专利名称：一种产红霉素b的糖多孢红霉菌突变体的构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术，具体是一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体 的构建方法。
技术背景红霉素A (erythromycin A， ErA)是广泛用于临床的广谱大环内酯类抗生素， 由革兰氏阳性菌糖多孢红霉菌产生，红霉素A的生物合成基因成簇存在于染色 体上，合成途径可以分为两大部分红霉素母核6-脱氧-红霉内酯 B(6-deoxy-erythronolide B, 6-dEB)的合成和6-dEB的后修饰。前者由聚酮合 成酶复合体(PKS)催化完成，后者包括6-dEB在C-6位羟基化及在C-3位和C 一5位羟基糖基化形成红霉素D等修饰步骤。*糖多孢红霉菌中的红霉素C-12羟化酶EryK是一个细胞色素P450单加氧酶， 负责ErD或红霉素B的C-12位点特异性羟基化修饰。虽然EryK能催化ErB的 羟基化合成ErA，但在糖多孢红霉菌中生物合成最佳路径是经ErD氧化到红霉素 C再合成ErA,其在动力学上比ErD经ErB途径高1200—1900倍。在目前被发 现的放线菌抗生素生物合成过程中，很多中间产物会被P450单加氧酶羟基化。 随着越来越多生物基因组测序完成，对放线菌细胞色素P450单加氧酶家族的认 识也愈加深入。最近在糖多孢红霉菌中通过基因操作改变聚酮合成的后修饰步 骤，特别是P450单加氧酶催化步骤，合成了许多新的酮内酯类抗生素；以及通 过提高P450单加氧酶的酶活提高糖多孢红霉菌及其它菌株抗生素的工业产量。 为了研究逐渐增多的糖多孢红霉菌改造菌株，深入了解它们的P450单加氧酶也 变得越来越重要。本发明用染色体同源重组方法，将糖多孢红霉菌A226中e/丁, 关键氨基酸序列的DNA片段敲除，继而将P450单加氧酶EryK失活，为工业发 酵生产红霉素B提供了菌株，也为探讨P450单加氧酶EryK功能、酶学性质以 及用基因工程或化学修饰方法合成更多红霉素衍生物奠定了基础。 发明内容本发明的目的是提供一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法， 利用染色体同源重组的方法，将糖多孢红霉菌中e/jl关键氨基酸序列DNA片 段敲除，继而使P450单加氧酶EryK失活，为工业发酵生产红霉素B创造了条 件，也为探讨P450单加氧酶EryK功能、酶学性质以及用基因工程或化学修饰 方法合成更多红霉素衍生物奠定了基础。本发明的技术方案如下一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于利用基 因工程方法使得糖多孢红霉菌羟基化酶EryK基因删除，或删除包括有BC loop 氨基酸序列对应的DNA片段，或对EryK羟基化酶基因插入失活，得到主产红霉 素B的糖多孢红霉菌突变体。所述的一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于 先用重叠PCR从糖多孢红霉菌基因组中，扩增出羟基化酶EiyK中BC loop氨 基酸序列缺失所对应的基因DNA片段，将其连到质粒pWHM3上构建成 重组质粒，再将重组质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组， 筛选出EryK BC loop氨基酸对应DNA序列缺失的糖多孢红霉菌突变体，其发酵 主产物为红霉素B。所述的一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于所 述的删除或插入失活方法是指下列方法之一(1)先用重叠PCR从糖多孢红霉 菌基因组中扩增出羟基化酶基因e/ji缺失或部分缺失的DNA片段，将其连到 质粒pWHM3上构建成重组质粒，再将重组质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其 发生染色体同源重组，筛选出eo^基因删除或缺失的糖多孢红霉菌突变体，其 发酵主产物为红霉素B; (2)使用PCR方法扩增出EryK羟基化酶基因eiji全 部或部分DNA片段，将其连到质粒pWHM3上，构建成重组质粒，再将重组质 粒转化到糖多孢红霉菌中，使其插入羟基化酶基因e/ji上，使其表达的羟基化 酶失活，所构建的孢红霉菌突变体，其发酵主产物为红霉素B。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，用重叠PCR方法扩增出去除羟 基化酶EryK BC loop基因序列中101bp，克隆于同源重组质粒pWHM3，构建 了同源重组质粒pWHM3-Jeiji。 PEG介导原生质体转化法将pWHM3-Jeo^ 转入糖多孢红霉菌A226，通过同源重组整合到红霉素合成基因位点上。整合体在无抗R3M斜面培养基上连续生长三代后，制备原生质体涂R3M平板。利用 薄层层析、PCR和质谱方法检测筛选出一株e/jJT基因失活的糖多孢红霉菌突变 体AK17,此突变体主要积累红霉素B产物，而不再合成红霉素A。
