专利名称：一种新的人基因编码序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人CDV-1的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白是小鼠CDV-1蛋白的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
内脏皮脂腺病幼鼠(juvenile visceral steatosis mice，JVS mice)带有类Reye综合症表型，表现为脂肪肝、高血氨、低血糖和生长迟缓等(Lab Anim.1989，2283-87)。它们体内缺乏脂肪酸β-氧化作用中的必需载体——肉碱。β-氧化作用主要在细胞线粒体基质内进行。脂肪酸在线粒体膜外被活化成脂酰辅酶A.再与肉碱反应生成脂酰肉碱后才能进入线粒体基质以进行以后的脂肪酸氧化分解作用。用肉碱对JVS鼠进行治疗后，各种症状均消失(J.Biol.Chem.1992，2675032-5035)。
1997年，Masuda等人用mRNA差异显示法寻找14天龄的JVS鼠心室中的差异表达基因(FEBS Lett.1997，408221-224)。他们找到四个在JVS鼠心室中表达上调的基因和一个表达下调的新基因CDV(carnitine deficiency-associated gene expressed in ventricle)。CDV有三种mRNA形式，分别为1.1kb、1.3kb和2.6kb长。其中两种短mRNA仅在心脏中发现，它们的cDNA命名为CDV-1而2.6kb的mRNA在心脏、肾脏和脑中有表达，在骨骼肌和肝脏中未见，它的cDNA命名为CDV-1R(CDV-1-related gene)。本发明的人CDV-1基因，尚属首次报道。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码小鼠CDV-1蛋白的一个同系物，本发明的小鼠CDV-1蛋白的同系物被命名为人CDV-1。
本发明的另一个目的是提供一种新的小鼠CDV-1蛋白的同系物，该蛋白被命名为人CDV-1蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的CDV-1多肽的方法。
本发明还提供了这种人的CDV-1核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ IDNo.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人CDV-1蛋白多肽，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人CDV-1蛋白活性的多肽的方法，该方法包括
(a)将编码具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人CDV-1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人CDV-1蛋白的重组细胞(c)在适合表达入CDV-1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞(d)分离出具有人CDV-1蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为498个核苷酸，其详细序列见SEQID No.3，其中开放读框位于118-441位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人CDV-1蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中118-441位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框118-441位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中118-441位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下。更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人CDV-1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人CDV-1蛋白多肽”指具有人CDV-1蛋白活性的SEQ ID No.4序列的多肽。该术语还包括具有与人CDV-1蛋白相同功能的、SEQ ID No.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人CDV-1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与人CDV-1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人CDV-1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人CDV-1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人CDV-1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人CDV-1多肽编码序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人CDV-1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人CDV-1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括人CDV-1多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人CDV-1的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有人CDV-1多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人CDV-1的核酸分子。
本发明还包括检测人CDV-1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人CDV-1多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人CDV-1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CDV-1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CDV-1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CDV-1蛋白的分子，也包括那些并不影响人CDV-1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CDV-1基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段抗体重链；抗体轻链遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CDV-1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CDV-1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol. 6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人CDV-1功能的抗体以及不影响人CDV-1功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CDV-1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CDV-1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明的一个实施例中，人CDV-1的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人心脏λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A5’-CAGTATGATAGCTGTGCAGCAG-3’为正向引物，寡核苷酸B5’-GAGATTAGGCTTATAGCTAGTGG-3’为反向引物，进行PCR。对扩增产物进行测序后得到SEQ ID No.3的全长cDNA序列。
