专利名称：人类基因短串联重复序列分型标准物的分子克隆制备方法
技术领域：
本发明属于重组DNA应用技术。具体地讲，本发明涉及一种利用重组质粒制备人类DNA短串联重复序列基因座(short tandem repeat，简称STR)的等位基因分型标准物的方法，它可以解决STR在分型上长期存在的准确性和标准化问题。
人类DNA短串联重复序列(STR)广泛存在于人类基因组中，每6-10 Kb碱基就有一个，由其核心序列由2-6bp构成，其在个体间重复次数的差异形成丰富的片段长度多态性。这种片段长度的大小按孟德尔遗传规律遗传。STR基因座的等位基因片段小，特异性高，极易通过聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，简称PCR)扩增，电泳分型；在人类基因组中包含丰富的遗传信息，是新一代DNA指纹中最重要的内容，自90年代初开始，已经被广泛地应用于遗传学，临床医学，生物学，以及法科学中的个人识别、亲子鉴定等领域中。但在这十多年的研究和应用过程中，学者们也注意到唯有实行DNA分析的质量控制和质量保证，建立标准化的DNA分析技术，才能确保法医DNA检测分析结果的准确性、公正性和可靠性。问题的关键在于STR基因座的等位基因统一标准命名和分型问题，即对同一个STR基因座的检测能够在同一等位基因分型标准物(英文称为Ladder，以下统称为Ladder)的参照下进行检测，按照同一原则命名，使不同实验室之间，同一实验室在不同时间获得的实验结果之间能够准确比对。为此，学者们对于分型问题采取的方法有两个1．应用从国外进口而来的试剂盒，其中包括PCR扩增和电泳分型的全部试剂，也有与之配套的相应基因座Ladder。在一定程度上，其可解决标准问题，却同时存在如下严重不足(1)基因座被限定某个STR基因座的检测是由它特定的引物所确定的，也就是说，PCR反应体系中存在那个STR基因座引物就确定了那个基因座所在的DNA片段被扩增、放大。在进口试剂盒中，STR基因座引物是与其它试剂配套存在，这就限定了所能检测的STR基因座。尽管STR基因座在人群中均有较高的多态性，即较高个体识别能力(识别能力的高低由多态性的高低决定)。但同一STR基因座在不同的人种中，这种多态性有明显的差异。进口试剂盒能检测的多数STR基因座虽然在国外的一些群体中有较理想的多态性，但在中国人群中却不尽人意。对于试剂盒中的这些对不同个体不能进行有效区分的基因座，补救办法只有两个选择要么加做额外的基因座，要么用高识别能力的基因座代替它，随之而来的就是下面将要提到的1-(3)和2-(2)中的问题。
(2)浪费不可控制，试剂盒的特点是简便易行，但必须严格地按照它的说明书所规定的条件和步骤进行操作，对任何环节的改动和不慎操作会影响整个检验，甚至导致整个试验的失败。一方面，试剂盒一般将各种试剂进行整体包装，操作者无从应特殊要求对单个试剂进行调整，导致本可成功的试验得到失败的结果；另一方面，试剂盒一般是针对一些易于检测的样品而设计，其常常难以完成形形色色、保存条件不一样品的检测，对常常受一定程度腐败影响的法医学检材更是如此。所以，利用试剂盒检测会带来不可预料的、难以控制的浪费。
(3)检测成本昂贵目前使用的试剂盒大多为从国外进口而来，加之一次性使角的特性使得试剂盒检测成本高居不下，若再加上为补救1-(1)中所述的低识别能力基因座加做额外基因座，或1-(2)中所述的因单个问题导致全部试剂的浪费。可以想象，常规地使用进口试剂盒进行检测，将为实际工作带来一个巨大的经济压力。
2．针对进口试剂盒上述严重不足，国内学者采取了另外一个方案来完成STR的检测即PCR-聚丙烯凝胶电泳-银染整个检测过程中的试剂都由实验室根据需要单个订购，基因座Ladder实验室自己制备，或采用进口试剂盒中的相应基因座的Ladder。
