、编码 SucD的基因、编码4hbD (或GHB)的基因、编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因和编码丁 基辅酶A脱氢酶的基因的全部。此外，本发明提供了一种能够生产琥珀酸的微生物，且优选显示高1，4_ 丁二醇产 量的突变体微生物，其中，引入或增强编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因(或编码磷 酸转丁酰酶的基因和编码丁酰激酶的基因)和编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因，以及使用 该微生物制备1，4_ 丁二醇的方法。本发明进一步提供了一种制备1，4_ 丁二醇的方法，其包括在含有碳源的培养基 中培养该突变体，并从所述培养物中获得1，4_ 丁二醇。有益效果如上面详细描述的，本发明提供了一种能够高浓度生产琥珀酸的微生物，且更优 选地，一种显示高1，4_ 丁二醇产量的突变体以及使用该微生物制备1，4_ 丁二醇的生物学 方法，1，4_ 丁二醇是一种具有4个碳原子的化学制品，其在化学工业中具有广泛的重要应 用。
图1是由琥珀酸生产4-羟基丁酸酯的途径的示意图；图2是通过由琥珀酸产生的4-羟基丁酸酯生产1，4_ 丁二醇的途径的示意图；和图3显示了 1，4- 丁二醇产物的GC分析结果。
具体实施例方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。本领域技术人员将清楚理解，提供 实施例只是为了解释本发明，而不是为了限制它的范围。
同时，在本发明中，制备1，4_丁二醇的方法使用腔细菌(如突变体Marmheimiasp. LPK(KCTC 10558BP)、LPK7和LPK4，其具有来源于Mannheimia sp.菌株的失活基因并高 浓度生产琥珀酸)、大肠杆菌和突变体大肠杆菌W3110GFA，本领域技术人员将清楚理解，可 以使用另一种腔细菌菌株，通过产生高浓度生产琥珀酸的突变体，并引入和增强与生产1， 4_ 丁二醇相关的基因来生产1，4_ 丁二醇。另外，下面的实施例提供了具体的培养基和培养方法，本领域技术人员将清楚 地理解，如文献(Lee 等人，Bioprocess Biosyst. Eng.，26 :63，2003 ；Lee 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol, 58 663,2002 ；Lee 等人，Biotechnol. Lett, 25 111,2003 ；Lee 等 人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :23，2000 ；以及 Lee 等人，Biotechnol. Bioeng.，72 41,2001)中所公开的，这里使用的培养基可以不同于水解物(如乳清或玉米浆)，或者可以 使用不同的培养方法(如加料分批培养和连续培养)。棚列1 吿卿荒屮■物白妨法1-1.具有高琥珀酸产量的腔细菌的制备通过PCT公开第WO 2005/052135号中公开的方法制备根据本发明的微生物，腔细 菌，其显示出高琥拍酸产量。也就是说，通过使Mannheimia succiniciproducens55E ( — 种腔细菌)中的乳酸脱氢酶(IdhA)的基因和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)的基因失活来 制备突变株Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP)，并通过使LPK菌株中的磷酸转乙酰酶 (Pta)的基因、乙酸激酶(ackA)的基因和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因失活制备突变株 (Mannheimia sp. LPK7 和 LPK4)。1-2.显示出高琥珀酸产量的大肠杆菌的制备通过韩国专利公开第10-2006-0011345号中公开的方法制备根据本发明的微生 物，大肠杆菌，其显出示高琥珀酸产量。就是说，通过使W3110菌株中编码葡萄糖磷酸转移 酶(PtsG)的基因和编码丙酮酸激酶(pykA和pykF)的两个基因失活，来产生突变体大肠 杆菌菌株W3110GFA，W3110菌株用表达噬菌体red操纵子(exo-i^-gam)的重组表达载体 pTrcEBG 转化。实施例2 :1，4_ 丁二醇转变酶的克隆2-1.编码4-羟基丁酸酯转变酶(Catl、SucD和4hbD)的基因的克隆本发明人使用基于已知的基因序列(L21902)合成的寡核苷酸引物，通过聚合酶 链式反应(PCR)，扩增了 catl、sucD和4hbD基因，以便克隆编码来源于科氏梭菌DSM 555的 CatUSucD和4hbD的基因的操纵子。用于PCR的引物如下。