专利名称：一种利用全血直接扩增核酸的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种利用全血直接扩增核酸的方法。
背景技术：
PCR是一种利用DNA聚合酶将极微量的标本百亿倍甚至千亿倍扩大的现代技术，其起始模板通常是基因组DNA。基因组DNA主要来源于血液，需要对其进行提取，除了商品化试剂盒外，还有很多其他的提取方法，如酚/氯仿抽提法、碘化钾法、直接煮沸法、高盐沉淀法吴清敏，刘巧红，滕云，等.外周血提取DNA方法的比较.中华检验医学杂志，2004， 27 (7): 445-446等等。这些方法虽然有效，但是操作步骤繁琐，容易造成污染，而且基本上都需要用到恒温水浴锅、低温高速离心机等装置，对仪器设备和试剂的要求都比较多。如果不经过DNA提取而直接进行PCR，则可以大大节约实验时间和成本，同时也避免了因多步操作可能造成的样本间交叉污染。已有文献报道采用全血直接进行DNA扩增。如McCusker J.等人对一定量的全血标本95。C预处理15分钟，以降低血液中的PCR抑制成份对扩增的影响McCusker J, Dawson MT， Noone D，et al. Improved method for direct PCR amplification form whole blood. Nucleic AcidsResearch, 1992， 20(24): 6747-6755；Mercier B在全血扩增前利用3个循环的预变性程序来去除血液中的PCR抑制成分Mercier， B.， Gaucher, C, Feugeas, O., et al. Direct PCRfrom whole blood without DNA extraction. Nucleic Acids Research, 1990， 18(19):5908-5912等等。这些方法虽然以全血为起始模板直接扩增DNA，但操作不够简便，条件难以控制，重复性不好，不能形成商品化试剂盒，不利于推广使用，且相关研究未见后续进一步报道。 '发明目的
本发明的目的是提供一种利用全血直接扩增核酸的方法。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的
一种利用全血样本为起始材料直接进行核酸扩增的方法，包括取全血样本为起始材料，加入核酸扩增反应试剂，加入扩增目的基因所需引物，直接进行核酸扩增反应，测定扩增产物，其中扩增核酸反应试剂中的缓冲液的pH值在8.5-10.0之间，镁离子浓
度在1.5-3.0 mmol/L之间。
所述的方法，其中缓冲液的pH值为8.8-9.9，镁离子浓度为1.5-2.5 mmol/L。 所述的方法，其中直接是指不经过提取血液样本中的基因组DNA而进行核酸扩增反应。
所述的方法，其中全血是指液体血液或干血。
液体血液可以是加入抗凝剂的血液或不加抗凝剂的血液。干血可以是保存在固体载 体上的干血，如滤纸血、布料血等。
所述的方法，其中核酸扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增技术(RCA)、 链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)或依赖核酸序列的扩增(NASBA)。
所述的方法，其中缓冲液是指浓度为10-100mmol/L的三(羟甲基)氨基甲垸一盐 酸。缓冲液可用盐酸、苛性钠调节酸碱度。
液体全血样本直接加到扩增用反应管的底部，不对反应管进行任何搅动。
本发明的有益效果
由于通常采用PCR技术扩增核酸，这里以PCR扩增为例介绍扩增效果。跟普通基 因扩增反应一样，即在一只或多只PCR专用试管中，加入PCR扩增用试剂，除缓冲液 和扩增模板不同外，其余成分与普通PCR试剂完全相同。即要加入扩增引物，脱氧核 糖核酸，Taq聚合酶，0.5-5微升血液或小的含有干血的滤纸片。PCR缓冲液的pH值在 8.5-10.0之间，镁离子浓度在1.5-3.0 mmol/L之间，提供镁离子的物质可以是氯化镁或 醋酸镁。在普通PCR扩增仪器上完成循环扩增反应。可以进行多对引物的同时扩增， 即多重PCR反应。反应结束后，可以采用凝胶电泳法、芯片电泳法等分离方法测定扩 增产物。在本发明中，采用不同pH的PCR缓冲液进行扩增反应，结果表明，使用pH8.5 以上(pH 8.5-10.0)的PCR缓冲液能得特异性的PCR产物。
本发明一种利用液体全血和干血样本为起始材料，不经过提取血液样本中的基因组 DNA直接进行核酸扩增反应的方法，属于一种改进常规核酸扩增反应缓冲液直接进行 核酸扩增的方法，具体来说是一种通过提高缓冲液的pH值，并且通过调节缓冲液的镁 离子浓度来实现直接扩增。根据本发明，不经过核酸的分离和精制过程，从含有大量阻 碍核酸扩增物质的生物试料中高效率地放大目的核酸。本发明可以用于检测样本量微量 的全血样本。