(1)此方案的优点①可根据不同的需要选择基因座及其数量。尤其在检材有限，需选取在我国群体中识别能力较高的基因座时，这一点显得极其重要。
②完成同一个检测所消耗试剂的费用大幅度下降。可从进口试剂的每百人份三个基因座的4,000-5,000人民币下降每百人份三个基因座的1,000-2000人民币。
③可根据需要，对检测过程中的任一环节进行修改和优化，而不影响整个检测效率。如在对降解检材，受过污染的检材，轮奸案中的个人认定等情况下，能否对个别环节的适当调整常常决定着整个检测能否成功。
(2)此方案存在的问题这个方案的确解决了进口试剂盒所存在的基因座被限定、浪费不可控制和检测成本昂贵等问题，可是统一标准的问题并未得到解决①尽管自己订购其他试剂，同时使用试剂盒中提供的基因座Ladder来完成PCR及整个检测过程的方法既可以节约费用，又可以兼顾统一标准的问题，可遗憾的没有商家会单独提供STR-Ladder，它总是与其它试剂配套出售的，所以试剂盒中的Ladder是有限的。
②学者在不断地探索着新的STR基因座，也的确发现了不少的在我国群体分析中表现出较高识别能力的STR基因座，对这些基因座的检测，目前还没有商家提供其相应的试剂盒，当然更无从获得其商品化的Ladder。国内学者们采取的办法是自己构建这些基因座的Ladder。方法及问题如下③目前国内学者制备STR基因座Ladder方法是A、混合不同基因型的基因组DNA，直接以它们为模板，PCR扩增，产物作Ladder用。
B、混合不同基因型PCR产物，作一定的处理，如稀释、纯化等，以之为模板，再次PCR扩增，产物混合后作Ladder用。
C、回收凝胶中的等位基因片段，以之为模板，再次PCR扩增，产物混合后作Ladder用。
以上方法制备STR基因座Ladder的方法存在如下问题由于各实验室所遵循的命名方式不同，会出现同一基因座不同名称，同一基因座的同一等位基因不同名称的现象。这种没有按照国际统一标准原则进行命名的一个重要原因是小于150碱基(bp)的小片段的等位基因片段不能用现有的DNA测序方法完成其序列结构分析。而此原则要求按照核心序列的重复次数对等位基因片段命名。由此出现了多种没有经过测序并按国际统一标准进行命名的不同命名结果，这个给实验室间的结果比较带来麻烦。
这种自制的Ladder缺乏连续性，无论是以上述任何一种方式获得的Ladder，其包含的等位基因片段的PCR扩增获得，要么以不同基因型的基因组DNA为模板，要么以一些小片段的等位基因片段为模板。然而，从几个固定的个体那里获得基因组DNA是有限的，难以满足多个实验室长期的需要；小片段的等位基因不能长期保存，容易降解，失去模板作用，也不能维持多个实验室的长期需要。所以，用这些方法制备的Ladder会因为获得等位基因片段的PCR模板的变动而失去其连续性。
由于受模板来源和量以及PCR扩增效率的限制，应用这种方法能够获得的Ladder的不但量很有限，且缺乏连续性，难以满足多个实验室的长期需要，也不能解决标准化问题。
本发明的目的是提供一种利用分子克隆技术制备人类DNA短串联重复序列基因座(STR)的等位基因分型标准物的方法，它可以解决STR在分型上长期存在的准确性和标准性问题。
实现上述目的技术方案是，它包括下列步骤(1)用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得待克隆的人类DNA短串联重复序列基因座(STR)长度不同的各等位基因片段；(2)将上述PCR扩增的等位基因片段与质粒载体重组，将装载有STR等位基因片段的重组质粒再转染至感受态细菌中培养和繁殖，然后选出已含有插入片段正确的克隆；(3)DNA测序分析上述获得的重组质粒中的STR等位基因片段序列并按国际统一标准命名；(4)用经测序证实含有正确等位基因插入片段的重组质粒为模板，进行PCR扩增，其产物经纯化、混合后即获得相应STR等位基因分型标准物(即Ladder)。