SEQ ID NO 12 CatIf-SacI5' -tttcccgagctc TGTGAGGCGATTAAATGAGTAAAGGGATAAAGSEQ ID NO 13 :4hbDb_XabIgc tctaga tta gat aaa aaa gag gac att tea caa tat gg为了构建表达载体pTacLacfflBl，将扩增的catLsucD和4hbD基因的操纵子插入 到表达载体PTacLacI中，其用Sacl/Xbal切割。通过用SspI切割载体pTac99A(Parkand Lee, J Bacteriol. 185，5391-5397，2003)，并连接该切割的载体与也用SspI切割的 pTrc991 (Amersham Pharmacia Biotech) H勾Iii^y[本 pTacLacI。
本 pTacLacI Jl*% pTrc99A相同的序列，而且丢失了存在于pTrc99A中的来自多克隆位点(MCS)的NcoI限性
8内切酶识别位点(限制性位点)。此时，MCS从EcoRI位点开始。2-2.编码与琥珀酸转运相关的DctA的基因的克隆为了克隆大肠杆菌W3110中编码与琥珀酸转运相关的DctA的基因，使用基于已知 的基因序列(NC_000913)合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增DctA基因。用于PCR的 引物如下。SEQ ID NO 14=DctAf-EcoRIggaattc ATGAAAACCTCTCTGTTTAAAAGCSEQ ID NO 15 =DctAb-XbaIgc tctaga tta aga gga taa ttc gtg cgt ttt gcc为了构建表达载体ρ 10499DctA，用EcoRI/Xbal切割扩增的DctA基因，然后插入 到表达载体 pl0499A(Park 等人.(2002)FEMS Microbiol. Lett 214:217-222)中。2-3.编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4_ 丁二醇的酶的基因的克隆为了克隆SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9的编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因，丁 基-辅酶A脱氢酶是丙酮丁醇梭菌中把丁酸转变成丁醇的酶，使用基于已知的基因序列 (NC_003030)合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增cap0035和cap0162基因。用于PCR 的引物如下。SEQ ID NO 16 :CAP0035f_SacItttcccgagctc atgaaagttacaaatcaaaaaSEQ ID NO 17 :CAP0035b_XbaIgc tctaga tta aaa tgc ttt tat ata gatSEQ ID NO :18 :CAP0162f-EcoRIGGAATT C atgaaagtcacaacagtaaagSEQ ID NO : 19 :CAP0162b_XbaIgc tctaga tta agg ttg ttt ttt aaa为了构建表达载体 pTacLacCAP35 和 pTacLacCAP 162，将扩增的 cap0035 和 cap0162基因独立地插入到表达载体pTacLacI中，该表达载体用Sacl/Xbal和EcoRI/Xbal 切割。为了把4-羟基丁酸酯转变成4-羟基丁酸-辅酶A，使用基于SEQ ID NO :5的序 列合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增SEQ ID NO :5的Cat2基因的操纵子。用于PCR 的引物如下。SEQ ID NO 20 :cat2f_EcoRIggaattc ATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGSEQ ID NO 21 :cat2b_BamHIeg ggatcc tta tct Ctt ttt ttc att cat taa tg为了构建表达载体PTacLacCat2，把扩增的cat2基因插入到表达载体pTacLacI 中，其用EcoRI/BamHI切割。为了把4-羟基丁酸酯转变成4-羟基丁酸-辅酶A，使用基于SEQ ID NO :6和SEQID NO 7的序列合成的寡核苷酸引物，通过DNA-PCR扩增SEQ ID NO 6和SEQ IDNO 7的ptb 和buk基因的操纵子。用于PCR的引物如下。
