专利名称：一种新的人基因编码序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人Myx的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白是Mad家族的成员。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
Mad蛋白是一类含有碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构(bHLHZip，basic helix-loop-helix-leucin-zipper)的蛋白家族，能够和另一类bHLHZip蛋白Max家族成员特异形成异源二聚体，发挥转录抑制物的作用，能在分化组织中调节细胞生长(EMBOJ 1995，14(22)5649-5659)。
Mad蛋白的发现和原癌基因myc的研究密不可分。myc基因是鸟类AMV病毒在细胞内的同源序列，它最早在鸡中被发现，以后又在哺乳动物中发现了其它形式的myc，组成了一个小的原癌基因家族。和Mad、Max蛋白一样，Myc蛋白也含有bHLHZip结构，这种结构是许多转录因子的共同特征。HLH结构和亮氨酸拉链结构是蛋白间相互作用的位点。Myc蛋白一般不会自身形成同源二聚体，而和Max蛋白形成异源二聚体，结合于DNA特意位点如转录增强子的Ebox基序上。myc基因属于“即刻早期反应”(immediate early response”)基因，它们的表达可被促有丝分裂的刺激信号激活，且不依赖从头开始的蛋白质合成，一般发生于静止细胞转向生长状态的早期，即G0向G1转变时。它们的表达产物有利于S期的DNA合成，在细胞周期中表达水平保持不变。而当细胞进入分化状态，myc的表达即被迅速下调(Ann.Rev_Biochem.1992，61809-860)。
不同于Myc蛋白，Max蛋白存在于不增殖的G0细胞，并且在G0/G1转换时它的丰度不变化。它的半衰期远大于Myc，是个非常稳定的蛋白，它的含量也远高于Myc。Max不含有活化转录的活性位点，但Myc和Max形成异源二聚体后，可以提高和DNA结合的亲合力，并提高活性区域的效率(Cell 1993，72211-222)。
Mad是又一类Max结合蛋白。迄今为止，有四个Mad家族成员被发现。1993年，美国的Ayer等以Max蛋白为探针筛选λgtll表达文库，找到了人的Madl蛋白。Zervas等用相似的方法找到了另一个Mad蛋白-—人Mxil(Cell 1993，72211-222；223-232)。1995年Ayer同组人员Hurlin等用酵母双杂交法在小鼠胚胎干细胞cDNA库里找到了小鼠的Mad3和Mad4(EMBO J.1995，14(22)5649-5659)。1996年，Wang等人在挪威鼠中得到了Myx(U45986)，与Mad3有着极高的同源性，但未见文献的进一步报道。我们发现的人Myx蛋白和大鼠Mad3、挪威鼠Myx同源性较高，是Mad家族的又一新成员。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码Mad家族的一个新成员。本发明的Mad家族成员被命名为人Myx。
本发明的另一个目的是提供一种新的Mad家族成员，该蛋白被命名为人Myx蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的Myx多肽的方法。
本发明还提供了这种人的Myx核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人Myx蛋白多肽，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人Myx蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Myx蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Myx蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人Myx蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Myx蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为737个核苷酸，其详细序列见SEQID No.3，其中开放读框位于11-631位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人Myx蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中11-631位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框11-631位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中11-631位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人Myx相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人Myx蛋白多肽”指具有人Myx蛋白活性的SEQ ID No.4序列的多肽。该术语还包括具有与人Myx蛋白相同功能的、SEQ ID No.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人Myx蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式还包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与人Myx DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人Myx多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人Myx多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人Myx多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人Myx多肽编码序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人Myx蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人Myx多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括人Myx多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人Myx的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有人Myx多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人Myx的核酸分子。