上述第一步中获取待克隆的STR等位基因片段的工艺可以是①、将提取的群体DNA样本经CHELEX-100等方法处理，取得裸露的DNA分子；②、上述取得的DNA分子经PCR扩增和凝胶电泳检测，从凝胶中找到并回收STR基因座不同大小片段长度的等位基因片段，制备成PCR的再扩增模板；③、以上述STR等位基因片段为模板，再度进行PCR扩增放大，提高其不同大小片段长度的等位基因各自的拷贝数。
前述第二步中，PCR扩增的等位基因片段，可以通过T/A克隆法、平端插入法或粘性末端连接法实现与质粒载体重组。重组质粒转染至感受态细菌培养后，采用PCR方法选择出含有正确插入片段的克隆。
本发明的设计的制备STR的等位基因分型标准物(Ladder)的技术方案有如下优点和意义1．用分子克隆技术制备STR基因座等位基因分型标准(参照)物，相对目前应用较多的简单PCR扩增法来说，其特点是通过重组质粒保存STR基因座的等位基因，等位基因片段的重组质粒的建立实现了分型标准(参照)物永久的同一性。使得试验结果的比对不受时间和地域的限制。
2．用分子克隆技术制备的STR基因座等位基因分型标准参照物可以通过重组质粒永久保存。提纯的环状的质粒DNA具有高度的稳定性，在-20℃以下可长期保存；同时其可通过转染细菌，扩大培养进行繁殖，这种在细菌中的无性繁殖可保持其高度的连续性，最终实现Ladder的同一性。
3．装载有STR等位基因片段的重组质粒不但可以通过细菌进行大量繁殖，也可以以极少量的重组质粒为模板，通过PCR制备出大量的等位基因片段。因为重组质粒的DNA呈环状，所以加载在质粒上的等位基因在PCR扩增过程中以“滚爬”的方式进行复制，表现出极高的扩增效率，即在同样条件的PCR扩增过程，可以产生比普通DNA模板多出数倍的PCR产物。这些高浓度的PCR扩增获得的STR等位基因片段通过简单的纯化、混合便可获得大量优质的STR基因座的等位基因分型标准(参照)物。
4．小片段的等位基因片段被装载于质粒之上后，可以用质粒测序的公共引物完成对其序列结构的分析，免除小片段STR等位基因片段不能直接进行序列分析的缺憾。所以此法制备的STR基因座等位基因分型标准(参照)物中的等位基因片段均能够按照国际统一标准命名，适合于任何实验室的检测相应基因座的标准(参照)物。
5．本发明可建立装载有高识别能力STR基因座的等位基因的重组质粒库。这不但可以大大降低检测的成本费用，同时可大大提高检测的效率。一方面，不用为解决统一标准问题而采用试剂盒中的Ladder，但同时必须以高价购置商品试剂盒中其他本可单独低价订购的试剂；另一方面，有了具高识别能力的STR基因座及其相应的等位基因分型标准参照物，在一次检测中就达到个人识别目的的机会就因之上升，避免了加做额外基因座所产生的费用。
6．用本方法获得的STR基因座等位基因分型标准(参照)物代替商品试剂盒中的分型Ladder，可同时完全免除使用进口试剂盒以及其存在的重大不足，并充分体现由实验室根据需要单个订购检测试剂的全部优点。
7．用分子克隆技术方案获得的STR基因座等位基因分型标准(参照)物因具有永久的同一性，无限的可繁殖性，可大量的生产性又按照国际统一标准命名，所以其可以满足众多STR-DNA分析实验室对STR基因座Ladder的需要，可解决STR-DNA分型的标准化问题，且必将推进标准STR基因座检测的国产化，最终摆脱对国外一些试剂公司的完全依赖。
总之，用本方案制备STR基因座的等位基因分型标准参照物可推进标准STR基因座检测在我国法科学中应用的普及，它们为正确建立我国STR-DNA指纹数据库奠定了坚实的基础，将为保证法医DNA检测分析技术准确、公正和可靠地为案件的侦破提供线索、为法律审判提供证据发挥重要的意义。
