一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法

专利名称：：一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法
技术领域：
一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物
技术领域：
。本发明通过多个Exendin-4多肽重复序列和人血清白蛋白的融合，在保持了Exendin-4的药理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。本发明涉及治疗非胰岛素依赖性糖尿病及肥胖症的长效药物的制备。技术背景促胰岛素分泌肽(Exendin-4)是一种刺激胰岛素分泌的肽激素，含39个氨基酸，早年是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥(Gilamonster)唾液中发现的一种激素物质，其氨基酸序列有53%与人类血液中调控血糖激素即胰高血糖素样肽-1(GLP-1)同源。该物质具有直接降血糖，促胰腺分泌胰岛素作用，是GLP-1受体(GLP-1R)的潜在激动剂；还可以通过减缓胃肠道的蠕动使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液内出现的高峰。同时，由于不被二肽基肽酶一IV(DPP-IV)降解，Exendin-4在人体内的半衰期为2-3小时，远长于GLP-1的1-2分钟，其稳定性和生物活性明显高于GLP-1，显示较GLP-1更好的治疗效果。目前人工合成的Exendin-4(Byetta)已被用于治疗II-型糖尿病患者。然而，由于它的分子量小，能被肾脏快速清除，患者还是需要每天注射两次才能获得满意的治疗效果，血清浓度变化很大，即使一天注射两次亦不能持续刺激GLP-1R，给患者带来诸多不便。Exendin-4展示了比GLP-1更强的降血糖效应，开发长效Exendin-4类药物将更有利于提高其治疗II型糖尿病的效果。药物研发人员正在尝试改变其分子结构，使药物在降糖的同时还能延长其在体内的持续效果。如Lilly公司采用基因工程方法将Exendin-4与免疫球蛋白(IgG)的Fc段融合；加拿大ConjuChem公司开发研制的Exendin-4与人血清白蛋白(Recombumin)在体外结合产生CJC-1134-PC;Exendin-4与聚乙二醇(PEG)以水解化学键融合的PEG40,000-FMS-Exendin-4。白蛋白是人血清中的主要蛋白组分，占血清总蛋白量的一半。人血清白蛋白由585个氨基酸组成，分子量为66KD。人血清白蛋白表现出多样性，有30种变异分子。人血清白蛋白基因已经被克隆(A.Drgaiczyketal，PNAS，79:71-75，1982)，并被成功地应用在多种体外表达系统中进行表达。人血清白蛋白生物学详细功能不详，但是其功能可能是多方面的。白蛋白在正常生理状况下不易透过肾小球，在血清中的半衰期达14-21天。白蛋白由于具有较长的半衰期，也可以作为一种载体通过与血液中的其它因子，包括生物活性蛋白的结合，从而保持或延长其它因子在体内的生物活性。将一些小分子肽或蛋白质药物与白蛋白进行融合是改进小分子蛋白或多肽药物半衰期的有效方法。与其它方法相比，构建长效白蛋白融合蛋白药物可以避免复杂的化学修饰和处理过程，因而具有容易操作和更好的经济性优势。白蛋白作为一种药物载体，在临床上己经获得了应用，如已成熟的长效白蛋白融合蛋白药物有胰岛素，人生长激素，白介素，干扰素。使用白蛋白作为载体，不仅可以延长药物的半衰期，使这些药物的治疗效果及药理特性获得明显的改善。利用基因工程技术，将白蛋白与具有生物活性的蛋白分子进行重组表达构建融合蛋白，已经成为开发长效蛋白药物的一个重要手段。
发明内容本发明的目的是提供一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白长效药物及其制备方法。本发明的目的还在于开发一类具有高活性、高稳定性、低副作用的降血糖药物，在保持Exendin-4的生理特性的基础上，延长其半衰期，使之成为新一代长效治疗糖尿病药物。本发明的技术方案一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白，含有2个多肽区，其l区由多个促胰岛素分泌肽Exendin-4重复序列组成，其2区是人血清白蛋白HSA，1区通过其C-末端与第2区的N-末端直接连接，或1区通过其N末端与2区的C-末端直接连接，中间不加入任何连接肽，其结构式是:(Exendin-4)n-HSA，n为Exendin-4多肽重复序列组成的重复次数，n为2-8。其Exendin-4氨基酸序列与序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性。其1区的优选结构为(Exendin-4)2，得到(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，该结构可以增强融合蛋白的生物活性。所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，其Exendin-4重复序列各个序列之间的连结方式为上一个Exendin-4的C末端与下一个Exendin-4的N末端直接连接，中间不加入任何连接肽。所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，2区多肽选自人血清白蛋白HSA，其氨基酸序列与序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性。所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其核苷酸序列编码为SEQIDNO:3。