专利名称：：卡拉胶和葡甘露聚糖复配的固定化细胞载体的制作方法
技术领域：
：本发明属于生化领域的生物催化剂固定化技术。无论是传统的发酵工业，如酒精、啤酒、酸奶等生产，还是利用生化反应制备原本由传统化工生产的化学品，其所使用的生物催化剂(微生物或直接利用酶)，新工艺往往是采用固定化细胞技术的。固定化细胞所使用的载体，主要是卡拉胶、海藻酸钠、某些人工合成的高分子(聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等)，合成胶往往对细胞有毒性，海藻酸钠固化时需用高价金属离子，许多反应体系不能使用。卡拉胶又名鹿角菜胶、角叉菜胶，是一类从海洋红藻中提取的海藻多糖，其化学结构为D-半乳糖和3，6-脱水-D-半乳糖残基所组成的线性多糖化合物，残基上带有半酯式硫酸盐基团。依硫酸盐基团的排列位置和数量的不同，大体上可分为κ-型、ι-型、λ-型三大类，其中κ-型能形成较强凝胶。κ-型卡拉胶以其固化成型方便、对微生物毒性小、细胞回收利用方便等得到了一定程度的应用，但普通κ-型卡拉胶阳离子部分主要是K+，凝固点偏高(40-50℃)，该温度对许多细胞活性有不利影响。有的使用卡拉胶的反应体系，为降低载体凝固，不得不加入明胶、CMC，也大大降低了载体凝胶强度。本发明的目的在于提供一种凝固点低、凝胶强度较高的固定化细胞载体。本发明的技术方案是这样实现的卡拉胶和葡甘露聚糖复配的固定化细胞载体，其特征在于所述的固定化细胞载体为粉状，卡拉胶的重量百分比为40-90％，葡甘露聚糖的重量百分比为10-60％。本发明除具有普通κ-卡拉胶载体的优点外，还具有凝固点低的优点(凝固点≤37℃)，而且凝胶强度比普通κ-卡拉胶提高50-100％，有利于细胞的活性，且制备工艺简单，可广泛作为大肠杆菌、酵母菌、双杆菌及其它一些有益菌种的载体。下面对本发明作进一步的描述并给出实施例。本发明的卡拉胶和葡甘露聚糖进行粉碎、混合配制，通过实验发现，卡拉胶凝固点的高低受K+浓度影响很大。本发明使用的卡拉胶为K+含量低的Na+-型κ-卡拉胶，具有比普通κ-卡拉胶凝固点低的优点，葡甘露聚糖与卡拉胶有较强的协同作用，可使凝胶强度提高50％-100％。在两种组分的复配中，卡拉胶的含量占重量的40％-90％葡甘露聚糖的含量占重量的10-60％时，两者协同作用最强，可使组合物凝胶强度最大。本发明中的组合物由两种组分用普通机械方法均匀混合制得，所需颗粒大小可根据需要确定，一般为80-120目左右。本载体可以下述方法使用(以最为常用的包埋法为例)1、将3克载体置于100ml去离子水中，加热到80℃以上完全溶解。2、将溶解后的载体冷却至所需温度，加入菌体。3、将含菌体的液体滴入2-3％KCl溶液中，即成光滑的小球，半小时后即可使用。或将含菌体的液体倒入培养皿中，凝固后以2-3％KCl浸泡半小时，再切成小块使用。实施例实施例中所引用的配方，凝固点均≤37℃，凝胶强度均≥1800g/cm。实施例1以固定化重组大肠杆菌EscherichiacolsWSH-KEL制备谷胱甘肽。本实验所用载体为卡拉胶45％，葡甘露聚糖55％，反应液为ATP20mM/L，L-半胱氨酸20mM/L，L甘氨酸20mM/L，L-谷氨酸60mM/L，MgCl220mM/L，磷酸钾缓冲溶液50mM/L，PH7.5。