专利名称：一种新酶源的醇腈裂解酶催化合成光学活性氰醇化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种醇腈裂解酶，系采用桃仁、枇杷或大巢菜种子为新酶源制得的粗醇腈裂解酶，该酶可催化合成光学活性氰醇化合物。
氰醇化合物是重要的有机合成中间体，可以方便地转化成α-羟基酮、α-羟基酸、β-胺基醇、胺基腈和氮丙啶等化合物。无酶催化条件下化学合成产物是外消旋的氰醇化合物，由于酶对反应的高度化学、区域和立体的专一性以及酶反应条件温和，已从化学合成发展为酶催化合成光学活性氰醇化合物。杏仁(Almond)是一个方便的酶源，由杏仁源制得的R-氰醇裂解酶[(R)-oxynitrilase]催化合成光学活性氰醇化合物已进行了研究(Griengl，H等，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1997，1933)，用粗制酶和纯酶的R-氰醇裂解酶催化反应已有报导(Kiljunen，E等，Tetrahedron，Asymmetry，1996，7.1105；1997，8，1225；1997，8，1551；Effenberger，F.Angew.，Chem.Int.Ed.Engl.，1994，33，1555；Enantiomer.，1996，1，359)。通常水相缓冲液作为满意的反应条件(Brussee，J等，Tetrahedron，1990，46，979)以及后来发展的水-有机溶剂两相反应体系。由于羰基化合物和酶分别具有亲油性和亲水性，在油水两相反应中反应不均匀，且水相中易产生化学加成的消旋产物而导致产物ee值低，纯化困难，难以工业化生产，林国强等人采用杏仁作为酶源制得粗醇腈裂解酶，并用该酶在有机溶剂或含微水的有机溶剂体系中催化合成光学活性氰醇化合物，发展了连续流动相酶催化反应工艺，更适合工业化生产的需要(CN98110818.0)，除苦杏仁外，还报导高梁秧苗(Tetrahedron Lett，1990，31，1249)，橡胶树(Tetrahedron Lett.，1993，34，4769)，木薯(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，4)，苹果、李和樱桃种子(TetrahedronAsymmetry，1997，8，1551；1997，8，1225)作为酶源的醇腈裂解酶合成手性氰醇。虽然在醇腈裂解酶催化合成手性氰醇领域的研究很热，但是用于手性氰醇的生产还有不少问题有待解决，还需不断探索新酶源及其工业化生产的方法。
本发明的目的是提供一种从新酶源获得的醇腈裂解酶。
本发明的另一目的是提供一种由新酶源获得的醇腈裂解酶的用途，即合成手性本发明的另一目的是提供一种由新酶源获得的醇腈裂解酶的用途，即合成手性氰醇化合物及其方法。
根据中医药学理论以及氰甙具有毒性这一特征，对近百种有毒性或具有镇咳却痰功效作用的植物细胞进行了调查和试探，并从中选择了几种植物细胞作为酶源进行了详细考察，获得几种可作为醇腈裂解酶的新酶源。
本发明的醇腈裂解酶系采用桃仁Peach(Prunus persica L.)、枇杷Loquat(Eriobotrya L.)或大巢菜(Vida Sativa L.)的种子作为新酶源，经破碎、有机溶剂脱酯后获得醇腈裂解酶。也可以经破碎、水溶性溶剂浸出或提取、浸出液或提取液经浓缩，或者浸出液或提取液经透析或柱层析分离后再浓缩或有机溶剂提取后再浓缩而制得。所获的醇腈裂解酶可以是粗产品。
