专利名称：一种制备重组耐热β-葡萄糖醛酸酶的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、酶学、生物信息学以及基因工程等领域。具体涉及用pHsh表达系统制备重组耐热e -葡萄糖醛酸酶，以及应用重组耐热e -葡萄糖醛酸酶制备甘草次酸的方法。
背景技术：
e-葡萄糖醛酸酶降解甘草酸产生甘草次酸或者单葡萄糖醛酸甘草次酸(Takashi K. Microbial production of glycyrrhetic acid 3-0-mono-卩-D-glucuronide from glycyrrhizin by cryptococcus magnus MG-27.Biosci Biotech Biochem, 1994, 58: 455-458)。国内外学者对于e-葡萄糖醛酸酶的研究注重于(1)甘草酸到甘草 次酸或者单葡萄糖醛酸甘草次酸的转化途径的研究，以及甘草酸、甘草次酸的药 理及其生理功能；(2)对e-葡萄糖醛酸酶在肿瘤、癌症中作用机理的研究，或 在植物中作报告基因的研究，有些学者克隆该酶基因传染真核生物，获得高酶活 的表达(冯世江,定向合成GAMG的菌株筛选及其催化特性的研究.石河子大学硕 士学位论文,2006)。目前，以P-葡萄糖醛酸酶作为生物催化剂为目的的研究较 少，研究报道仅见于鱼红闪，吴少杰，冯世江，李春研究组和TakashiKuramoto， TaikoAkao等国内外学者。但是这些研究中所选用的基因都来自常温生长的微生 物，所产生的酶热稳定性低，使用寿命短，不利于工业化应用。海栖热袍菌(77 e^ra om^ 7H3ri"y^)是一种生长在55 9(TC的海底火山口 附近、严格厌氧的细菌。海栖热袍菌产生的e-葡萄糖醛酸酶(GenBankNO. NC—000853)具有很好的热稳定性(RoberH， Thomas L, Helmut a/. 7Tze "wc^oga mafnY/Twa sp.nov. represents a new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up 90 °C. Arch Microbiol' 1986,144 :324 - 333)，但 是来源于嗜热微生物的基因在大肠杆菌等常温菌中进行表达时表达水平通常较 低。HamzahM. Salleh等运用pET28a载体在大肠杆菌中对海栖热袍菌e _葡萄糖 醛酸酶基因进行表达，只能获得大约5 mg/L蛋白。因此，对于该酶的开发利用 至关重要的研究是采用高效率的热激载体进行基因表达，并对目标基因进行定点 诱变，从而获得高效低成本的制备方法。发明内容本发明的目的在于提供一种用pHsh表达系统制备重组耐热e-葡萄糖醛酸酶的方法。我们使用高效表达载体pHsh，对耐热P -葡萄糖醛酸酶基因进行高效表达，并通过基因定向改造改变mRNA的二级结构，实现了 P -葡萄糖醛酸酶基因在大肠杆菌中的高效表达。从而获得了产量高，成本低，易于纯化的生产重组耐热e-葡萄糖酸酸酶的方法。热激表达载体pHsh是由大肠杆菌sigma32因子识别和 调控的质g，通过热激诱导，可以避免使用化学诱导剂。具有本底表达底，重组 蛋白产量高的优点(Shao, Weilan, Huawei Wu， Jianjun Pei. A novel expression vector system regulated by cj32 and methods for using it to produce recombinant protein, US Patent Application No. 11/614,626 (Represented by BAKER Donelson))。所说的重组耐热e-葡萄糖醛酸酶的制备方法，其特征在于，用表达载体pHsh表达耐热e-葡萄糖醛酸酶基因或其突变体，得到重组耐热e-葡萄糖醛酸酶；具体方法步骤如下(1) 将耐热e -葡萄糖醛酸酶基因插入基因表达载体pHsh，构建成耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒pHsh-bg;(2) 对耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒pHsh-bg中的mRNA翻译起始区潜 在的二级结构进行在线分析，并通过基因诱变打破mRNA的茎环结构、降低自 由能，得到优化的重组质粒；(3) 用耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒或优化的耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒转化大肠杆菌获得基因工程菌，并在基因工程菌的生长过程中进行热激诱 导，使耐热f3-葡萄糖醛酸酶得到表达；(4) 收集细胞，破壁并离心获得粗酶液；(5) 对上述粗酶液中的重组酶进行纯化得到纯化的重组耐热e -葡萄糖醛酸酶。上述步骤(i)中所说的耐热e-葡萄糖醛酸酶基因，可以从海栖热袍菌中提取基因组DNA，通过PCR扩增获得。海栖热袍菌基因组的DNA的提取和PCR 扩增等基因操作均按《分子克隆手册》第三版上的标准方法进行(Sambrookand Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。上述步骤(2)中所述的基因诱变方法是对海栖热袍菌的e-葡萄糖醛酸酶的基因设计改变基因内部碱基的突变引物为，引物l: 5'-aggagatataaacatggtaaga ccgcaacgaaa-3，, 弓l斗勿2: 5，-tcttgtcaacaattaacaggtcattggatcatgg-3，,以耐实為P —葡萄糖醛酸酶表达质粒为模板进行定点诱变，得到优化的耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质 粒。上述步骤(3)中所述的大肠杆菌可以是大肠杆菌菌株K12或其衍生菌株， 大肠杆菌菌株K12的衍生菌株是JM109, BL21或DH5a等。