本发明还包括检测人Myx核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人Myx多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人Myx DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Myx基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Myx基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人Myx蛋白的分子，也包括那些并不影响人Myx蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人Myx基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人Myx基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人Myx或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerlmg等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y，1981)。本发明的抗体包括能阻断人Myx功能的抗体以及不影响人Myx功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人Myx基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人Myx基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明的一个实施例中，人Myx的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人胚胎λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A5’-TGTCGCCGACATGGAACCCTTG-3’为正向引物，寡核苷酸B5’-TCCAACAGGTGACTCCGAGCAG-3’为反向引物，进行PCR。对扩增产物进行测序后得到SEQ ID No.3的全长cDNA序列。
Mad是一类Max结合蛋白，它们仅和Max结合形成异源二聚体。Mad蛋白与原癌基因myc具有相互拮抗作用，对肿瘤的研究有着极为重要的意义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1，人Myx的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人胚胎入gtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物--A5’-TGTCGCCGACATGGAACCCTTG-3’(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸B5’-TCCAACAGGTGACTCCGAGCAG-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A/B的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到约730bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A/B与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用Sequi Therm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对抽提的质粒进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共737bp，详细序列见SEQ ID No.3，其中开放读框位于11-631位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人Myx的氨基酸序列，共206个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.4。
实施例2，同源比较用本发明的人Myx的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它们与不同来源的Mad家族成员有着显著的同源性。用PCGENE软件分析发现人Myx蛋白与小鼠mad3(U32394)编码的蛋白的同源性为82％，相似性为86.9％(见表1)；与挪威鼠myx(U45986)编码的蛋白的同源性为79.6％，相似性为85.4％(见表2)，而且本发明的人Myx蛋白含有典型的bHLHZip结构域(59RSVHNELEKRRRAQLKRCLERLKQQMPLGGDCARYTFLSLLRRARMHIQKLEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQL137，其中59RSVHNELEKRRR70为碱性区域，71AQLKRCLERLKQQM84为第一个螺旋，85LGGDC90为环，91ARYTTLSLLRRARMHIQK108为第二个螺旋，109LEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQL137为亮氨酸拉链)，因此可以推测它属于Mad家族，具有Mad家族成员的一般功能。
Mad是又一类Max结合蛋白，它们不形成同源二聚体，仅和Max结合形成异源二聚体，与bHLHZip家族的其他成员则没有相互作用(Cell 1993，72211-222)。Mad家族成员可在体外细胞分化时被诱导表达，例如在U937细胞分化时，Mad家族的mRNA表达上升，而c-myc的mRNA表达量下降(Oncogene 1994，91247-1252)。而Mad-Max复合物替代Myc-Max，可以抑制那些在细胞增殖和保持细胞未分化状态起作用的Myc-Max目标基因的表达(Genes Dey.1993，72110-2119)。Mad蛋白和Myc蛋白的相拮抗作用可以为Myc的精确调控提供一种新的手段。Mad蛋白的N端有另一个保守序列Sin3作用域(sm3-interacting domain，SID)。该区域可以和酵母转变共抑制物Sin3的鼠同源物相互作用，提示Mad蛋白抑制转录的功能通过常规机制实现(EMBO J.1995，14(22)5646-5659)。本发明中SID区域为8IQVLLQAAEFLERREREA25。
在迄今为止发现的四个Mad家族成员中，人Madl和人Mxil(Cell 1993，72211-222；223-232)分别被定位与人染色体2p13和10q25，这两个位点都和人类疾病紧密相关。2p13处经常发生染色体移位、急性成淋巴细胞白血病、儿童慢性淋巴细胞白血病以及基底细胞乳头瘤等肿瘤相关在成神经胶质瘤中经常发现10q24-10q26区段发生缺失，暗示该位置存在有抑癌基因(Oncogene 1994，9665-668)，在前列腺癌中已发现mxi基因的等位缺失和突变(Nature Genet.1995，9249-255)；而Mad3和Mad4在染色体上的定位结果显示它们位于和许多不同肿瘤类型相关的候选区域(EMBO J.1995，14(22)5649-5659)。本发明的人Myx蛋白为进一步研究Mad家族蛋白在肿瘤防治中的作用打下了基础。
实施例3，人Myx在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人Myx的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID No.5和6)进行扩增，获得人Myx cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-TCAGGTCGACATGGAACCCTTGGCCAGCAAC-3’(SEQ ID No.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人Myx编码序列的21个核苷酸；3’端引物序列为5’-TrGGAAGCTTTCATAGCCAGGCGCCGCCG-3’(SEQ ID No.6)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人Myx的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人Myx的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lac1阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人Myx。用6M盐酸胍(PH5.0)从柱中洗脱人Myx。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(PH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约24KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.4的序列一致。