所述的桃仁、枇把或大巢菜种子通常经洗净、晾干、除皮，采用组织破碎机粉碎，用1-3倍量的有机溶剂脱除脂质物质1-3次，经50-200目筛获白色或微黄色粗酶粉。该酶粉经干燥处理通常含水8-10％，置于冰箱中贮存。
或者经破碎后，用水溶性溶剂如磷环-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋环钠缓冲液，咪唑-盐环缓冲液中在0-20℃下均化匀浆、过滤。浸出或提取液经离心处理，浸出或提取液浓缩；或者浸出或提取液经透析离子交换柱层析或柱层析凝胶分离后再浓缩可制得醇腈裂解酶。
所述的有机溶剂是低碳链的脂、醚、醇、芳烃，取代芳烃、烷烃、卤代烷或二甲基甲酰胺等。
所述的水溶性溶剂可以是pH3-6.5的无机盐或有机盐水溶液或缓冲液，或上述溶液与水溶性有机溶剂的混合液。
采用本发明的以桃仁、枇杷仁或大巢菜种子为酶源的醇氰裂解酶能催化碳基化合物和氰或腈化合物反应生成光学活性氰醇化合物，即以分子式为R1COR2的羟基化合物，分子式为R3CN的氰化物，在有机溶剂中和0-50℃时，醇氰裂解酶催化反应0.01-120小时，推荐反应时间0.05-48小时，生成光学活性氰醇化合物。其中R1＝R4C6H4，R4OC6H4，R4OCH2C6H4、
C6H4CH＝CH、R5CH＝CH、
R2＝H，C1-3的烷基，R3＝H、(CH3)2COH或HCOH，R4＝H，C1-4的烷基，R5＝C1-8的烷基，R6＝H，C1-4的烷基、
或CH3OCH2-。所述的羰基化合物和氰或腈化合物的摩尔比为1∶0.8-20，推荐比为1∶1-5。羰基化合物和R-氰醇裂解酶的用量化0.001-100mol羰基化合物/1克R-氰醇裂解酶，推荐0.005-20mol羰基化合物/1克R-氰醇裂解酶。所述的溶剂可以是低碳链的酯、醚、芳烃、取代芳烃、烷烃、卤代烷、酮或二甲基甲酰胺等常用的溶剂。如甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、石油醚、辛烷、环己烷、乙醚、异丙醚、异丁醚、异戊醚、苯甲醚、苯、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、三氯乙烷等。
所述的R-氰醇裂解酶可以采用粗制的杏仁酶粉。上述的有机溶剂可以含有0-10％重量的水。
本发明中所述的有机溶剂，可以是有机溶剂中含有微量的水；也可以由醋酸或无机酸NaCN在水中反应制备HCN后，由有机溶剂提取HCN而获微量水的有机相。粗制杏仁酶中通常也含有水。本发明中所述的氰化剂，可以是HCN，也可以是丙酮氰醇、甲醛氰醇等。
采用本发明的新酶源制备醇腈裂解酶，不仅酶源丰富，而且制备醇腈裂解酶的方法简易，该酶能用于合成手性氰醇化合物，适于工业化生产的需要。
下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1将100克桃仁、枇杷仁或去壳的大巢菜种子经组织粉碎机粉碎，用常规有机溶剂脱酯，如用100-500ml乙酸乙酯、丙酮或乙醚搅拌6.5-2h，过滤，再重复洗涤2-4次，所获的粗制脱酯酶粉即R-氰醇腈解酶贮存于冰箱中备用。
氰化钠和冰醋酸或硫酸反应后，用溶剂提取方法获得含氢氰酸有机溶剂溶液，无水Na2SO4干燥后使用。或者直接将HCN试剂加入含0-1％重量水的有机溶剂。
将500mg上述粗制枇杷仁为酶源的酶粉(R-氰醇腈裂解酶)、2.5mmol羰基化合物和在10ml溶剂中的2.5-10mmolHCN在反应瓶中搅拌，在下表所示的温度和反应时间反应，然后过滤回收粗制酶，滤液浓缩，粗产物用硅胶柱层析纯化后测定产率，并制成O-保护的乙酸酯或其它衍生物后，氰醇化合物的不对称纯度用CHIRALPAKAD柱进行手征性高压液相法测定，产率和ee％值结果列于表1。作为对比，同一体系中加入5％(v/v)0.02M柠檬酸缓冲溶液(pH5.5)的两相体系的结果列于同表。