下面结合附图和实例进一步说明本发明。
图1为STR基因座标准分型物及不同片段大小的等位基因凝胶电泳分离结果图。
图中1-9为以重组质粒为模板，通过PCR扩增获得的各等位基因片段；M为DYS385基因座等位基因分型标准物。
本发明所设计的技术方案制备STR的等位基因分型标准物的操作步骤如下1、用PCR扩增获得待克隆的STR等位基因片段，又称待克隆的等位基因片段的准备(1)提取DNA分子，即收集STR基因座的不同长度的等位基因片段任何含有人体DNA的组织或细胞通过酶、高温及CHELEX等多种因素下，DNA分子会与其在自然状态下相结合的蛋白质及其它杂质分离，裸露地存在于水溶液中，为下一步的反应创造良好的条件。
(2)第一次PCR扩增、凝胶电泳检测目的为找到不同长度的等位基因片段，作为第二次PCR扩增模板将提取的群体DNA样本进行PCR扩增，用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为5％)电泳分离PCR扩增片段，银染显色或基因凝胶扫描系统判定样品基因型，选出包含不同大小片段长度的等位基因的个体样本及扩增产物。
其基本原理如下
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)a、PCR反应混合PCR反应所需的试剂包括目标基因座引物(有荧光标记或没有)、dNTP、1X标准Taq缓冲液、MgCl2、TaqDNA聚合酶，最后加入样本模板DNA 1μl，反应体系20-100μl。
b、PCR反应条件95℃3min，然后94℃ 30s,56-62℃ 30s,72℃ 1min，30个循环，最后一个循环延伸7min。
c、PCR基本原理DNA在有上述试剂存在时，当温度在94℃-56-62℃-72℃之间不断循环时，其双链会跟随温度不断重复打开-聚合-形成新的拷贝的循环，最终倍增、放大基因座所在特定DNA片段的拷贝数，从而微小的DNA片段可以通过普通的检测方法变得肉眼可见。
d、电泳分离DNA分子带有负电荷，当有电压存在时，它会从凝胶的负极向正极泳动，但由于DNA分子的片段大小不同，其泳动速度不一致，当稳定的电压保持一定时间后，不同大小的DNA分子将泳动到凝胶的不同位置。具体操作为将适量(1-5μl)的样品PCR扩增产物及等位基因分型标准物加载于聚丙烯酰胺凝胶上，同步稳压500-700V电泳60-100min。通过银染显色法或基因扫描软件阅读判定样品基因型。
(3)第二次PCR扩增目的为将第一次PCR扩增、凝胶电泳检测所发现的不同长度的等位基因片段，进行倍增，放大，即提高其不同大小片段长度的等位基因各自的拷贝数。第二次PCR扩增的模板可为以下三种A、不同等位基因的纯合子个体的基因组DNA。纯合子个体即他的基因型由两个片段长度相同的等位基因构成。
B、不同等位基因的纯合子的经纯化，稀释5-1000倍的第一次PCR扩增产物。
C、从凝胶中回收的不同大小片段长度的等位基因片段。方法为切割出含各等位基因片段的凝胶，将其中相应的等位基因片段洗脱于消毒双蒸水中，制备成PCR的再扩增模板。
2、PCR扩增的等位基因片段的克隆，即将不同片段大小的等位基因片段重组到质粒载体上，然后转染到感受态细菌中进行扩大培养和繁殖，并用PCR扩增法，选择出已含插入片段正确的克隆。
(1)质粒重组可通过如下三种方式实现
A、平端插入法，足量的等位基因片段可在一定温度和必要试剂存在的条件下，经T4连接酶的催化，可与质粒DNA的两个末端连接。
B、粘性末端连接法，对STR基因座的引物进行专门的设计，使PCR扩增后的片段中包含某一内切酶的作用点，经此内切酶作用后，释放出带有某个突出碱基(如C碱基)的等位基因片段，然后在T4连接酶的催化下，与带有与等位基因片段所突出的碱基能够互补的碱基(如G碱基)的质粒载体发生反应，从而实现等位基因片段与质粒DNA的两个末端连接。