所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:4。所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其重组核苷酸序列插入在一种表达载体和细胞宿主系统。所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白的制备方法，包括转录，翻译，蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。所述(Exendin-4)n-HSA融合蛋白的应用，是使哺乳动物血糖水平正常化，用于制备非胰岛素依赖性糖尿病及肥胖者的治疗制剂。本发明采用基因工程技术，制备促胰岛素分泌肽融合蛋白长效蛋白质药物,其长效方案包括一是该融合蛋白中含有Exendin-4重复序列(Exendin-4)n;二是该融合蛋白含有在人血液中具有长半衰期的人血清白蛋白HSA肽段。通过生化以及细胞和动物实验验证，(Exendin-4)n-HSA融合蛋白比Exendin-4药物具有更好的稳定性和体内半衰期。本发明中的Exendin-4氨基酸序列是为39个氨基酸，与序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性，优选同源性是95%。其中可以有多种氨基酸位点的替代，目的是使该活性肽更稳定，活性更高。本发明中的HSA氨基酸序列与序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性，优选同源性是95%。其中可以有多种氨基酸位点的替代，目的是使该活性肽更稳定，活性更高。本发明提供一种人血清白蛋白HSA与多个Exendin-4多肽重复序列所形成的融合蛋白活性分子。该融合蛋白是由HSA与Exendin-4化合物直接连接而成，中间不加入任何连接肽。连接方式可以是以Exendin-4多肽的C-末端直接连接在HSA多肽的N-末端，即(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，也可以是以Exendin-4多肽的N-末端直接连接在HSA多肽的C-末端，即HSA-(Exendin-4)n。优选连接方式是(Exendin-4)n-HSA。Exendin-4多肽重复序列的衔接方式为，其中的每一个Exendin-4单体均直接以同一方向排列。具体地，每一个Exendin-4多肽单体的N-末端直接连接在上一个多肽Exendin-4多肽单体的C-末端；每一个Exendin-4多肽单体的C-末端直接连接在下一个Exendin-4多肽单体的N-末端，其结构式为(Exendin-4)n。其中Exendin-4多肽单体的重复数为2-8，优选的重复数为2，表示为(Exendin-4)2，该结构可以增强融合蛋白的生物活性。(Exendin-4)2与HSA融合形成的融合蛋白表示为(Exendin-4)rHSA。本发明为了使获得表达的融合蛋白正确折叠,并且能够进行外分泌，(Exendin-4)rHSA融合蛋白的N-末端连接有信号肽。具体地，在进行(Exendin-4)2基因合成时在其上游5'端加上HSA的信号肽，并使其与(Exendin-4)2进行框内融合。编码该信号肽的核苷酸序列atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcga。本发明优选的质粒是pYES3/CT，适合在酵母工程菌中表达。但是，本发明中的融合蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。具体地，该表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述启动子GALl,优选的启动子为GALl。本发明为使表达的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白不带有任何本融合蛋白以外氨基酸残基，在HSA基因的3'未端加入终止密码子，使融合蛋白转译过程中不会带上表达载体上的任何成份。本发明提供构建上述优选的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。首先克隆获得一重组多聚核苷酸序列，该序列含有编码HSA多肽区的核苷酸序列区和编码Exendin-4多肽区的核苷酸序列区。编码HSA多肽区的氨基酸序列与序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性。编码Exendin-4多肽区的氨基酸序列与序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性。具体地，通过PCR技术，从人胎肝来源的RNA中反转录获得编码HSA多肽区的核苷酸序列，并使HSA基因的5邻3'端分别带有&m/fl、的酶切位点，将HSA片段插入到TA克隆载体pCR2.1(购自Invitrogen公司)中，获得HSA/pCR2.1重组质粒。编码HSA信号肽(Sig)和(Exendin-4)2多肽区的核苷酸序列通过人工合成，获得Sig-(EXendin-4)2，并在其5'端带有^wz//1酶切位点，3'端带有C/al酶切位点。将Sig-(Exendin-4)2片段插入到TA克隆载体pCR2.1中，获得Sig-(Exendin-4VpCR2.1重组质粒。使用限制性内切酶S"m//1、C7al对重组质粒Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1进行酶切，制备Sig-(Exendin-4)2DNA片段；使用限制性内切酶Sam/H和Ctol对重组质粒HSA/pCR2.1进行酶切，制备线性化的HSA/pCR2.1质粒DNA(不含有HSA信号肽)；将Sig-(Exendin-4)2DNA片段与线性化的HSA/pCR2.1质粒DNA连结，产生含有Sig-(Exendin-4)2-HSA融合基因的重组表达质粒EXHSA/pCR2.1。