表1序号 羟基化合物溶剂 反应时间 温度 产率 eeh ℃ ％％1苯甲醛异丙醚+缓冲液 30 76812 异丙醚4 99993 异丙醚30 ＞95 ＞97结果表明不加缓冲液的微水反应体系所获结果较好。
实施例2将桃仁、枇杷或大巢菜种子去皮，在0-20℃下在组织破碎机破碎，用水溶性溶液100-200ml 50mM咪唑-盐酸缓冲液或柠檬酸钠缓冲溶液(pH3-6.5)，在0-10℃均化匀浆，提取物过滤，滤液经离心机离心，收集上清液为酶粗提取液，浓缩获粗醇腈裂解酶；或者将上述上清液装入透析袋内，用2L 50mM咪唑-盐酸缓冲液透析1-3次，过滤浓缩获粗醇腈裂解酶；或者将上清液装入SephadexG-25柱层析，分离后浓缩获粗醇腈裂解酶。上述上清液也可用离子交换色谱纯化，如用DEAE-Cellulose52柱纯化后再浓缩获粗醇腈裂解酶，也可以将上述各种方法交叉混合使用，以获得较纯的醇腈裂解酶。
以枇杷仁为例，粗提取液，经离子交换层析后的溶液中，测定醇腈裂解酶活力(J.Bio.Chem，1979，254，23，12145)和蛋白质含量(Analytical Biochem，1976，72，248)，结果如下表
实施例3同实施例1条件下，采用不同酶源获得的醇腈酶以苯甲醛或对甲氧基苯甲醛为底物在微水反应体系合成手性芳香醛的结果如表2所示序号 底物酶源溶剂 含水量 温度 反应时 产物 产率 ee％ ℃ 间小时 ％ ％1 苯甲醛 枇杷仁 异戊醚 4 48 1-1 99992 30 48 ＞95973桃仁 4 48 99994 30 48 97895大巢菜种子 12 48 100 996 对甲氧基 枇杷仁 4 48 1290.57 苯甲醛 30 48 2074.58桃仁 4 48 1290.59 30 569110 大巢菜种子 12 5294上述化合物分析结果如下(R)-(+)-2-羟基-2-苯基乙腈无色油状液体。[α]D20+47.5(c1.89，CHCl3)，e.e.＞99％；1H NMRδ，3.70(s，1H，OH)；5.50(s，1H，CH)；7.50(m，5H，Ar-H).IR3414，3066，3036，2250，1495，1456，1406，1196，1043，765，701cm-1MSm/z133(M+，78)，132(M+-1，50)，116(29)，115(43)，106(38)，105(92)，91(14)，77(100)，57(9)，51(45)，43(21).(R)-(+)-2-羟基-2-(4-甲氧基苯基)乙腈无色固体。m.p.66-67℃[α]D18+50.0(c0.89，CHCl3)，e.e.95.3％；Lit.54a[α]D20+49(c1，CHCl3)，e.e.99％.Isolated yield(after chromatography)60％.1H NMRδ，3.18(s，1H，OH)；3.82(s，3H，CH3O)；5.46(s，1H，CH)；δ，6.94(d，2H，J＝8.7Hz，Ar-H)；7.43(d，2H，J＝8.7Hz，Ar-H).IR3398，2248，1613，1515，1023，823cm-1MSm/z(强度)163(M+，2)，137(11)，136(91)，135(100)，107(15)，92(14)，77(25)，63(9)，51(5).