图l以pH值不同的缓冲液进行全血PCR扩增所得扩增产物的电泳图谱.图A中的 泳道2、 3是以市售TaKaRa Taq PCR试剂盒中的缓冲液进行扩增(泳道1为338-bp的 DNA标记)；图B为以不同pH值的缓冲液进行扩增的结果，各泳道的pH分别为pH7.6S (泳道l)， pH8.23(泳道2)， pH8.60(泳道3)， pH8.80(泳道4)， pH9.10(泳道5), pH 9.27 (泳道6)，pH9.41(泳道7)，pH9.58(泳道8)，pH9.91(泳道9)'pH 10.33 (泳道10)。 图C为各pH值缓冲液所得扩增产物的相对产率。
图2缓冲液中不同镁离子浓度对扩增对影响。
图3采用全血扩增缓冲液与Tetra—PCR法测定与糖尿病相关的单碱基多态性位点结 果图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例l:不同pH值的PCR反应液对扩增效率的影响
1. 实验材料新鲜血样，分别用三种不同的抗凝剂(肝素钠、EDTA—2K、柠檬酸 钠)处理；基因组DNA，通过酚/氯仿抽提法提取；TaqDNA聚合酶、dNTPs (Promega, Madison ， USA );弓|物PI : 5，- CATCAGACTTTGACCGTA -3, ; P2 : 5'-AGAATTAGCAAGCTGCCA-3' (InvitrogenInc.， Shanghai, PAGE级)；琼脂糖(OXOID Ltd., Hampshire, England);凝胶电泳加样液和溴化乙锭(EB)均为生工生物公司产品。
仪器PCR扩增仪(PTC-225, MJ,美国)；电泳仪(PowerPac 1000， BIO-RAD， 美国)；芯片电泳仪(2100Bioanalyzer， Agilent,德国)；凝胶电泳成像仪(GeneGenius， SYNGENE，英国)；微量基因光谱测定仪(GeneSpecIII， NaKaInstrument,日本)。
2. 实验方法在PCR反应液(50.0 中，加入l pl经抗凝固剂处理的人血液， 进行PCR。 PCR的引物为PI和P2， PCR扩增产物应该为338bp，为IL1B基因片段 的扩增产物。
扩增反应67mmol/LTris-HCl缓冲液(pH为7.68-10.33之间)，2 mmol/L MgCl2， 200 nmol/LdNTP混合物，0.05 U/|al Taq DNA聚合酶。加入引物(各1.0pmol/L)， 1 ^ 抗凝血。放入PCR仪中，96°C， 3min; (96°C， 30 sec; 58°C, 60 sec; 72°C， 1 min) 40个循环；72°C, 7min; 4'C保存。PCR结束后，用PCR结束后的反应液3^1，在2% 凝胶，0.5昭/ml ETBr， TAE (40mM Tris-acetate, lmM EDTA, pH8.0)液中进行电泳(100V 电泳5min)。
3. 实验结果见图l。图1A中的泳道2、 3是以市售TaKaRaTaqPCR试剂盒中的缓冲液进行扩增的电泳结果(泳道1为338-bp的DNA标记)；图1B为以不同pH值(pH 为7.68-10.33之间)的缓冲液进行PCR扩增的结果，各泳道的pH值分别为pH 7.68 (泳 道l)， pH8.23(泳道2)， pH8.60(泳道3), pH 8.80 (泳道4)， pH9.10(泳道5)， pH 9.27 (泳道6)， pH9.41(泳道7)， pH9.58(泳道8)， pH9.91(泳道9)， pH 10,33 (泳道10)。 图C为各pH值缓冲液所得扩增产物的相对产率。由图可知，采用常规的PCR缓冲液， 得不到全血PCR扩增产物，但当PCR缓冲液的pH值在8.80-9.91之间时，可以得到清 楚的扩增条带，从图C中的扩增产率可以得出缓冲液的最佳pH值为9.1-9.6之间。
实施例2:缓冲液中不同镁离子浓度对扩增对影响。