上述步骤(4)中所述的纯化方法可以用超声波破碎细胞后，75'C处理lh， 离心得到的重组耐热P -葡萄糖醛酸酶。上述步骤(3)中所述的热激诱导方法参见专利文献中国发明专利 ZL200410065776.8。通过本发明方法得到的重组耐热e -葡萄糖醛酸酶应用于甘草次酸制备的方法是将重组耐热e-葡萄糖醛酸酶作为催化剂，催化甘草酸转化为甘草次酸的反应。本发明的方法具有以下优点(1) 本发明首次使用表达载体pHsh对耐热P-葡萄糖醛酸酶基因进行高效 表达,可获得高达280 mg/L蛋白。(2) 本发明中，耐热e-葡萄糖醛酸酶表达质粒可以在原位对基因进行定 点突变和定向改造，使mRNA的序列得到优化，从而进一步提高耐热e-葡萄糖 醛酸酶在pHsh中的表达水平。0 -葡萄糖醛酸酶的活性测定和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果表明经优化的耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒的表达水平提高30%。(3) 用本发明的方法生产耐热e-葡萄糖醛酸酶，能够收到产量高，成本 低，重组酶易于纯化，有利于工业化发酵等有益效果。
图1为重组耐热P -葡萄糖醛酸酶表达质粒pHsh-bg的结构示意图。图2为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，表明海栖热袍菌耐热e -葡萄糖醛酸酶在大肠杆菌中高效表达及经热处理达到的纯化效果。M:分子标记；1:空载pHsh表达载体；2:高效表达后的细胞提取液；3: 75'C热处理10 min后的酶液；4: 75'C热处理1 h后纯化的酶液。图3为标准品的高效液相色谱图，其中1为甘草酸标准品；2为甘草次酸标准品。图4为酶转化液的高效液相色谱图，其中2为酶法转化产生的甘草次酸。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员 通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。 应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范 围。在以下的实施例中，海栖热袍菌购于美国菌种保藏中心(货号ATCC43589)。 海栖热袍菌的培养见参考文献(Yu Jiang et al.， FEMS Microbiol Lett 2006， 259: 254-259 )。所用的质粒pHsh的来源或制备参见(Shao， Weilan， Huawei Wu， Jianjun Pei. A novel expression vector system regulated by a32 and methods for using it to produce recombinant protein, US Patent Application No. 11/614,626)。实施例中未详细描述的各禾中 过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列 出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例i:海栖热袍菌e-葡萄糖醛酸酶基因高效表达及应用(1) 按常规方法培养海栖热袍菌，从海栖热袍菌中提取基因组DNA;按照已知的耐热P-葡萄糖醛酸酶基因(GenBank NO. NC—000853)设计引物，以海 栖热袍菌的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，得到耐热e-葡 萄糖醛酸酶的原始基因；其中基因组DNA的提取和PCR扩增等基因操作按《分 子克隆手册》第三版上的标准方法进行(Sambrook and Russell， 2001, CSHLpress, Cold Spring Harbor, New York),引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成；基因操作所用的工具酶购自宝生物工程(大连)有限公司。对PCR扩增产 物和载体pHsh分别进行酶切和纯化后，用T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆 菌得到重组表达质粒pHsh-bg (图1)。(2) 对来源于海栖热袍菌的耐热3 -葡萄糖醛酸酶基因的mRNA翻译起始 区二级结构进行在线分析，通过定点突变和定向改造对其进行优化。以重组表达 质粒为模板设计的突变引物为弓I物1: 5 ， -aggagatata^catggtaagaccgcaacgaaa-3 ，, 弓I物2: 5 ，陽tcttgtcgac巡ttaacaggtcattggatcatgg-3 ，，其中，下划线表示突变位点。以重组表达质粒为模板进行定点诱变，得到优 化的耐热e-葡萄糖醛酸表达质粒，基因定点诱变方法可参照《分子克隆手册》第三版上的标准方法(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。(3) 基因表达用耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒或优化的耐热e -葡萄糖酸酸酶表达质粒转化大肠杆菌JM109,转化子转入含100ug/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养 基，37'C培养过夜后，按1 %转接到200 mL含100 ug/mL Amp的LB培养液中 继续培养。OD6()()达到0.8左右时，将菌种接入装有3 L含100 ug/mL Amp的 TB培养基的发酵罐A，于3(TC培养至OZ)6(K) 0.8左右，将发酵罐A中的培养液 注入装有1 L同样培养基的预热至42卩的发酵罐B中(热激方法参见专利文献: 中国发明专利ZL 200410065776.8)，继续培养9个小时左右。