CDV-1为JVS鼠在典型的心脏生长过度症中差异表达的蛋白，本发明的人CDV-1为研究人类中相关的致病分子机理提供了基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1，人CDV-1的cDNA序列的克隆和测定
1.引物扩增以人心脏λgtlleDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A5’-CAGTATGATAGCTGTGCAGCAG-3’(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸B5’-GAGATTAGGCTTATAGCTAGTGG-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A/B的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、62℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到约500bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A/B与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对抽提的质粒进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共498bp，详细序列见SEQ ID No.3，其中开放读框位于118-441位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人CDV-1的氨基酸序列，共107个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.4。
实施例2，同源比较用本发明的人CDV-1的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它们与JVS鼠中的CDV-1有显著的同源性。用PCGENE软件分析可以看出，它们的蛋白的同源性为90.7％，相似性为95.4％(见附表1)。因此，可以推测本发明的人CDV-1蛋白为JVS鼠CDV-1的同系物，并具有类似的功能。
1997年，Masuda等人在研究JVS鼠典型的心脏过度生长症的分子机制过程中，找到了一个表达下调的新基因CDV(carnitine deficiency-associated gene expressed in ventricle)(FEBS Lett.1997，408221-224)。CDV有三种mRNA形式，分别为1.1kb、1.3kb和2.6kb长。其中两种短mRNA仅在心脏中发现，表达水平在JVS鼠中显著下降，它的cDNA命名为CDV-1；而2.6kb的mRNA在心脏、肾脏和脑中有表达，在骨骼肌和肝脏中未见，表达水平在JVS鼠和对照鼠中无差别，它的cDNA命名为CDV-1R(CDV-1-related gene)。CDV-1编码的107个氨基酸和CDV-1R的C末端308-414位的氨基酸序列完全一致。两条肽链具亲水性和碱性，含有较多数量的赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸(本发明的人CDV-1蛋白含赖氨酸13.1％、谷氨酸11.2％、谷氨酰胺13.1％、亮氨酸8.4％)。序列分析表明，它们可能含有卷曲螺旋(coiled-coil)的结构。本发明中对应区域为1MIKNLEVQLRRATDEMKAYISSYQQEKRKAIREQYTKNTAEQENL45。这些新肽段的生物学功能和致病联系尚不清楚。已有的研究结果表明CDV-I的两种mRNA在心脏中特异表达并在JVS鼠的心室而非心房受到抑制，经肉碱治疗后，它们的水平会上升至对照鼠水平。本发明人的CDV-1基因为研究和JVS鼠相当的人类患者的致病分子机理提供了新的依据。
实施例3，人CDV-1在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人CDV-1的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID No.5和6)进行扩增，获得人CDV-1 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-TCAGGTCGACATGATTAAGAACCTAGAAG-3’(SEQ ID No.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人CDV-1编码序列的19个核苷酸；3’端引物序列为
5’-TTGGAAGCTTTCACAGTATTAGCCGGTCC-3’(SEQ ID No.6)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人CDV-1的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人CDV-1的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人CDV-1。用6M盐酸胍(PH5.0)从柱中洗脱人CDV-1。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(PH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约13KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.4的序列一致。
实施例4，人CDV-1在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人CDV-1的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID No.7和8)进行扩增，获得人CDV-1 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-TCAGAAGCTTATGATTAAGAACCTAGAAG-3’(SEQ ID No.7)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人CDV-1编码序列的19个核苷酸3’端引物序列为5’-TTGGGATATCTCACAGTATTAGCCGGTCC-3’(SEQ ID No.8)该引物含有EcoRV限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人CDV-1的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和EcoRV消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人CDV-1的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(PH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(PH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(PH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为13KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.4的序列一致。