实施例4同实施例1，采用
为底物时，不同酶源的醇腈裂解酶在异戊醚、乙醚或乙醇为溶剂时，反应结果列于表3。序号产物 酶源温度℃ 时间h 产率％ ee％1
桃仁 4 24 93 98.22 枇杷 4 24 50 913 大巢菜种子4 96 974
桃仁 4 48 78 685 3024 30 69.36 枇杷 4 48 33 52.2(S)-(+)-2-羟基-2-(2-呋喃基)乙腈浅黄色油状液体。[α]D21+50.0(c1.60，CHCl3)，e.e.＞99％；1H NMRδ，3.17(br s，1H，OH)；5.55(s，1H，CH)；6.43(dd，1H，J＝1.9Hz，J＝3.3Hz，Ar-H)；6.61(m，1H，Ar-H)；7.49(m，1H，Ar-H).IR3403，2256，1707，1500，1400，1269，1234，1149，1030，750cm-1MSm/z123(M+，53)，106(64)，97(27)，96(87)，95(100)，91(70)，77(28)，68(42)，57(76)，43(52)(R)-(+)-2-羟基-4-苯基-(E)-丁基-3-烯腈白色固体。m.p.77-78℃。[α]D13+26.1(c0.78，CHCl3)，e.e.＞69.3％；1H NMRδ，3.00(d，1H，J＝7Hz，OH)；5.17(t，1H，J＝5.9Hz，CH)；6.27(dd，1H，J＝5.9Hz，J＝15.9Hz，＝CH)；6.92(d，1H，J＝15.9Hz，＝CH)；7.33-7.44(m，5H，Ar-H).IR3358，3030，2253，1654，1492，1450，1415，1300，1088，1024，976，925，756，695cm-1MSm/z1590(M+，62)，142(18)，133(96)，132(44)，131(100)，130(78)，115(35)，105(26)，104(35)，103(44)，91(35)，78(25)，77(34)，63(15)，51(24)，43(0.7).
实施例5同实施例1，采用CH3CH2CH2CH2CH2CH2CHO、
为底物时，用桃仁作为酶源的醇腈裂解酶在异戊醚或石油醚为溶剂时，反应结果列于表4中。序号产物酶源 温度 时间h产率％ ee％℃1
桃仁4 453958.12
25 454298.23
25 120 2272(R)-(+)-2-羟基辛腈无色油状液体。[α]D25+7.5(c0.75，CHCl3).1H NMRδ，0.88(t，3H，J＝7Hz，CH3)；1.23-1.62(m，8H，4xCH2)；1.84(q，2H，J＝7Hz，CH2)；2.98(br s，1H，OH)；4.47(t，1H，J＝7Hz，CH).(R)-2-羟基-2-甲基己腈无色油状液体。[α]D22+2.2(c1.33，CHCl3)，e.e.98.6％.1H NMRδ，0.94(t，3H，J＝7.1，6-H)；1.24(t，2H，J＝7Hz，5-H)；1.35-1.51(m，2H，4-H)；1.59(s，3H，1-H)；1.73-1.79(m，2H，3-H).IR3445，2961，2938，2875，2242，1465，1397，1172，1143，1063，957，887cm-1MSm/z127(M+，0.7)，121(0.2)，110(5)，102(13)，101(100)，94(1)，85(3)，83(5)，71(13)，68(6)，57(8)，43(14).(R)-(+)-2-羟基-2-苯基丙腈无色油状液体.[α]D17+4.3(c0.47，CHCl3)，e.e.78.1％.1H NMRδ，1.84(s，3H，CH3)；2.97(s，1H，OH)；7.33-7.41(m， 3H，Ar-H)；7.53-7.56(m，2H，Ar-H).IR3421，2927，2856，2250，1494，1451，1371，1226，1101，764，699cm-1MSm/z149(M++2，9)，1480(M++1，5)，147(M+，36)，132(100)，121(10)，105(55)，91(5)，77(34)，63(4)，51(20)，43(14).