SEQ ID NO 22 :ptbf-RcoRIggaattc ATGATTAAGAGTTTTAATGAAATATCATGSEQ ID NO 23 :bukb_XbaIgc tctaga tta ttt gta ttc ctt age ttt ttc ttc tcc为了构建表达载体，把扩增的ptb和buk基因的操纵子插入到表达载体pTacLacI 中，其用 EcoRI/Xbal 切割，从而获得 pTacLacPtbBuk。用 SspI 切割载体 pTacLacPtbBuk, 以获得包括tac启动子、ptb和buk基因和转录终止子的基因片段，并把该基因片段插入 到载体PBBR1MCS2 (Kovach等人，Gene. 166 175，1995)中，其用EcoRV切割，从而获得载体 pMCS2TacPtbBuk。实施例3 :1,4-BD0的产牛载体pTacCAP162和pMCS2Tacptbbuk用大肠杆菌XLl-Blue通过电穿孔同时转化， 然后铺板于含有ΙΟΟμ g/ml氨苄青霉素和50μ g/ml醌那霉素的LB平板上，并于37°C培 养过夜。把培养的克隆接种到具有3ml LB液体培养基(包含100 μ g/ml氨苄青霉素)的 15ml管(FalCOn，USA)中，并以200rpm于37°C在振动孵育箱中生长过夜。将孵育的细胞接 种到新鲜的LB液体培养基(含有IOOml 2%葡萄糖和100 μ g/ml氨苄青霉素)中，然后以 200rpm于37°C生长于振动孵育箱中。当OD6tltl达到0. 7时，以ImM的终浓度添加IPTG来诱 导蛋白表达，并且将细胞培养过夜。然后，离心培养物，并从其中除去上清液。然后，将细胞沉淀用MR培养基洗涤一 次，重悬于包含50ml 2%葡萄糖和2% Y-羟基丁内酯和ImM IPTG的MR培养基中，并使用 5% H2,5% CO2和余量N2的气体混合物起绒毛30分钟以建立厌氧条件。培养物以200rpm 于37°C在振动孵育箱中生长过夜，并持续大约3天，然后离心培养物以获得上清液。获得的 上清液浓缩两次，并用作GC分析样品用于分析，以证实1，4_ 丁二醇的产生。在下列条件下 进行分析，且结果示于图3中。柱AT-Waw(0.53mm ID χ 15ml, 1. 2um u. f.毛细管)气体流速柱(He)4. Oml/min烘箱温度初始值&时间50°C，5min编程速率10°C/min终值& 时间250°C，5min喷射器温度250°C检测器温度250°C喷射器分流比20/1喷射器体积1·0μ1如图3所示，证实产生了 1，4-丁二醇。虽然已经参考其某些实施例显示和描述了本发明，本领域技术人员将理解，可以 多种形式和细节对其进行各种改变，而不背离如所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。
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权利要求
一种显示高1，4-丁二醇产量的突变体，其通过在能够生产琥珀酸的微生物中引入或增强编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯和把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因来制备。
2.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述能够生产琥珀酸的微生物选自显示出高 琥珀酸产量的细菌、酵母和真菌中。
3.根据权利要求2所述的突变体，其中，所述细菌选自腔细菌、棒状杆菌、短杆菌和大 肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌具有失活的编码乳酸脱氢酶 (IdhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸 的情况下高浓度生产琥珀酸。
5.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌具有失活的编码乳酸脱氢酶 (IdhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)、磷酸转乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ackA)的基因，并在 厌氧条件下在基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。
6.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌具有失活的编码乳酸脱氢酶 (IdhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因，并在厌氧条件下在 基本上不产生其他有机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。
7.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述腔细菌选自Marmheimiaspecies、放线杆 菌和厌氧螺菌。
8.根据权利要求7所述的突变体，其中，所述腔细菌是Marmheimiaspecies.