C、T/A克隆法，用加A试剂盒，给PCR扩增后的等位基因片段加一个A碱基，然后在T4连接酶的催化下，与带有与等位基因片段所突出的A碱基能够互补的1碱基的质粒载体(如pUC质粒)发生反应，从而实现等位基因片段与质粒DNA的两个末端连接。
(2)将重组质粒在42℃转染到感受态细菌中，细菌在37℃恒温中振荡培养2小时左右；利用选择性平板培养后，用PCR方法选择出含有插入片段大小正确的细菌克隆，从中提取质粒DNA。
3、重组质粒的DNA测序及标准命名采用荧光标记双脱氧核苷酸(ddNTP)测序试剂盒，ABI310全自动测序仪，以质粒公用引物从插入片段的两端对重组质粒进行测序分析。按国际法庭血液遗传学学会(International Society of Forensic Haemogenetics，简称ISFH)规定的命名原则，对插入的等位基因片段进行命名。此原则是用STR基因座的核心重复序列循环次数对相应等位基因片段命名。例如DYS385基因座的核心重复序列为GAAA，当某一片段中包含的GAAA循环11次时，此片段命名为11。如此类推。
4、以重组质粒为模板，进行PCR扩增，其产物经纯化、混合后即获得相应STR基因座的Ladder。
(1)以重组质粒为模板，进行PCR扩增，获得高浓度的各等位基因片段的扩增产物；(2)用PCR产物纯化试剂盒纯化各等位基因PCR扩增片段；(3)将纯化过的各等位基因片段混合，其混合物电泳后形成梯子状标准分型物带谱即Ladder，不同的标准等位基因片段在该带谱中处于不同的位置。待测样品基因型的判定即可根据其谱带与该Ladder相对应的位置及数目而得出。
下面结合DYS385 STR基因座的等位基因分型标准物举例说明1、待克隆的等位基因片段的准备(1)PCR扩增，制备DYS385基因座的等位基因片段再扩增模板制备标准分型参照物模板DNA将提取的群体DNA样本进行PCR扩增，用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为5％)电泳分离PCR扩增片段，银染显色。从群体样本中选出9个不同大小片段长度的等位基因，切割出含相应片段的凝胶，回收洗脱于消毒双蒸水中，制备成PCR的再扩增模板。
(2)PCR再扩增，产物鉴定及纯化将制备好的9份模板DNA进行PCR扩增，反应体系100μl，内含0.2μmol/L DYS385引物，200μmol/L dNTP,50μmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8.3),1.5mmol/L MgCl2,1U Taq酶，模板DNA 1μl。PCR反应条件为95℃3min，然后94℃ 30s,59℃ 30s,72℃ 1min，30个循环，最后一个循环延伸7min。取1μl扩增产物进行电泳，银染后，确定出其片段大小，用PCR纯化试剂盒将大小正确的PCR扩增片段产物纯化。
2、PCR扩增片段的克隆采用平端插入克隆试剂盒，将纯化后的9个PCR片段直接插入pUC18/19质粒的SmaⅠ酶切点位置。将重组后的质粒转染到感受态细菌DH5αTM中，经选择培养筛选后，再用PCR方法选择出含有插入片段正确的克隆。
3、重组质粒的DNA测序采用荧光标记双脱氧核苷酸(ddNTP)测序试剂盒，ABI310全自动测序仪，以pUC质粒公用引物从插入片段的两端对9个重组质粒进行测序分析，结果证明其插入的9个片段是一个分别由GAAA四核苷酸核心序列分别重复11-19次组成的不同长度片段，其长度为252bp-288bp。按国际法庭血液遗传学学会(ISFH)规定的命名原则，插入的等位基因片段为DYS385等位基因11-19(参见
