专利名称：一种新的人基因序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人WSB1的cDNA序列，该蛋白是鼠WSB1的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
WSB1属于细胞因子信号传导阻遏物家族(SOC)中一个亚家族(WD-40)中的成员。WSB1、WSB2是小鼠中发现的两个基因，它们被认为与细胞因子信号传导的抑制作用有关。细胞因子信号传导是所有真核和原核生物中都存在的一个普遍现象。尤其是在真核生物中，细胞因子是一类具有重要生物学功能的因子，在体内调节控制重要蛋白的分泌，这些蛋白在生物的发育与分化过程中又起着重要的作用。细胞因子是通过一条称为JAK-STAT的信号传递途径来发挥其诱导细胞分裂及分化的功能。细胞因子信号传导阻遏物能被众多可激活JAK-STAT途径的细胞因子诱导产生，并对JAK-STAT途径具有抑制作用。
目前，对于WSB亚家族成员的研究还刚刚起步，对于SOC(细胞因子信号传导阻遏物家族)的研究则相对早些。根据SOC家族中成员所含中心功能区的不同，将其分为四个亚家族，CIS、WSB、SRPY及ASB。SOC基因家族中最早的成员是CIS，是由Yoshimura A.等人于1995年在小鼠体内发现的(EMMO J.1995，14，2816-2826)。而后，Starr R.等人于1997年分离并克隆得到了CIS家族成员SOCS-1、SOCS-2等基因(Nature1997，387(6636)917-921)。最近，人们又从小鼠中分别得到了SPRY及ASB家族中成员的克隆。WSB1是小鼠中发现的一个基因。它是由Hilton D.J.等人于1998年从小鼠精母细胞cDNA文库中克隆得到的一个基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95114-119)，它与小鼠中的另一个基因WSB2具有较高的同源性并具有相似的功能。WSB1、WSB2与前面所提到的一些基因均属于SOC家族，研究发现，它们虽然在结构域上有些不同，但它们的功能却非常相似，在细胞内起着调节蛋白转运的作用。
然而，在本发明之前，尚没有发现人中属于WSB亚家族的成员。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码人的一种与小鼠WSB1同源的蛋白，本发明的与小鼠WSB1同源的人基因被命名为人WSB1(GenBank AccessionNo.AF064257)(注因申请保密一段时间，故在本申请之前登录的序列不对公众公开)。
本发明的另一个目的是提供一种新的蛋白，该蛋白被命名为人WSB1蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人WSB1蛋白的方法。
本发明还提供了这种人WSB1核苷酸序列和蛋白的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人WSB1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中31-1296位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人WSB1蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人WSB1蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人WSB1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人WSB1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人WSB1蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人WSB1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人WSB1蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1325个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于31-1296位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人WSB1蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人WSB1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4中31-1296位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.4序列的编码框31-1296位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.4中31-1296位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人WSB1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人WSB1蛋白多肽”指具有人WSB1蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人WSB1相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人WSB1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与人WSB1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人WSB1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人WSB1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括人WSB1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人WSB1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人WSB1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人WSB1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括人WSB1多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人WSB1的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核苷酸分子，该分子通常具有人WSB1核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人WSB1的核酸分子。