将该重组表达质粒转化到大肠杆菌DH5a，再转种到含有氨苄青霉素(AMP)的LB平板进行繁殖和保种。用限制性内切酶5am/fl、￡coil同时切割重组质粒EXHSA/pCR2.1和表达质粒pYES3/CT(购自Invitrogen公司)，分别制备Sig-(Exendin-4)2-HSA融合基因片段和线性化pYES3/CT质粒片段；将纯化的Sig-(EXendin-4)2-HSA融合基因片段和线性化pYES3/CT质粒片段用T4DNA连结酶进行连结，构建能表达(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的重组表达质粒EXHSA-pYES3/CT，将该重组表达质粒转化到大肠杆菌DH5a，再转种到含有氨苄青霉素(AMP)的LB平板进行繁殖和保种。本发明表达(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的重组质粒EXHSA-pYES3/CT可在多种酵母菌中表达，其优选的酵母菌是酿酒酵母，其优选菌株是INVScl(购自Invitrogen公司)。本发明提供一种工程菌大规模发酵表达(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的方法。具体地，将含有重组表达质粒EXHSA-pYES3/CT的单个酵母菌(INVScl)菌落接种到选择性培养基SCTip—(酵母基本氮源YNB0.67%，葡萄糖2%，省却营养物的氨基酸等混合物见附录)中，3(TC振摇过夜。计算获得50ml诱导培养基OD6。(T0.4所需要过夜培养物的总量。离心收集菌体沉淀，并用诱导培养基(酵母基本氮源YNB0.67%,半乳糖2%,棉籽糖1%，省却营养物的氨基酸等混合物见附录)悬浮，并转种到诱导培养基中发酵，3(TC振摇培养24h，离心收集发酵上清液，-S(TC保存用于融合蛋白表达的分析和纯化。融合蛋白的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于SDS-PAGE，Westernblotting等。本发明也提供一种(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的分离纯化方法。具体地，该分离纯化方法利用了(Exendin-4)2-HSA的等电点pH5.5左右的特点，选择阳离子交换层析柱，使用SPSepharoseFF分离效果最好，目的蛋白质洗脱峰最高，含杂最少。选择SPSeharoseFF为填料，成功捕获了发酵液中的产物(Exendin-4)2-HSA融合蛋白质。捕获的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白质再经过疏水型层析柱ButylSepharoseFF，阴离子交换层析DEAESepharoseFF进行精细纯化，目标蛋白质的纯度可以达98%以上。本发明也提供了一种鉴定(Exendin-4)2-HSA融合蛋白生物活性的方法。本发明也提供了一种测定(Exendin-4)2-HSA融合蛋白体外稳定性和体内半衰期鉴定的方法。具体地，检测方法测定融合蛋白的活性的货架寿命(shelflife)以及动物体内的活性半衰期。动物包括但不限制于小鼠，狗，猴子，以及人类。本发明的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白可以用于包括糖尿病等症状的治疗。给药方式可以是注射，口服，鼻内，呼吸道等。为了提高用药效果，本发明的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白也可以制成不同的剂型，包括但不限制于使用各种酸碱所形成的盐形式。为了提高用药效果，本发明的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白也可以与其他药物共同使用。本发明的有益效果本发明采用基因重组技术，将多个Exendin-4多肽重复序列和人血清白蛋白融合，产生促胰岛素分泌肽融合蛋白(Exendin-4)n-HSA，中间不加入任何连接肽，在保持Exendin-4的药理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域包括II型糖尿病及肥胖症治疗将有良好的应用前景。图1:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白重组表达质粒构建图。图2:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的表达与纯化。2A:1，ProteinMarker;2，3，4为(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表达上清液。2B:2，3，4为(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的Westemblotting识别图。图3:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的纯化。1)ProteinMarker;2)发酵液；3)SPSepharoseFF洗脱收集；4)ButylSepharoseFF洗脱收集；5)DEAESepharoseFF洗脱收集。图4:小鼠葡萄糖耐糖试验结果图5:血浆胰岛素测定图6:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的长效活性观察图7:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白在糖尿病模型鼠内药效的观察图8:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的体内药代动力学具体实施方式以下所提供的实施例，可以更详细地解释本