图1 : pUC18- d e/yf质粒的鉴定1. pUC18-」e/丁J质粒^boRI和W/ din酶切产物；2. DNA标志物图2:整合体A226 Kl的PCR鉴定1. DNA标志物；2.整合体A226K1的PCR产物图3 : 突变体AK17的发酵产物薄层层析1.A226的发酵产物；2.红霉素A标准品；3.AK17的发酵产物图4 :突变体AK17基因组的PCR鉴定1. DNA标志物；2. AK17基因组的PCR产物；3. A226基因组的PCR产物图5:突变体AK17与A226基因组部分序列比较图6:突变体AK17的发酵产物的质谱图具体实施方式
1.材料和方法 1.1菌种和质粒大肠杆菌DH5a、大肠杆菌ET12567、糖多孢红霉菌A226、质粒pUC18、 质粒pWHM3。 1.2培养基、缓冲液和试剂LB培养基、TSB培养基、R3M培养基、PEG3350-T缓冲液、改进P缓冲液、 硫链丝菌肽、蛋白酶K、溶菌酶、EctfRI和^/wdni限制性内切酶、T4 DNA连接 酶、质粒纯化试剂盒、PCR纯化试剂盒、PfuDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶。 1.3糖多孢红霉菌的培养和基因组DNA提取 1.4大肠杆菌培养、质粒酶切、连接及转化 1.5 PCR引物的设计为将红霉菌羟基化酶基因eo^失活，用重叠PCR将其中间101个碱基敲 除，PCR扩增出的DNA片段(命名为Je/yJO，突变区域上游899bp与下游917bp 与EryK酶域及邻近DNA序列相同。PCR引物为Jei^T上游片段 正向引物P1:5' -gCgA47TCggCTTCgCCgTTCgggAggTg斜体为^^RI位点 反向引物P2:5' -CACgATgTTgCCgAgCAggAC碟TCgT能TCgTCgCC鹏ATCggCgCJe/^TF游片段正向引物P3:5' -gCgCCgATCCCggCgACgACCACgACCgTCCTgCTCggCAACATCgTg反向引物P4:5' -ATA4gCTrCATCgTCTCCgCCCggggCgTgCT斜体为H,"dIII位点糖多孢红霉菌AK17基因工程菌株鉴定引物正向引物PK1:5' —TTgACC ACCATCgACgAAgTTCCCggCATgg 反向引物PK2:5' -CTACgCCgACTgCCTCggCgAggAgCCCgCC根据硫链丝菌肽(Thio)抗性基因&r (GeneBank登录号AJ414669)设计一对鉴 定引物正向引物5' -ATgACTgAgTTggACACCATCgCA 反向弓l物5'-雜AAACgTTgAgAgACTCggTCTg1.6 4 e/y,片段的PCR扩增1.7糖多孢红霉菌A226原生质体制备和转化1.8糖多孢红霉菌pWHM3-Jei^JT质粒整合突变菌株的筛选1.9糖多孢红霉菌pWHM3-Jeo^T质粒整合体的PCR鉴定1. 10糖多孢红霉菌及突变体发酵液中红霉素及其衍生物的提取1.11糖多孢红霉菌及突变体发酵液中红霉素及其衍生物的薄层层析鉴定 1.12糖多孢红霉菌突变体发酵液中红霉素及其衍生物成分的质谱鉴定2. 结果与分析2.1 pUC18-de/jX质粒的构建及鉴定以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板，PCR先扩增出Jeo^上游片段和J^vJT 下游片段，再以这两个片段为模板，P1和P4为引物，用重叠PCR扩增出全长 1816bp的DNA片段JeiyJST，克隆到pUC18载体上构建了质粒pUC18-JeijJT。对质粒pUC18-Je/ji进行酶切鉴定(图l)和序列分析(略)，结果除设计被删除部分 外与GENEBANK报道序列完全一致。2.2 pWHM3-Je/j，JT质粒的构建将Je/jf用Ea RI和H/"dIII内切酶从pUC18-Je/jiiT酶切下来后，连于 pWHM3质粒相应酶切位点，转化大肠杆菌DH5a获得了pWHM3-々ijJT质粒。将 pWHM3-JeiyJr质粒转化大肠杆菌ET12567,得到无甲基化修饰的 pWHM3-Jei^质粒。2.3 pWHM3-Je/ji质粒的原生质体转化及整合体的筛选 糖多孢红霉菌A226制成原生质体后，用pWHM3-JeijJr质粒转化，在含30fig/ml Thio的R3M固体培养基上进行筛选。从转化平皿中挑250个菌落涂含 3(Hig/ml Thio的R3M斜面，有3个菌落可正常生长，提取其中一个菌株的基因组 DNA做模板,PCR扩增pWHM3上Thio抗性基因ter进行鉴定。