分别以B、C两种方式处理菌体，并与未固定化的菌体做了对比，而且还对B、C两种方式进行了固定化细胞重复利用实验。A、离心收集菌体——10％甲苯溶液(PH7.0)处理30分钟——5mM磷酸钾缓冲溶液洗涤两次——秤取2克湿菌体——投入20ml反应液中，37℃，反应120分钟。B、离心收集菌体——10％甲苯溶液(PH7.0)处理30分钟——5mM磷酸钾缓冲溶液洗涤两次——秤取2克湿菌体与4克3％卡拉胶溶液混合，以2.5％KCl固化制得固定化细胞——将固定化细胞股入20ml反应液中，37℃，反应120分钟——取出反应液后用上述缓冲溶液洗涤两次——加入新鲜反应液20ml重复反应(B2)。C、离心收集菌体——秤取2克湿菌体与4克3％卡拉胶溶液混合，以2.5％KCl固化制得固定化细胞——10％甲苯溶液(PH7.0)处理30分钟——5mM磷酸钾缓冲溶液洗涤两次——将固定化细胞投入20ml反应液中，37℃，反应120分钟——取出反应液后用上述缓冲溶液洗涤两次——加入新鲜反应液20ml重复反应(C2)。实验结果列表如下由实验结果可见，固定化细胞的反应活性在第一次使用时略低于不固定化的，但可重复使用，且可保持反应活性。实施例2固定化酵母制备酒精该实施例的酵母经斜面活化、种子培养、发酵培养固定化载体采用卡拉胶70％，葡甘露聚糖30％复配、离心分离得湿菌体，按下列步骤操作1、2.5克载体+100ml水，80℃保温至全溶，保持40℃；2、加入10克湿菌体混合均匀，以针筒滴入2.5％KCl溶液中，固化1小时；3、以5克固定化菌体接入100ml发酵培养基，28℃，48小时；4、以2％种子菌悬液接入100ml发酵培养基，28℃，48小时。实验结果</tables>可见，酵母经固定化后，仍可增殖及代谢产生酒精。实施例3固定化双歧杆菌厌氧增殖产酸该实施例固定化载体采用卡拉胶85％，葡甘露聚糖15％复配。双歧杆菌经种子活化、种子培养、发酵培养、离心分离得湿菌体，按下列步骤操作1、2.5克载体+100ml水，80℃保温至全溶，保持40℃；2、加入10克湿菌体混合均匀，以针筒滴入2.5％KCl溶液中，固化1小时；3、以2克固定化菌体接入50ml厌氧培养基，37℃，48小时；4、以2％菌悬体接入50ml厌氧培养基，37℃，48小时。实验结果</tables>可见，双歧杆菌经固定化后，厌氧培养仍可增殖及代谢。权利要求1.卡拉胶和葡甘露聚糖复配的固定化细胞载体，其特征在于所述的固定化细胞载体为粉状，卡拉胶的重量百分比为40-90％，葡甘露聚糖的重量百分比为10-60％。2.按权利要求1所述的卡拉胶和葡甘露聚糖复配的固定化细胞载体，其特征在于卡拉胶为K+含量低的Na+-型κ-卡拉胶。全文摘要本发明公开了一种以卡拉胶和葡甘露聚糖复配的固定化细胞载体,其特征为:所述的固定化细胞载体为粉状,卡拉胶的重量百分比为40—90%,葡甘露聚糖的重量百分比为10—60%,本发明可广泛用于生化发酵工业,除具有普通k－卡拉胶载体的优点外,还具有凝固点低的优点(≤37℃),而且凝胶强度比普通k—卡拉胶提高50—100%,有利于细胞的活性。文档编号C12N11/00GK1275619SQ99113758公开日2000年12月6日申请日期1999年6月1日优先权日1999年6月1日发明者陈卫东,张士楚申请人:上海大众凌伟生化股份有限公司