实验方法在PCR反应液(50.0pl)中，加入1 ^经抗凝固剂处理的人血液，进行四 重PCR反应，含有四对PCR引物第一对为5'- CAGGCAGGACAGCTTAAAAG -3'， 5，-ACTGTGGCAAAGTTGCTTTC-3'(扩增产物长度为109bp );第二对为5，-CATTCATCTTCCCTTTTGAAGG-3'， 5，-ATGCAAGTCACAGGAAATCT-3，(扩增产物 长度为201bp ); 第三对为 5，-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3， ， 5，-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3，(扩增产物长度为301bp );第四对为5'-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'， 5，-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3'(扩增产物长 度为472bp)。
扩增反应67腿ol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.1)， 1.5-5匪ol/L MgCl2， 200 pmol/L dNTP混合物，0.05 U/nl Promega—Taq DNA聚合酶。加入上述引物(各1.0nmol/L)， 1^1抗凝血。放入PCR仪中，96°C， 3min; (96°C， 30 sec; 58°C， 60 sec; 72。C， 1 min) 40个循环；72°C， 7min; 4'C保存。PCR结束后，用PCR结束后的反应液3|il，在2% 凝胶，0.5吗/mlETBr， TAE (40mM Tris-acetate, ImM EDTA, pH8.0)液中进行电泳(100V 电泳5min)。
测定结果如图2所示，表明镁离子浓度在1.5-3.0之间可以得到较好的扩增结果。
实施例3:与糖尿病相关的单碱基多态性的测定 1.实验材料
釆用新鲜血样制备抗凝血和滤纸干血，同时提取基因组DNA; TaqDNA聚合酶和 dNTPs (P讓ega， Madison, USA);外引物PO-1: 5'-ttg tag cca aag aca ggttct g-3'; PO-2: 5'-gat ctt get tag ggt get ttg t-3';内弓l物PI-1: 5'-tgg ccc tct tct caa cct ata-3'; PI-2: 5'-atg taa
6ggttctgtgcaacgc-3' (Invitrogen Inc.， Shanghai, PAGE级)；其它材料同例1.
2. 实验方法
本例采用全血扩增技术和Tetra—PCR技术(Ye, S.， Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N., Nucleic Acids Res 2001， 29， E88-88.)相结合，在单管中测定PPARy基因的 C2821T位点的基因型。该技术同时采用四条引物在单管中进行PCR反应，两条外引物 扩增461-bp的片段，两条内引物的3'端分别与SNP位点的两个基因型对应，野生型产 生长度为225-bp的片段，突变型产生长度为277-bp的片段，如果为杂合子，两个片段 同时出现。
扩增反应67麵ol/LTris-HCl缓冲液(pH9.1)， 2mmoI/LMgCl2, 200 pmol/L dNTP 混合物，0.05 U/pl Promega—Taq DNA聚合酶。加入上述引物(各1.0 pmol/L)，分别加 入l )Lil抗凝血、200ng基因组DNA、 2.5mm2的滤纸干血。PCR循环96°C， 3 min; (96°C， 30sec; 58。C， 60sec; 72°C， 1 min) 35个循环;72°C, 7min; 4'C保存。PCR 结束后，釆用芯片电泳仪(200Bioanalyzer， Agilent,德国)电泳，根据图谱确定基因 型。
3. 实验结果如图3所示，三种扩增起始材料基因组DNA、抗凝血、滤纸血均得 出了相同的结果。待测样本为杂合子，凝胶电泳图谱中有三条PCR产物的条带， 一条 为外引物扩增产物(46i-bp)，在图中标为"P"; —条与野生型对应的225-bp片段，在 图中标记为"A"; —条与突变型对应的277-bp片段，在图中标记为"G"。因此采用 本发明的高pH缓冲液可以有效地扩增出目的片段，不需要预先分离其中的DNA。〈110>华东医学生物技术研究所
<120> —种利用全血直接扩增核酸的方法
〈160〉 14
〈210〉 1 〈211〉 18 <212〉 ■ 〈213>人工引物 〈400〉 1
catcagactt tgaccgta 18
<210> 2 <211〉 18 〈212〉 DNA <213>人工引物 <400> 2
agaattagca agctgcca 18
〈210> 3 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213>人工引物 〈400〉 3