9.根据权利要求8所述的突变体，其中，所述腔细菌选自 Mannheimiasucciniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)禾口 Mannheimia species LPK (KCTC10558BP)、LPK4 和 LPK7 (KCTC 10626BP)中。
10.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述大肠杆菌具有失活的编码葡萄糖磷酸转 移酶(ptsG)和丙酮酸激酶(pykA和pykF)的基因，并在厌氧条件下在基本上不产生其他有 机酸的情况下高浓度生产琥珀酸。
11.根据权利要求10所述的突变体，其中，所述大肠杆菌突变体是W3110GFA。
12.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶 的基因来源于科氏梭菌。
13.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯的酶 的基因选自编码琥珀酰辅酶A转移酶(Catl)、琥珀酸半醛脱氢酶(SucD)、4_羟基丁酸脱氢 酶(4hbD)和4-羟基丁酸脱氢酶(GHB)的基因中。
14.根据权利要求13所述的突变体，其中，所述编码Catl的基因具有SEQIDNO :1的 碱基序列，所述编码SucD的基因具有SEQ ID NO 2的碱基序列，所述编码4hbD的基因具有 SEQ ID NO 3的碱基序列，以及所述编码GHB的基因具有SEQID NO 4的碱基序列。
15.根据权利要求13所述的突变体，其中，所述突变体包含编码Catl的基因；编码 SucD的基因；和编码4hbD的基因或编码GHB的基因。
16.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4_丁二 醇的酶的基因来源于丙酮丁醇梭菌。
17.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述编码把4-羟基丁酸酯转变成1，4_丁二醇的酶的基因是编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基因和编码使4-羟基丁酸-辅酶A还 原的醇脱氢酶的基因；或者编码磷酸转丁酰酶的基因、编码丁酰激酶的基因和编码使4-羟 基丁酸-辅酶A还原的醇脱氢酶的基因。
18.根据权利要求17所述的突变体，其中，所述编码4-羟基丁酸-辅酶A转移酶的基 因具有SEQ ID NO 5的碱基序列。
19.根据权利要求17所述的突变体，其中，所述编码磷酸转丁酰酶的基因和编码丁酰 激酶的基因分别具有SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的碱基序列。
20.根据权利要求17所述的突变体，其中，所述醇脱氢酶是来源于丙酮丁醇梭菌的丁 基-辅酶A脱氢酶。
21.根据权利要求20所述的突变体，其中，所述编码丁基-辅酶A脱氢酶的基因具有 SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 的碱基序列。
22.根据权利要求1所述的突变体，其中，该突变体具有失活的与把琥珀酸半醛转变成 琥珀酸相关的基因。
23.根据权利要求22所述的突变体，其中，所述与把琥珀酸半醛转变成琥珀酸相关的 基因是编码琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)的基因。
24.根据权利要求23所述的突变体，其中，所述编码GabD的基因具有SEQIDNO 10的 碱基序列。
25.根据权利要求1所述的突变体，其中，在所述突变体中另外引入或增强编码与琥珀 酸转运相关的C4-二羧酸转运蛋白(DctA)的基因。
26.根据权利要求25所述的突变体，其中，所述编码DctA的基因具有SEQIDNO :11的 大碱基序列。
27.—种显示高1，4_ 丁二醇产量的突变体，其通过在能够生产琥珀酸的微生物中引入 或增强编码Catl的基因；编码SucD的基因；编码4hbD或GHB的基因；编码4-羟基丁酸-辅 酶A转移酶的基因或编码Ptb的基因和编码Buk的基因；和编码丁基-辅酶A脱氢酶的基 因而制备。
28.根据权利要求27所述的突变体，其中，在所述突变体中使编码GabD的基因失活。
29.根据权利要求27所述的突变体，其中，在所述突变体中引入或增强编码与琥珀酸 转运相关的DctA的基因。
30.一种制备1，4_ 丁二醇的方法，包括在含有碳源的培养基中培养根据权利要求1到29中任一项所述的突变体；和从所述培养基中收获1，4_ 丁二醇。
31.一种具有SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9的碱基序列的丁基-辅酶A脱氢酶基因。
32.一种包含根据权利要求31所述的基因的重组载体。
全文摘要
本发明提供一种能够生产1，4-丁二醇的突变体和使用该突变体制备1，4-丁二醇的方法。通过在能够生产琥珀酸的微生物中引入和增强编码把琥珀酸转变成4-羟基丁酸酯和把4-羟基丁酸酯转变成1，4-丁二醇的酶的基因来制备该突变体微生物。该方法包括在含有碳水化合物的培养基中培养该突变体，并由培养物获得1，4-丁二醇。因此，可以生物学方法制备化学工业中必需的1，4-丁二醇。
文档编号C12N15/10GK101883853SQ200880105984
公开日2010年11月10日 申请日期2008年8月13日 优先权日2007年9月7日
发明者朴时载, 李恩政, 李相烨, 李相贤 申请人:Lg化学株式会社;韩国科学技术院