实施例4，人Myx在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人Myx的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ IDNo.7和8)进行扩增，获得人Myx cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-TCAGAAGCTTATGGAACCCTTGGCCAGCAAC-3’(SEQ ID No.7)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人Myx编码序列的21个核苷酸；3’端引物序列为5’-TrGGGAATTCTCATAGCCAGGCGCCGCCG-3’(SEQ ID No.8)
该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人Myx的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生索抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人Myx的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(PH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(PH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(PH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为24KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和℃端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQIDNo.4的序列一致。
实施例5，制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人Myx基因翻译产物的能力来评估。SEQ ID No.1～No.8的说明SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1TGTCGCCGAC ATGGAACCCT TG 22SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TCCAACAGGT GACTCCGAGC AG 22SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)长度737bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.31 TGTCGCCGAC ATGGAACCCT TGGCCAGCAA CATCCAGGTC CTGCTGCAGG CGGCCGAGTT61 CCTGGAGCGC CGTGAGAGAG AGGCCGAGCA TGGTTATGCG TCCCTGTGCC CGCATCGCAG121 TCCAGGCCCC ATCCACAGGA GGAAGAAGCG ACCCCCCCAG GCTCCTGGCG CGCAGGACAG181 CGGGCGGTCA GTGCACAATG AACTGGAGAA GCGCAGGAGG GCCCAGTTGA AGCGGTGCCT241 GGAGCGGCTG AAGCAGCAGA TGCCCCTGGG CGGCGACTGT GCCCGGTACA CCACGCTGAG301 CCTGCTGCGC CGTGCCAGGA TGCACATCCA GAAGCTGGAG GATCAGGAGC AGCGGGCCCG361 ACAGCTCAAG GAGAGGCTGC GCAGCAAGCA GCAGAGCCTG CAGCGGCAGT GGATGCAGCT421 CCGGGGGCTG GCAGGAGCGG CCGAGCGGGA GCGGCTGCGG GCGGACAGTC TGAACTCCTC481 AGGCCTCTCC TCTGAGCGCT CAGACTCAGA CCAAGAGGAG CTGGAGGTGG ATGTGGAGAG541 CCTGGTTTTT GGGGGTGAAG CCGAGCTGCT GCGGGGCTTC GTCGCCGGCC AGGAGCACAG601 CTACTCGCAC GGCGGCGGCG CCTGGCTATG ATGTTCCTCA CCCAGGGGCG GCCTCTGCCC661 TCTACTCGTG CCAGGCCCAC TTGCCAAGGC AGGAGCCCTC CCCAAGCCTT CAGGGCTGCT721 CGGAGTCACC TGTTGGASEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)长度206个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ii)分子型多肽(xi)序列描述SEQ ID No.41 Met Glu Pro Leu Ala Ser Asn Ile Gln Val Leu Leu Gln Ala Ala16 Glu Phe Leu Glu Arg Arg Glu Arg Glu Ala Glu His Gly Tyr Ala31 Ser Leu Cys Pro His Arg Ser Pro Gly Pro Ile His Arg Arg Lys46 Lys Arg Pro Pro Gln Ala Pro Gly Ala Gln Asp Ser Gly Arg Ser61 Val His Asn Glu Leu Glu Lys Arg Arg Arg Ala Gln Leu Lys Arg76 Cys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Met Pro Leu Gly Gly Asp Cys91 Ala Arg Tyr Thr Thr Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Arg Met His106 Ile Gln Lys Leu Glu Asp Gln Glu Gln Arg Ala Arg Gln Leu Lys121 Glu Arg Leu Arg Ser Lys Gln Gln Ser Leu Gln Arg Gln Trp Met136 Gln Leu Arg Gly Leu Ala Gly Ala Ala Glu Arg Glu Arg Leu Arg151 Ala Asp Ser Leu Asn Ser Ser Gly Leu Ser Ser Glu Arg Ser Asp166 Ser Asp Gln Glu Glu Leu Glu Val Asp Val Glu Ser Leu Val Phe181 Gly Gly Glu Ala Glu Leu Leu Arg Gly Phe Val Ala Gly Gln Glu196 His Ser Tyr Ser His Gly Gly Gly Ala Trp LeuSEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度31碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGGAACCCT TGGCCAGCAAC 31SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TCATAGCCAG GCGCCGCCG 29SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度31碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGGAACCCT TGGCCAGCAAC 31SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TCATAGCCAG GCGCCGCCG29表I人Myx蛋白与小鼠Mad3蛋白的同源比较进行同源比较的两个序列是hMyx-人Myx蛋白残基总数206msMad3-小鼠Mad3蛋白残基总数205比较真值表结构-遗传真值表开放间隔罚分10单位间隔罚分10表示一致残基的符号为“|”表示相似残基的符号为“.”被认为是相似的氨基酸为A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，VF，Y，WhMyx - MEPLASNIQVLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHRSPGPIHRRKKRPPQ -50|||.||||||||||||||||||||||||||||||| ||| . ||.| | |msMad3 - MEPVASNIQVLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHHSPGTVCRRRKPPLQ -50hMyx - APGAQDSGRSVHNELEKRRRAQLKRCLERLKQQMPLGGDCARYTTLSLLR -100|||| ||||||||||||||||||||||| |.|||||| ||.|||||||||msMad3 - APGALNSGRSVHNELEKRRRAQLKRCLEQLRQQMPLGVDCTRYTTLSLLR -100hMyx - RARMHIQKLEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQLRGLAGAAERERLR -150||.||||||.||| || |||.||||||||| | || || || ||||||msMad3 - -ARVHIQKLEEQEQQARRLKEKLRSKQQSLQQQLEQLQGLPGARERERLR -149hMyx - ADSLNSSGLSSERSDSDQEELEVDVESLVFGGEAELLRGFVAGQEHSYSH -200|||| ||||||||||||||.|||||| |||| |.||| | || ||||||msMad3 - ADSLDSSGLSSERSDSDQEDLEVDVENLVFGTETELLQSFSAGREHSYSH -199hMyx - GGGAWL -206|||msMad3 - STCAWL -205同源性168(82％)相似性10(4.9％)插入人Myx蛋白的间隔数0插入小鼠Mad3蛋白的间隔数1表II人Myx蛋白与挪威鼠Myx蛋白的同源比较进行同源比较的两个序列是hMyx-人Myx蛋白残基总数206.NrMyx-挪威鼠Myx蛋白残基总数206比较真值表结构-遗传真值表开放间隔罚分10单位间隔罚分10表示一致残基的符号为“|”表示相似残基的符号为“.”被认为是相似的氨基酸为A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，WhMyx - MEPLASNIQVLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHRSPGPIHRRKKRPPQ -50|||.||||||||||||||||||||||||||||||| ||| . ||.| | |NrMyx - MEPVASNIQYLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHHSPGTVCRRRKAPLQ -50hMyx - APGAQDSGRSVHNELEKRRRAQLKRCLERLKQQMPLGGDCARYTTLSLLR -100|||| ||| |||||||||||||||||| |.|||||| | .|||||||||NrMyx - APGALNSGRHVHNELEKRRRAQLKRCLEQLRQQMPLGVDHTRYTTLSLLR -100hMyx - RARMHIQKLEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQLRGLAGAAERERLR -150|||||||||.||| | |||.|||.||||| | || || | ||.|||NrMyx - GARMHIQKLEEQEQQAQRLKEKLRSRQQSLQQQLEQLQGLLGVRERDRLR -150hMyx - ADSLNSSGLSSERSDSDQEELEVDVESLVFGGEAELLRGFVAGQEHSYSH -200|||| |||||||| |||||.||||||||||| |.||| | |||||||||NrMyx - ADSLDSSGLSSERFDSDQEDLEVDVESLVFGTETELLQSFSAGQEHSYSH 200hMyx - GGGAWL -206|.||NrMyx - STGTWL -206同源性164(79.6％)相似性12(5.8％)插入人Myx蛋白的间隔数0插入挪威鼠Myx蛋白的间隔数0
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列。
4.一种分离的人Myx蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.一种产生具有人Myx蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人Myx蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人Myx蛋白的重组细胞(c)在适合表达人Myx蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人Myx蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求4所述的人Myx蛋白多肽特异性结合的抗体。
10.根据权利要求9所述的探针分子，其特征在于是指能与人Myx基因产物或片段结合但不识别和结合与其它非相关抗原分子的抗体。
11一种探针分子，其特征在于，它具有人Myx多肽编码序列中8-100个连续核苷酸。
12.根据权利要求11所述的探针分子，其特征在于，它具有人Myx多肽编码序列中15～50个连续的核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列——人Myx的cDNA序列。该cDNA编码的蛋白是Mad家族的成员,它与SEQ ID No.3中从核苷酸11—631位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列蓖麻—具有SEQ ID No.4所示的序列的多肽。此外,还提出了生产具有人Myx蛋白活性的多肽的方法。本发明为进一步研究Mad家族蛋白在肿瘤治疗中的作用打下了基础。
文档编号C12P21/02GK1248626SQ99113968
公开日2000年3月29日 申请日期1999年8月9日 优先权日1999年8月9日
发明者余龙, 傅强, 赵勇, 张宏来, 赵寿元 申请人:复旦大学