本发明还包括检测人WSB1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人WSB1多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人WSB1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人WSB1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人WSB1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人WSB1蛋白的分子，也包括那些并不影响人WSB1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人WSB1基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人WSB1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人WSB1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人WSB1功能的抗体以及不影响人WSB1功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人WSB1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人WSB1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人WSB1核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施例中，人WSB1的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15＇-GTATTCCCGGAATCAGACGGTGC-3＇和反向引物A25＇-GTCCCTACTACTAGGGAAGGCAG-3＇，进行PCR，获得1325bp(A1/A2)的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
WSB1、WSB2属于细胞因子信号传导阻遏物家族(SOC)一个亚家族(WSB)中的成员。WSB1和WSB2被认为与细胞因子的信号传导的抑制作用有关。细胞因子是一类具有重要生物学功能的因子，在体内调节重要蛋白的分泌，这些蛋白在生物的发育与分化过程中又起着重要的作用。细胞因子信号传导阻遏物能被众多可激活JAK-STAT途径的细胞因子诱导产生，并对JAK-STAT途径具有抑制作用。本发明的人WSB1基因与小鼠的WSB1高度同源，同时与WSB2的同源性也较高，这表明它是小鼠WSB1在人中的一个同源基因，并且与WSB1(以及WSB2)有着相似的生物学。
在附图中，
图1为本发明的人WSB1(hWSB1)与小鼠WSB1(mWSB1)的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人WSB1蛋白(hWSB1)与小鼠WSB1蛋白(mWSB1)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人WSB1的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15＇-GTATTCCCGGAATCAGACGGTGC-3＇(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸A25＇-GTCCCTACTACTAGGGAAGGCAG-3＇(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A1、A2引物对的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、70℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟；电泳检测得到的PCR片断，以A1、A2为引物对扩增出的目的片段长约1300多个碱基对。
2.PCR产物的测序将如上获得的PCR扩增产物分别与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1325bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于31-1296位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人WSB1的氨基酸序列，共421个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用人WSB1的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们与小鼠WSB1基因及其编码蛋白具有极高同源性，在核酸水平上的同一性达到了87％左右(图1)，蛋白水平上的同一性和相似性分别为92％和95％(图2)，所以，本发明的人WSB1是小鼠WSB1在人中的一个同系物，并且具有与WSB家族成员(尤其小鼠WSB1)相同或相似的功能。
WSB1属细胞因子信号阻遏物家族(SOC)亚家族(WSB)中的一个成员。在生物体内，细胞因子主要起着调节控制细胞分泌重要蛋白的作用，这些蛋白在生物的发育与分化过程中也起着重要的作用。细胞因子蛋白产物是通过一条称为JAK-STAT的信号传递途径来发挥其诱导细胞分裂及分化的功能。细胞因子信号传导阻遏物能被众多可激活JAK-STAT途径的细胞因子诱导产生，并对JAK-STAT途径具有抑制作用(Nature 1995，377(19)，591-594)。所有的SOC家族的成员均有着相似的结构特点，它们的N末端含有不同长度的氨基酸组分，而C末端则均有一个非识别性的花式结构，即SOCS框。SOC家族按中心结构域的组成不同，被分为四个亚家族含SH2结构域的CIS亚家族、含WD-40结构域的WSB亚家族、含SPRY结构域的SSB亚家族及含锚蛋白重复序列结构域的ASB亚家族(J Leukoe Biol1998，63(6)665-668)。根据结构决定功能，结构相似功能相似的原理，可以从这些基因或蛋白的功能来推测人WSB1的功能。