实施例5，制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人CDV-1基因翻译产物的能力来评估。
SEQ ID No.1～8的说明SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CAGTATGATA GCTGTGCAGC AG 22SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GAGATTAGGC TTATAGCTAG TGG23SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)长度498bp(B)类型核酸(C)链性单链拓扑结构线性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.3(xii)1 CAGTATGATA GCTGTGCAGC AGGCCTCGAA AGCAATCGGT CCAAATTAGA ACAGGAAGTT61 AGAAGACTCC GTGAAGAATG TCTTCAAGAA GAAAGTAGAT ACCATTATAC AAATTGTATG121 ATTAAGAACC TAGAAGTTCA ACTTCGTCGT GCTACTGATG AGATGAAGGC ATATATCTCT181 TCTTATCAAC AAGAAAAAAG AAAGGCAATT AGGGAACAGT ATACCAAAAA TACTGCTGAA241 CAAGAAAACC TTGGAAAGAA ACTTCGGGAA AAACAAAAAG TTATACGAGA AAGTCATGGT301 CCAAATATGA AACAAGCAAA AATGTGGCGT GATTTGGAAC AATTAATGGA ATGTAAGAAA361 CAGTGCTTTC TGAAACAACA AAGCCAAACT TCCATTGGTC AGGTAATTCA GGAGGGTGGG421 GAGGACCGGC TAATACTGTG AATTCTTGTG TCATCGTTTG GGGTTTTACT TGATACCACT481 AGCTATAAGC CTAATCTCSEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ii)分子型多肽(xi)序列描述SEQ ID No.41 Met Ile Lys Asn Leu Glu Val Gln Leu Arg Arg Ala Thr Asp Glu16 Met Lys Ala Tyr Ile Ser Ser Tyr Gln Gln Glu Lys Arg Lys Ala31 Ile Arg Glu Gln Tyr Thr Lys Asn Thr Ala Glu Gln Glu Asn Leu46 Gly Lys Lys Leu Arg Glu Lys Gln Lys Val Ile Arg Glu Ser His61 Gly Pro Asn Met Lys Gln Ala Lys Met Trp Arg Asp Leu Glu Gln76 Leu Met Glu Cys Lys Lys Gln Cys Phe Leu Lys Gln Gln Ser Gln91 Thr Ser Ile Gly Gln Val Ile Gln Glu Gly Gly Glu Asp Arg Leu106 Ile LeuSEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 5TCAGGTCGAC ATGATTAAGA ACCTAGAAG 29SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGGTT TCACAGTATT AGCCGGTCC 29SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGATTAAGA ACCTAGAAG 29SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGATATC TCACAGTATT AGCCGGTCC29表I人CDV-1蛋白与JVS鼠CDV-1蛋白的同源比较进行同源比较的两个序列是hCDV-1—人CDV-1蛋白残基总数107JVSCDV-1—JVS鼠CDV-1蛋白残基总数107比较真值表结构-遗传真值表开放间隔罚分10单位间隔罚分10表示一致残基的符号为“|”表示相似残基的符号为“.”＂被认为是相似的氨基酸为A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，WhCDV-1-MIKNLEVQLRRATDEMKAYISSYQQEKRKAIREQYTKNTAEQENLGKKLR -50||||||| |||||||||||.|| ||||||||||||||| .||||||||||JVSCDV-1 -MIKNLEVELRRATDEMKAYVSSDQQEKRKAIREQYTKNITEQENLGKKLR -50hCDV-1-EKQKVIRESHGPNMKQAKMWRDLEQLMECKKQCFLKQQSQTSIGQVIQEG -100|||| .||||||||||||||||||||||||||||||||| .|||||||||JVSCDV-1 -EKQKAVRESHGPNMKQAKMWRDLEQLMECKKQCFLKQQSPASIGQVIQEG -100hCDV-1-GEDRLIL-107|||||.|JVSCDV-1 -GEDRLVL-107同源性97(90.7％)相似性5(4.7％)插入人CDV-1蛋白的间隔数0插入人JVS鼠CDV-1蛋白的间隔数0
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列。
4.一种分离的人CDV-1蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.一种产生具有人CDV-1蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人CDV-1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人CDV-1蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人CDV-1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人CDV-1蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求4所述的人CDV-1蛋白多肽特异性结合的抗体。
10.根据权利要求9所述的探针分子，其特征在于是指能与人CDV-1基因产物或片段结合但不识别和结合与其它非相关抗原分子的抗体。
11.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
12.根据权利要求11所述的探针分子，其特征在于，它具有人CDV-1多肽编码序列中15～50个连续的核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列——人CDV－1的cDNA序列。该cDNA编码的蛋白是小鼠CDV－1的一个同系物,它与SEQ ID No.3中从核苷酸118—441位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列编码一具有SEQ ID No.4所示的序列的多肽。此外,还提出了生产具有人CDV－1蛋白活性的多肽的方法。本发明为进一步研究CDV－1相关的致病分子机理打下了基础。
文档编号C12Q1/68GK1252449SQ9911396
公开日2000年5月10日 申请日期1999年8月9日 优先权日1999年8月9日
发明者余龙, 傅强, 赵勇, 张宏来, 赵寿元 申请人:复旦大学