caggcaggac agcttaaaag 20
〈210> 4 〈211〉 20 <212>腿 <213>人工引物 〈400〉 4
actgtggcaa agttgctttc 20
〈210〉 5 〈211〉 22 〈212〉腿 〈213>人工引物 〈400〉 5
cattcatctt cccttttgaa gg 22
<210〉 6 <211〉 20〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 6
atgcaagtca caggaaatct 20
〈210〉 7 〈211〉 20
<212> DNA ' 〈213〉人工引物 〈400〉 7
gtctgcctca ccataaaacg 20
〈210〉 8 〈211> 20 〈212〉腿 <213>人工引物 〈400〉 8
accactgcca aaactttcaa 20
〈210> 9 <211> 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 9
gaatattccc gctctccgga 20
〈210> 10 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213>人工引物 〈400〉 10
gctggtgctc cattcttgag 20
<210> 11 〈211> 22 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 11
ttgtagccaa agacaggttc tg 22
<210> 12 〈211〉 22 <212〉 DNA <213>人工引物
9〈400> 12
gatcttgctt agggtgcttt gt 22
〈210〉 13<211〉 21<212〉腿〈213〉人工引物〈400〉 13
tggccctctt ctcaacctat a 21
<210> 14〈211〉 21<212>脆〈213〉人工引物<400> 14
atgtaaggtt ctgtgcaacg c 2权利要求
1、一种利用全血样本为起始材料直接进行核酸扩增的方法，包括取全血样本为起始材料，加入核酸扩增反应试剂，加入扩增目的基因所需引物，直接进行核酸扩增反应，测定扩增产物，其特征在于扩增核酸反应试剂中的缓冲液的pH值在8.5-10.0之间，镁离子浓度在1.5-3.0mmol/L之间。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于缓冲液的pH值为8.8-9.9,镁离子 浓度为1.5-2.5 mmol/L。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于直接是指不经过提取血液样本中的基 因组DNA而进行核酸扩增反应。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于全血是指液体血液或干血。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于液体血液是指加入抗凝剂的血液或不 加抗凝剂的血液。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于核酸扩增反应是聚合酶链式反应、滚 环扩增技术、链替代扩增、连接酶链式反应或依赖核酸序列的扩增。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于缓冲液是指浓度为10-100mmol/L的三 (羟甲基)氨基甲烷-盐酸。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了一种利用全血直接扩增核酸的方法。该方法包括取全血样本为起始材料，加入核酸扩增反应试剂，加入扩增目的基因所需引物，直接进行核酸扩增反应，测定扩增产物，其特征在于扩增核酸反应试剂中的缓冲液的pH值在8.5-10.0之间，镁离子浓度在1.5-3.0mmol/L之间。根据本发明，不经过核酸的分离和精制过程，从含有大量阻碍核酸扩增物质的生物试料中高效率地放大目的核酸。本发明可以用于检测样本量微量的全血样本。
文档编号C12N15/10GK101492670SQ200810018710
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月21日 优先权日2008年1月21日 公开号200810018710.发明者周国华 申请人:华东医学生物技术研究所