众所周知，细胞因子的信号传导及其抑制对于调节生物体内重要蛋白分泌与运输起着重要的作用，因此WSB1在生物体内起着重要作用。
WSB家族成员既含有WD-40重复序列，又含有SOCS功能区。其在生物体内的功能也有这两个功能区决定。特别是在人WSB1的氨基酸序列中存在2个由15个氨基酸组成的WD-40重复序列的特征性序列——(L/I/V/M/S/T/A/C)-(L/I/V/M/F/Y/W/S/T/A/G/C)-(L/I/M/S/T/A/G)-(L/I/V/M/S/T/A/G/C)-X2-(D/N)-X2-(L/I/V/M/W/S/T/A/C)-X-(L/I/V/M/F/S/T/A/G)-W-(D/E/N/)-(L/I/V/M/F/S/T/A/G/C/N)[注该序列中X为任意氨基酸，“2”等数字为氨基酸数目，“(L/I/V/M/S/T/A/C)”表示从这8个氨基酸中任意选择一个氨基酸]。
在本发明的蛋白中符合上述模式的序列片段是LATGLNNGRIKIWDV(SEQID NO.4中140-155位)，LVSASRDKTLRVWDL(SEQ ID NO.4中183-198位)。这进一步证明了本发明的人WSB1是WD-40家族中的一个成员。
另外，还发现本发明的人WSB1中还存在1个GH-WD重复序列-X6-94-(GH-X23-41-WD)-关于该GH-WD重复序列的描述，可参见Eva J.Neer等人，Nature1994，371(22)297-300。其中，X6-94表示6-94个氨基酸的可变长度，X23-41表示23-41个氨基酸的可变长度，较佳地在GH和WI之间的间隔为27±2个氨基酸。
本发明的蛋白符合上述模式的序列片段是GHHHDVVACDFSPDGALLATASYDTRVVIWD(SEQ ID NO.4中253-284位)，GH-WD重复序列即WD重复序列，其中GH和WD之间间隔27个氨基酸，这进一步证明了本发明的人WSB1是WD-40家族中的一个成员。
WD-40家族中的成员的分布极为广泛，从细胞核到胞质膜中均可找到，它们还被认为是细胞骨架的组成成分。酵母被认为是研究WD-40重复序列功能的最佳模式，这一重复序列与蛋白的相互作用有关。WD-40重复序列通常与TPR家族成员的重复序列相互作用，从而调节蛋白的相互作用及转运。研究发现，WD-40与TPR重复序列的相互作用是通过抑制核酸的转录表达来完成的(FEBS Lett.1992307(2)131-134)。综上所述，人的WSB属于WD-40家族中的一个成员，并且具有WD-40家族成员的上述相关功能。
另外，SOC家族中的成员又均含有SOCS框，细胞因子信号传导抑制物在生物体内主要起着抑制细胞因子信号传导的作用。研究表明其作用可能是通过与受体细胞的特殊序列结合，从而阻止蛋白与受体的结合，抑制蛋白的正常转运。当分泌蛋白在细胞内已超过其正常含量，就由细胞因子阻遏蛋白产生负反馈以控制细胞因子分泌这些蛋白。SOCS框可能是这些蛋白发挥作用的功能区，目的蛋白与SOCS框结合后，由SOC蛋白作出正确的判断，以决定蛋白产生的速度，并由信号传导蛋白将目的蛋白转运到细胞内一定的部位并将其稳定在细胞的正确位置。信号传导阻遏蛋白还可能通过SOCS框与激酶结合，抑制激酶的催化活性来阻遏蛋白的转运(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95114-119)。本发明的人WSB1多肽的C末端也含有一与SOCS框高度同源的区域，这表明了其也可能具有与SOC家族成员相同或相似的功能。
由上可知，WSB亚家族中的成员在此过程也可能起着双重作用。其在生物体内起着调节及引导蛋白正确转运的作用。主要在依赖JAK-STAT途径的众多生理功能(如细胞发育、分化、增殖及免疫)过程中发挥重要的作用。这也为我们进一步研究信号因子阻遏物在体内的作用提供了依据。
本发明的人WSB1除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人WSB1还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人WSB1的N端与小鼠的WSB1的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人WSB1的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人WSB1核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人WSB1的表达水平或者抑制人WSB1的过度表达。本发明的人WSB1蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人WSB1缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人WSB1在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码人WSB1的cDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人WSB1 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为5＇-CAGAGTCGACATGGCCAGCTTTCCCCCGAG-3＇(SEQ ID NO.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人WSB1编码序列的20个核苷酸；3＇端引物序列为5’-CCAAGTCGACCTAAATACGATACGAGAGAAAC-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人WSB1的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI消化pQE-9载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人WSB1的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人WSB1。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人WSB1。