图1中1-9泳道)。
4、以重组质粒为模板，进行PCR扩增，经纯化、混合制备出所需Ladder。
(1)重组质粒的扩大培养及纯化对经测序证实含有正确等位基因插入片段的质粒进行扩大培养，经质粒纯化试剂盒纯化后，得到标准命名的DYS385等位基因分型标准参照物重组质粒。
(2)等位基因分型标准物阶梯的制备用含有DYS385等位基因插入片段的重组质粒DNA为模板，进行PCR扩增，纯化扩增产物，最后将各DYS385等位基因的PCR纯化物混合，电泳分离显色后即可见DYS385基因座Ladder(参加
图1中的M泳道)。
权利要求
1.一种人类基因短串联重复序列分型标准物的分子克隆制备方法，其特征在于它包括下列步骤(1)用聚合酶链式反应扩增获取待克隆的人类DNA短串联重复序列基因座的大小不同的各等位基因片段；(2)将上述扩增的等位基因片段与质粒载体重组，重组质粒再转染至感受态细菌中培养和繁殖，然后选出已含有插入片段正确的克隆；(3)DNA测序分析上述获得的重组质粒中的等位基因片段的序列并按国际统一标准命名；(4)用经测序证实含有正确等位基因插入片段的重组质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增，其产物经纯化、混合后即获得相应的等位基因分型标准物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于获取待克隆的等位基因片段的工艺是(1)将提取的群体DNA样本经CHELEX-100等方法处理，取得裸露的基因组DNA分子；(2)上述取得的DNA分子经聚合酶链式反应扩增和凝胶电泳检测，从凝胶中找到并回收不同大小片段长度的等位基因片段，制备成再扩增模板；(3)以上述等位基因片段为模板，再度进行聚合酶链式反应扩增，以放大，提高各等位基因各自的拷贝数。
3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于扩增的等位基因片段可通过T/A克隆法实现与质粒载体重组，即采用加A试剂盒，给扩增的等位基因片段加一个A碱基，然后在T4连接酶的催化下与带T突出碱基的质粒载体反应，实现等位基因片段与质粒DNA的两个未端连接。
4.如权利要求1或2所述方法，其特征在于扩增的等位基因片段可通过平端插入法实现与质粒载体重组，即等位基因片段经T4连接酶催化，与质粒DNA的两个末端连接。
5.如权利要求1或2所述方法，其特征在于扩增的等位基因片段可通过粘性末端连接法实现与质粒载体重组，即扩增的等位基因片段经内切酶作用，使其释放出带有某个突出碱基的等位基因片段，然后通过碱基互补与带有相应互补碱基的质粒载体反应，在T4连接酶的催化下实现等位基因片段与质粒DNA的两个末端连接。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于重组质粒转染至感受态细菌培养后，采用聚合酶链式反应方法选择出含有插入片段大小正确的克隆。
全文摘要
本发明公开了一种用分子克隆技术制备人类短串联重复序列基因座(STR)等位分型标准物的方法。它的最大特点是将PCR扩增获得的STR等位基因片段与质粒载体重组,装载有STR等位基因片段的重组质粒既可以通过细菌大量繁殖,也可以重组质粒为模板进行PCR扩增,制备出大量等位基因片段,最后通过简单的纯化、混合便可获得大量优质STR等位基因分型标准物。本发明制备的STR等位基因分型标准物具永久的同一性和国际统一的标准命名,可以解决STR在分型上长期存在准确性和标准化问题。
文档编号C12Q1/68GK1312371SQ0110723
公开日2001年9月12日 申请日期2001年3月5日 优先权日2001年3月5日
发明者张 林, 辛军平, 陈国弟, 饶莉 申请人:四川大学