实施例6同实施例1，采用大巢菜种子为酶源时，醇腈裂解酶催化合成手性氰醇的结果列表5中。序号产物 温度℃时间h产率％ee％1
10 10-48 93 88.22
1210-4871703
12 9791(R)-(+)-2-羟基-2-(3，4-甲撑-二-氧苯基)乙腈无色油状液体。[α]D22+44.5(c4.54，CHCl3).1H NMR(CD3OD/TMS)δ，5.69(s，1H，CH)；6.17(s，2H，CH2)；7.03(m，1H，Ar-H)；7.19(m，2H，Ar-H).IR3410(w)，2907，2249(CN)，1612，1505，1490，1448，1254，1039，933，863，815，778MSm/z177(M+，0.1)，176(M+-1，0.1)，150(M+-HCN，88)，149(M+-HCN-H，100)，121(31)，91(10)，65(12)，63(19).(R)-2-羟基-2-(3-吡啶基)乙腈白色固体，m.p.85-86℃.1H NMR；δ，5.55(br s，1H，OH)；5.65(s，1H，CH)；7.45(dd，1H，J1＝8Hz，J2＝4.8Hz，Py-H)；7.98(dd，1H，J1＝8Hz，J2＝1.6Hz，Py-H)；8.56(d，1H，J＝4.8Hz，Py-H)；8.61(s，1H，Py-H).IR3021(w)，2820(w)，2684(w)，1955，1602，1585，1480，1432，1030，933，838，792，707，642.MSm/z135(M++1，100)，133(M+-1，31)，117(M++1-H2O，9)，108(M+-CN，98)，107(M+-HCN，48)，106(M+-HCN-H，56)，90(3)，78(33)，51(27).元素分析C7H6N2O实测值C62.63％，H4.36％，N21.07％；计算值C62.68％，H4.51％，N20.88％.(R)-乙羟基-2-(4-氟代苯基)乙腈无色油状液体。[α]D20+36.4(c6.38，CHCl3)，e.e.＝94.2％.1H NMR；δ，3.39(br，s，1H，OH)；5.52(s，1H，CH)；7.13(m，2H，Ar-H)；7.49(m，2H，Ar-H).19F NMR(CDCl3/TFA，δppm)-33.93(m，Ar-F).IR3410(w)，2252，1606，1511，1421，1235，1038，837.MSm/z151(M+，11)，133(M+-H2O，8)，124(M+-HCN，85)，123(M+-1-HCN，100)，109(11)，95(81)，75(30).HRMSC8H6FNOFound151.0413，Cal151.0433.
实施例7本反应瓶中加入0.5克粗醇腈酶粉、10mmol醛、11-15mmnol HCN的乙酸乙酯溶液10ml，搅拌反应，过滤所获粗酶粉可重复利用。快速柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/6)，除溶剂获产物，结果如表所示序号醛 温度℃ 反应时间产物 产率*ee**(小时)％％1枇杷仁
25 84
94782大巢素
30 46
90693桃仁
20 96
9640.14枇杷仁
25 300
9021.45大巢菜
45 24
8317.36桃仁
20 168
86587
30 24
87818
4524
9222.3*柱层析色谱分离纯化产率。产率按转化掉底物计算。**ee值经手性柱高压液相拆分测定。HRMSC15H16N2O3实测值272.1179，计算值272.1161.(+)-2-羟基-2-(2-(N-甲氧甲基)吡咯)乙腈浅黄色油状液体[α]D20+104.9(c0.667，CHCl3)，ee＝81％.1H NMRδ，3.30(s，3H，CH3)；3.92(br，s，1H，OH)；5.08，5.68(AB，2H，J＝10.9Hz，CH2)；5.56(s，1H，CH)；6.13(dd，1H，J1＝3.5Hz，J2＝3.0Hz，Pyrr-H)；6.47(dd，IH，J1＝3.6Hz，J2＝1.7Hz，Pyrr-H)；6.83(dd，1H，J1＝2.9Hz，J2＝1.7Hz，Pyrr-H).13C NMRδ，126.38(t-C-Pyrr)；125.59(C-Pyrr)；118.01(CN)；113.18(C-Pyrr)；108.01(C-Pyrr)；78.63(NCH2O)；56.55(CHOH)；55.995(OCH3).IR3402，3117，2934，2851，2247，1486，1464，1444，1400，1277，1097，1025，732.MSm/z(强度％)166(M+，5)，149(4)，139(9)，124(31)，108(17)，94(7)，80(10)，71(9)，57(13)，45(100)，41(12).HRMSC8H10N2O2实测值，166.742，计算值，166.742.(R)-(+)-2-(2-(N-甲基)吡咯)-2-羟基-乙腈浅黄色油状液体。[α]D20+35.7(c1.15，EtOH)，ee＝40.1％1H NMRδ，2.90(br，s，1H，OH)；3.72(s，3H，CH3)；5.50(s，1H，CH)；6.09(m，1H，Pyrr-H)；6.38(m，1H，Pyrr-H)；6.67(m，1H，Pyrr-H).