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约48KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人WSB1在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人WSB1的cDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人WSB1 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为5＇-CAGAGAATTCATGGCCAGCTTTCCCCCGAG-3＇(SEQ ID NO.7)，该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人WSB1编码序列的20个核苷酸；3＇端引物序列为5’-CCAATCTAGACTAAATACGATACGAGAGAAAC-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有XbaI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人WSB1的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用EcoRI、XbaI消化pcDNA3载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用HindIII酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证人WSB1的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为48KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人WSB1基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称一种新的人基因序列、其编码的多肽及制备方法(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1GTATTCCCGG AATCAGACGG TGC23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GTCCCTACTA CTAGGGAAGG CAG23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度1325bp
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 GTATTCCCGG AATCAGACGG TGCCCCATAG ATGGCCAGCT TTCCCCCGAG GGTCAACGAG61 AAAGAGATCG TGAGATCACG TACTATAGGT GAACTTTTAG CTCCTGCAGC TCCTTTTGAC121 AAGAAATGTG GTCGTGAAAA TTGGACTGTT GCTTTTGCTC CAGATGGTTC ATACTTTGCT181 TGGTCACAAG GACATCGCAC AGTAAAGCTT GTTCCGTGGT CCCAGTGCCT TCAGAACTTT241 CTCTTGCATG GCACCAAGAA TGTTACCAAT TCAAGCAGTT TAAGATTGCC AAGACAAAAT301 AGTGATGGTG GTCAGAAAAA TAAGCCTCGT GAACATATTA TAGACTGTGG AGATATAGTC361 TGGAGTCTTG GTTTTGGGTC ATCAGTTCCA GAAAAACAGA GTCGCTGTGT AAATATAGAA421 TGGCATCGCT TCAGATTTGG ACAAGATCAG CTACTTCTTG CTACAGGGTT GAACAATGGG481 CGTATCAAAA TATGGGATGT ATATACAGGA AAACTCCTCC TTAACTTGGT AGATCATACT541 GAAGTGGTCA GAGATTTAAC TTTTGCTCCA GATGGAAGCT TGATCCTGGT GTCAGCTTCA601 AGAGACAAAA CTCTCAGAGT ATGGGACCTG AAAGATGATG GAAACATGAT GAAAGTATTG661 AGGGGGCATC AGAATTGGGT GTACAGCTGT GCATTCTCTC CTGACTCTTC TATGCTGTGT721 CCAGTCGGAG CCAGTAAAGC AGTTTTCCTT TGGAATATGG ATAAATACAC CATGATACGG781 AAACTAGAAG GACATCACCA TGATGTGGTA GCTTGTGACT TTTCTCCTGA TGGAGCATTA841 CTGGCTACTG CATCTTATGA TACTCGAGTA TATATCTGGG ATCCACATAA TGGAGACATT901 CTGATGGAAT TTGGGCACCT GTTTCCCCCA CCTACTCCAA TATTTGCTGG AGGAGCAAAT961 GACCGGTGGG TACGATCTGT ATCTTTTAGC CATGATGGAC TGCATGTTGC AAGCCTTGCT1021 GATGATAAAA TGGTGAGGTT CTGGAGAATT GATGAGGATT ATCCAGTGCA AGTTGCACCT1081 TTGAGCAATG GTCTTTGCTG TGCCTTCTCT ACTGATGGCA GTGTTTTAGC TGCTGGGACA1141 CATGACGGAA GTGTGTATTT TTGGGCCACT CCACGGCAGG TCCCTAGCCT GCAACATTTA1201 TGTCGCATGT CAATCCGAAG AGTGATGCCC ACCCAAGAAG TTCAGGAGCT GCCGATTCCT1261 TCCAAGCTTT TGGAGTTTCT CTCGTATCGT ATTTAGAAGA TTCTGCCTTC CCTAGTAGTA1321 GGGAC(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度421个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Ala Ser Phe Pro Pro Arg Val Asn Glu Lys Glu Ile Val Arg16 Ser Arg Thr Ile Gly Glu Leu Leu Ala Pro Ala Ala Pro Phe Asp31 Lys Lys Cys Gly Arg Glu Asn Trp Thr Val Ala Phe Ala Pro Asp46 Gly Ser Tyr Phe Ala Trp