0.8%琼脂糖凝胶电 泳结果显示，PCR产物位于768bp附近(图2)，说明pWHM3-Je/j《质粒已整合到 糖多孢红霉菌A226染色体上，该菌株命名为A226K1。 2.4糖多孢红霉菌AK17菌株的筛选质粒pWHM3-J jf在染色体上不稳定，在无抗生素选择压力时会自动经 染色体二次重组脱落。将糖多孢红霉菌A226在无抗生素R3M斜面上连续传两 代后，制得的原生质体不同稀释液涂无Thio的R3M平皿。从平皿中挑取179个 菌落，各连续涂含30 ix g/ml TWo的R3M斜面和无Thio的R3M斜面，其中有30 个菌落仅可以在无Thio的R3M斜面上生长，将此斜面所接种的5ml摇管发酵液 进行薄层层析鉴定。因ErA和ErC显蓝灰色，ErB显紫罗兰色，而结果只有第 17号菌落的发酵液显紫罗兰色(图3),证明其主要合成了 ErB。将筛选的17号菌株进行液体培养，提取基因组DNA，以PK1和PK2为引物进 行PCR扩增，在同样条件下以A226基因组为模版扩增，发现以17号菌株基因组 DNA为模板扩增的DNA片段较A226基因组为模板短约100bp(图4)。对PCR产物 直接进行序列分析，结果发现此菌株eo^序列中101个核苷酸已被敲除(图5)，该 菌株被命名为糖多孢红霉菌AK17。 2. 5糖多孢红霉菌突变体AK17发酵产物的鉴定将糖多孢红霉菌突变体AK17的200ml发酵液用乙酸乙酯萃取，水浴浓缩后用甲醇溶解后进行质谱分析(图6)，结果发现ErB和ErD的特征峰 718. 32m/z([ErB]H+)和704. 41m/z([ErD]H+)， 没有发现ErA的特征峰 734m/z([ErAlH+)， ErD特征峰714.41也非常弱，说明由于关键酶域被敲除，羟基 化酶EiyK完全丧失了其活性，也说明在糖多孢红霉菌AK17中绝大多数ErD转化 成了ErB。由此完成构建了糖多孢红霉菌AK17菌株，其主要合成产物为红霉素B。
权利要求
1、一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于利用基因工程方法使得糖多孢红霉菌羟基化酶EryK基因删除，或删除包括有BC loop氨基酸序列对应的DNA片段，或对EryK羟基化酶基因插入失活，得到主产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体。
2、 根据权利要求1所述的一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法， 其特征在于:先用重叠PCR从糖多孢红霉菌基因组中，扩增出羟基化酶EryK 中BC loop氨基酸序列缺失所对应的e/ji基因DNA片段，将其连到质粒 pWHM3上构建成重组质粒，再将重组质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发 生染色体同源重组，筛选出EryK BC lo叩氨基酸对应DNA序列缺失的糖多 孢红霉菌突变体，其发酵主产物为红霉素B。
3、 根据权利要求1所述的一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法， 其特征在于所述的删除或插入失活方法是指下列方法之一(1)先用重叠 PCR从糖多孢红霉菌基因组中扩增出羟基化酶基因缺失或部分缺失的 DNA片段，将其连到质粒pWHM3上构建成重组质粒，再将重组质粒转化 到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组，筛选出《^T基因删除或缺失 的糖多孢红霉菌突变体，其发酵主产物为红霉素B; (2)使用PCR方法扩 增出EryK羟基化酶基因eijir全部或部分DM片段，将其连到质粒pWHM3 上，构建成重组质粒，再将重组质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其插入羟基 化酶基因^3^上，使其表达的羟基化酶失活，所构建的孢红霉菌突变体，其 发酵主产物为红霉素B。
全文摘要
本发明公开了一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法。利用染色体同源重组技术，将糖多孢红霉菌中羟基化酶基因eryK中101个碱基(GeneBank no.NC_009142，779246-779346)敲除，其对应的EryK羟基化酶失活，利用薄层层析、PCR和质谱方法鉴定，筛选出一株eryK基因失活的糖多孢红霉菌突变体，此突变体主要积累发酵产物红霉素B，而不再合成红霉素A。
文档编号C12N15/09GK101215557SQ200810019009
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月8日 优先权日2008年1月8日
发明者张部昌, 皓 赵 申请人:安徽大学