(4) 重组酶的纯化和分析 热激诱导表达完成后离心收集细胞，用50mM的Tris-HCl缓冲液重悬，用超声波破碎细胞后，75'c热处理ih，离心获得可溶性的重组耐热e-葡萄糖醛酸酶。P -葡萄糖醛酸酶的活性测定和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果(图2) 表明，经优化的耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒的表达水平提高30%。(5) 重组酶在甘草次酸制备中的应用将纯化过的重组耐热e -葡萄糖醛酸酶用作催化剂，将甘草酸水解为甘草次酸，反应条件为7(TC，反应使用的缓冲为pH 6.2咪唑邻苯二甲酸氢钾缓冲液。 结果如图3、图4所示，与现有酸碱水解的化学制备法相比，酶法制备甘草次酸 具有对环境友好，能耗低，可调控性强的优点。实施例2:重组耐热e-葡萄糖醛酸酶在甘草次酸制备中的应用，其步骤如下用纯化重组耐热p -葡萄糖醛酸酶催化从甘草酸到甘草次酸的水解反应，反应条件为60'C，反应使用的缓冲为pH 4.6磷酸缓冲液。实施例3:重组耐热P-葡萄糖醛酸酶在甘草次酸制备中的应用，其步骤如下用未纯化重组耐热0 -葡萄糖醛酸酶催化从甘草酸到甘草次酸的水解反应，反应条件为80'C，反应使用的缓冲为pH 7. 4咪唑邻苯二甲酸氢钾缓冲液。SEQUENCE LISTING <110>南京师范大学〈120〉一种制备重组耐热0 -葡萄糖醛酸酶的方法 <160>2<210>1 <211>33 <212>DNA <213>人工序列<400>1aggagatata aacatggtaa gaccgcaacg aaa 33<210>2 <211>34 <212>DNA <213>人工序列<400>2tcttgtcaac aattaacagg tcattggatc atgg3权利要求
1. 一种制备重组耐热β-葡萄糖醛酸酶的方法，其特征在于，用表达载体pHsh表达耐热β-葡萄糖醛酸酶基因或其突变体，得到重组耐热β-葡萄糖醛酸酶；具体方法步骤如下(1)将耐热β-葡萄糖醛酸酶基因插入基因表达载体pHsh，构建成耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒；(2)对耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒中的mRNA翻译起始区潜在的二级结构进行在线分析，并通过基因诱变打破mRNA的茎环结构、降低自由能，得到优化的重组质粒；(3)用耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒或优化的耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒转化大肠杆菌获得基因工程菌，并在基因工程菌的生长过程中进行热激诱导，使耐热β-葡萄糖醛酸酶得到超量表达；(4)收集细胞，破壁并离心获得粗酶液；(5)对上述粗酶液中的重组酶进行纯化得到纯化的重组耐热β-葡萄糖醛酸酶。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述步骤(1)中所说的耐 热p-葡萄糖醛酸酶基因，是从海栖热袍菌(T7zemzo/oga mw衍wa)中提取基因 组DNA，通过PCR扩增获得。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的基因诱变方法是对海栖热袍菌的e-葡萄糖醛酸酶的基因设计改变基因内部碱基的突变引物为，弓i物1: 5' -aggagatataaacatggtaagaccgcaacgaaa-3 ，， 弓i #勿2: 5 ， -tcttgtcaacaattaacaggtcattggatcatgg-3 ，，以耐热e -葡萄糖醛酸酶表达质粒为模板进行定点诱变，得到优化的耐热p -葡萄糖醛酸酶表达质粒。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的大肠杆 菌是大肠杆菌菌株K12或其衍生菌株。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，大肠杆菌菌株K12的衍生 菌株是JM109， BL21或DH5a。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的纯化方法是破碎细胞后，75-c处理ih，离心得到的重组耐热e-葡萄糖醛酸酶。
7. 权利要求i-6之一所述的方法，制备得到的重组耐热e-葡萄糖醛酸酶作为催化剂，催化甘草酸转化为甘草次酸的反应。
全文摘要
一种制备重组极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的方法，其制法是将耐热β-葡萄糖醛酸酶基因插入表达载体pHsh，转化大肠杆菌获得耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒；其次是对基因进行诱变，改变mRNA的二级结构，得到优化的耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒；然后将耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒或优化的耐热β-葡萄糖醛酸酶表达质粒转化大肠杆菌，得到基因工程菌，并通过热激诱导，使β-葡萄糖醛酸酶得到超量表达；最后收集细胞，破壁，离心后得到粗酶液，进一步纯化后得到纯酶。本发明首次使用表达载体pHsh对耐热β-葡萄糖醛酸酶的基因进行高效表达，并首次将重组的耐热β-葡萄糖醛酸酶应用于甘草次酸的制备。
文档编号C12P7/42GK101250539SQ20081001877
公开日2008年8月27日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者卓 王, 裴建军, 邵蔚蓝 申请人:南京师范大学