实施例8手性氟取代芳香醛氰醇的合成将1-2mmol底物醛，粗醇腈酶粉0.2-0.5g，1-1.5等摩尔比的HCN的乙酸乙酯，乙醚或异戊醚溶液10ml，10-20℃反应24-48小时，快速柱层析纯化(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4-6)，获产物，结果如下表。序号 醛 温度℃ 反应时 产物产率*ee**间小时 ％ ％1枇杷仁
4 24
36 77.32桃仁
20 24
96 843桃仁
28 24
71 84.34枇杷仁
4 24
40 40.15大巢菜种子
20 24
92.1 46.16大巢菜种子
12 24
70 417大巢菜种子
20 24
91 598桃仁
12 48
90 35*、**同实施例7。(R)-2-羟基-2-(2-氟代苯基)乙腈无色油状液体。[α]D20+21.85(c3.60，CHCl3)，ee＝84％.1H NMRδ，3.40(br，s，1H，OH)；5.78(s，1H，CH)；7.14(m，1H，Ar-H)，7.24(td，1H，J1＝7.6Hz，J2＝1.1Hz，Ar-H)，7.43(m，1H，Ar-H)；7.62(td，1H，J1＝7.5Hz，J2＝1.8Hz，Ar-H).19F-NMR(CDCl3/TFA，δppm)-41.02(m，Ar-F).IR3412(w)，3080，2928，2255，1618，1592，1494，1460，1234，1043，759.MSm/z(强度％)151(M+，6)，12(M+-HCN，67)，123(M+-1-HCN，100)，109(18)，95(50)，75(20)，70(8)，50(12).HRMSC8H6FNO实测值151.0417，计算值151.0434.(R)-2-羟基-2-(3，4-三氟代苯基)乙腈无色油状液体。[α]D20+22.5(c2.55，CHCl3)，ee＝84.3％.1H NMRδ，3.00(br，s，1H，OH)；5.54(s，1H，CH)；7.27(m，3H，Ar-H).19F-NMR(CDCl3/TFA，δppm)-58.3(m，Ar-F).IR3412(w)，3086，2928，2254(CN)，1616，1522，1438，1289，1120，1042，875，825，772.MSm/z(强度％)170(M++1，5)，169(M+，49)，158(3)，152(24)，142(74)，141(100)，123(26)，114(26)，113(67)，63(35).元素分析C8H5F2NO计算值C56.81；H2.98；N，8.28.实测值C57.02；H3.14；N8.16.(R)-2-羟基-2-(2，3-二氟代苯基)乙腈无色油状液体。[α]D20+10.7(c 3.50，CHCl3)，ee＝46.1％.1H NMRδ，3.25(br，s，1H，OH)；5.81(s，1H，CH)；7.17-7.23(m，2H，Ar-H)；7.42(m，1H，Ar-H).19F-NMR(CDCl3/TFA，δppm)-59.50(m，1F，Ar-F)；-65.68(m，1F，Ar-F).IR3413，2930，2250，1629，1602，1494，1408，1286，1046，794，759.MSm/z(强度％)169(M+，53)，152(M+-OH，26)，143(M+-CN，100)，141(M+-1-HCN，50)，123(40)，115(12)，114(15)，63(20).HRMSC8H5F2NO-H+实测值168.0288，计算值168.0261.(R)-2-羟基-2-(2，5-二氟代苯基)乙腈无色油状液体。[α]D20+6.7(c1.90，CHCl3)，ee＝41％.1H NMRδ，3.37(d，1H，J＝6.4Hz，OH)；5.77(d，1H，J＝6.4Hz，CH)；7.12(m，2H，Ar-H)；7.35(m，1H，Ar-H).19F-MR(CDCl3/TFA，δppm)-39.34(m，1F，Ar-F)；-46.73(m，1F，Ar-F).IR3437(w)，3092，2910，2254，1491，1437，1404，1187，1135，1063，877，817，799，745.MSm/z(强度％)170(M++1，6)，169(M+，61)，1 52(M+-OH，27)，149(30)，142(80)，141(100)，125(19)，123(59)，115(21)，114(31)，113(57)，95(20)，63(40).