Ser Gln Gly His Arg Thr Val Lys Leu61 Val Pro Trp Ser Gln Cys Leu Gln Asn Phe Leu Leu His Gly Thr76 Lys Asn Val Thr Asn Ser Ser Ser Leu Arg Leu Pro Arg Gln Asn91 Ser Asp Gly Gly Gln Lys Asn Lys Pro Arg Glu His Ile Ile Asp106 Cys Gly Asp Ile Val Trp Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Val Pro121 Glu Lys Gln Ser Arg Cys Val Asn Ile Glu Trp His Arg Phe Arg136 Phe Gly Gln Asp Gln Leu Leu Leu Ala Thr Gly Leu Asn Asn Gly151 Arg Ile Lys Ile Trp Asp Val Tyr Thr Gly Lys Leu Leu Leu Asn166 Leu Val Asp His Thr Glu Val Val Arg Asp Leu Thr Phe Ala Pro181 Asp Gly Ser Leu Ile Leu Val Ser Ala Ser Arg Asp Lys Thr Leu196 Arg Val Trp Asp Leu Lys Asp Asp Gly Ash Met Met Lys Val Leu211 Arg Gly His Gln Asn Trp Val Tyr Ser Cys Ala Phe Ser Pro Asp226 Ser Ser Met Leu Cys Pro Val Gly Ala Ser Lys Ala Val Phe Leu241 Trp Asn Met Asp Lys Tyr Thr Met Ile Arg Lys Leu Glu Gly His256 His His Asp Val Val Ala Cys Asp Phe Ser Pro Asp Gly Ala Leu271 Leu Ala Thr Ala Ser Tyr Asp Thr Arg Val Tyr Ile Trp Asp Pro286 His Asn Gly Asp Ile Leu Met Glu Phe Gly His Leu Phe Pro Pro301 Pro Thr Pro Ile Phe Ala Gly Gly Ala Asn Asp Arg Trp Val Arg316 Ser Val Ser Phe Ser His Asp Gly Leu His Val Ala Ser Leu Ala331 Asp Asp Lys Met Val Arg Phe Trp Arg Ile Asp Glu Asp Tyr Pro346 Val Gln Val Ala Pro Leu Ser Asn Gly Leu Cys Cys Ala Phe Ser361 Thr Asp Gly Ser Val Leu Ala Ala Gly Thr His Asp Gly Ser Val376 Tyr Phe Trp Ala Thr Pro Arg Gln Val Pro Ser Leu Gln His Leu391 Cys Arg Met Ser Ile Arg Arg Val Met Pro Thr Gln Glu Val Gln406 Glu Leu Pro Ile Pro Ser Lys Leu Leu Glu Phe Leu Ser Tyr Arg421 Ile(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度30碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CAGAGTCGAC ATGGCCAGCT TTCCCCCGAG 30(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CCAAGTCGAC CTAAATACGA TACGAGAGAA AC 32(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度30碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CAGAGAATTC ATGGCCAGCT TTCCCCCGAG 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CCAATCTAGA CTAAATACGA TACGAGAGAA AC 3权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人WSB1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列包含SEQ ID NO.3中31-1296位的核苷酸序列。
4.一种分离的人WSB1蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人WSB1蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人WSB1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人WSB1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人WSB1蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人WSB1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人WSB1蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸31-1296位。
12.一种能与权利要求4所述的人WSB1蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的人基因核苷酸序列。更具体地,本发明提供人WSB1的cDNA序列,该序列编码的蛋白是鼠WSB1的同系物。 本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C12N15/12GK1249346SQ9812192
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月30日 优先权日1998年9月30日
发明者余龙, 傅强, 赵勇, 张宏来, 屠强 申请人:复旦大学