元素分析C8H5F2NO计算值C，56.81；H，2.98，N，8.28.实测值C，57.00；H，2.96；N，8.45.HRMSC8H5F2NO计算值169.0313，实测值169.0340.(R)-2-羟基-2-(3，4，5-三氟代苯基)乙腈无色油状液体[α]D20+28.90(C，1.50，CHCl3)，ee＝59％1H NMRδ，3.10(br，s，1H，OH)；5.65(s，1H，CH)；7.15(s，2H，Ar-H).19F-NMR(CDCl3/TFA，δppm)-58.6(m，2F，Ar-F)；-49.5(m，1F，Ar-F).IR3415，2931，2248，1610，1545，1428，1400，1280，1042，810，796，760.元素分析C8H4F3NO实测值C51.08％，H2.12％，N7.28％；计算值C51.34％，H2.14％，N7.49％.(R)-2-羟基-2-五氟代苯基乙腈无色晶体。m.p.55-56℃.[α]D18+10(c0.655，CHCl3)，ee＝35％.1H NMRδ，3.95(s，1H，OH)；5.83(s，1H，CH).19F-NMR(CDCl3/TFA，δppm)-82.5(m，2F，F-Ar)；-72.3(t，1F，F-Ar)；-64.7(m，2F，F-Ar).IR3494，2953，2266，1660，1515，1137，1052，1002，894，787，658cm-1.MSm/z(强度％)224(M++1，12)，223(M+，100)，206(78)，203(31)，197(43)，196(32)，195(43)，177(41)，168(20)，167(21)，149(10)，117(23)，99(19)，56(7)，43(0.8).元素分析C8H2F5NO计算值C43.05；H0.90；N6.28.实测值C42.97；H0.82；N6.12.
权利要求
1.一种用醇腈裂解酶催化醛或酮与氰或腈化合物反应制备手性氰醇化合物的方法，其特征是所述的醇腈裂解酶是以桃仁、枇杷仁或大巢菜种子为酶源。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的醇腈裂解酶是由桃仁、枇杷仁或大巢菜种子经破碎、有机溶剂脱酯处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的桃仁、枇杷仁或大巢菜种子经破碎，由水溶性溶剂浸出或提取再浓缩，或者浸出或提取液经透析、凝胶柱层析或离子交换分离后再浓缩而制得。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的用于脱脂的有机溶剂是低碳链的酯、醚、酮或醇、芳烃、取代芳烃、烷烃、卤代烷或二甲基甲酰胺。
5.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的水溶性溶剂可以是pH3-6.5的无机或有机盐水溶液或上述溶液与水溶性有机溶剂的混合液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述的无机或有机水溶液是磷酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或咪唑-盐酸缓冲液。
7.如权利要求1所述的一种醇腈裂解酶催化醛或酮与氰化合物或氰醇化合物反应制备手性氰醇化合物的方法，其特征是所述的醛或酮具有如下分子式R1COR2，氰化合物或氰醇化合物具有分子式，其中R1＝R4Ph-、R4OPh-、R4OCH2Ph-、
PhCH＝CH、R5CH＝CH，
R5、
R2＝H，C1-3的烷基，R3＝H、(CH3)2COH或HCOH，R4＝H，C1-4的烷基，X＝O或S，R5＝C1-8的烷基，R6＝H，C1-4的烷基、
或CH3OCH2-。
8.如权利要求2所述的一种醇腈裂解酶催化醛或酮与氰化合物或氰醇化合物反应制备手性氰醇化合物的方法，其特征是所述的醛或酮与R3CN摩尔比为1∶0.8-20，粗醇腈裂解酶与醛重量比为1∶0.001-200，在0-45℃时反应，0.05-48小时，反应体系中含0-10％的水。
全文摘要
本发明涉及一种醇腈裂解酶催化羰基化合物与氰或腈化合物反应生成手性(R)－氰醇化合物的方法,所述的醇腈裂解酶系由桃仁、枇杷仁或大巢菜种子作为酶源。
文档编号C12P13/00GK1243880SQ9911388
公开日2000年2月9日 申请日期1999年7月16日 优先权日1999年7月16日
发明者林国强, 韩世清, 李祖义 申请人:中国科学院上海有机化学研究所