发明内容。但是，本发明的内容并不限于这些实施例所阐述的内容。实施例l:人白蛋白基因克隆白蛋白基因通过RT-PCR获得。首先获得人胎肝组织，并从中制备总RNA。然后通过反转录方法获得cDNA。再用PCR分子克隆技术扩增获得白蛋白基因。具体说明如下1、人胎肝总RNA的抽提将人胎肝组织在液氮中冷冻粉碎后，50-100mg/mL加入Trizol(购自Invitrogen公司)，然后电动匀浆l-2min，室温放置5min，以12000rpm离心5min，将上清转移到一新管中，再按200pL/mL的比例加入氯仿混匀后室温放置15min,4'C,12000g离心15min，将上清液再转移到另一新管中，按每lmLTrizol加入0.5mL异丙醇，混匀后室温放置5-10min;4°C、12000g离心10min，弃上清；用75%的乙醇洗涤沉淀的RNA，再以8000g离心5min，弃上清，室温下干燥RNA沉淀，用50jiiL/mLH20溶解RNA，55-6(TC放置5-10min，用分光光度计测RNA的纯度与含量。2、HSA基因扩增引物设计HSA1:5'-ATGGATCCGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTA-3'HSA2:5'-AAGAATTCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3'。RT-PCR反应条件在一个0.2mL的PCR管中，加入5xRTPCR缓冲液(250mmol/LTris'ClpH8.3;375mmol/LKCl;15mmol/LMgC12;50mmol/LDTT;10mmol/LdATP，dCTP,dGTP，dTTP混合物(各2.5mmol/L))10pL，总RNA3pL(50ng),引物HSA10.5pL(25^iM)、HSA20.5|iL(25jaM)，RT國Taq混合酶lpL，加DEPC水到终体积50pL.PCR条件45°C30min;然后94""C变性2min;再按94。C，30min;55°C，lmin，72°C，2min，一共30个循环。最后，72°C，保温5min。然后采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的HSA基因片段。具体是用0.5%的agarose胶电泳酶切产物，切下1800bp左右的目的条带，再用QIAgen公司的PCR产物快速胶回收试剂盒纯化HSA基因DNA片段。将HSA基因片段与PCR2.1TA克隆载体连结，构建.HSA/pCR2.1重组质粒，连结产物转化大肠杆菌DH5a,再经含Ampicilin的LB平板筛选获得HSA/pCR2.1重组质粒菌株。用质粒DNA纯化试剂盒(Promega)纯化重组质粒DNA，进行DNA序列分析，确定HSA基因序列的正确性。实施例2:Sig-(Exendin-4)2基因合成与克隆Sig-(Exendin-4)2基因是利用人工合成方法获得。按SEQIDNO:5的序列由上海生工生物工程技术服务有限公司Sig-(Exendin-4)2基因进行合成，并使其5'和3'末端分别带下^^i/1、Cfel的酶切位点。用以下引物Exl:5'-AAGGATCCAAAATGAAGTGGGTAAGCTTTATTTCCCT誦3'Ex2:5'隱TTAAATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCA-3'通过PCR对合成的Sig-(Exendin-4)2基因进行扩增。具体条件如下人工合成的单序列Exendin-4，10pL;10xpfUBuffer(500mmol/LKC1,100mmol/LTris'ClpH9.0,1.0%TritonX-100)5jiL;dNTPMixture,2fiL;pfUDNAPolymerase,0.5)iL;Exl，0.5pL(25)aM);Ex2，0.5pL(25|aM);ddH20，31.5|iL。然后，把加好样品的PCR管放到PCR仪孔中，根据下列反应条件进行扩增94°C;2min;然后，94°C，30sec;55°C，20sec，72°C，50sec，共30个循环。最后，72°C，5min。所产生的PCR反应产物使用琼脂糖电泳方法进行分析,在紫外灯下观察电泳情况。采用低融点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收分子量约350bp的Sig-(Exendin-4)2DNA条带。将Sig-(Exendin-4)2与pCR2.1TA克隆载体连结，构建Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1重组质粒，连结产物转化DH5a感受态细菌，经含Ampicilin的LB平板筛选获得含Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1重组质粒的菌株。用质粒DNA纯化试剂盒(Promega)纯化重组质粒，DNA序列分析确保Sig-(Exendin-4)2的正确性。实施例3:(Exendin-4)2-HSA融合基因的构建与克隆以(Exendin-4)2和HSA基因构成(Exendin-4)2-HSA融合基因为例，说明合成融合基因的方法。本方法也适合HSA基因与其它多个重复Exendin-4多肽基因形成融合基因的方法。具体如下。(一)通过培养含有Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1、HSA/pCR2.1重组质粒的菌种，提取获得该质粒DNA。重组质粒Sig-(Exendin-4)2/pCR2.1用、C7al进行双酶切，采用琼脂糖凝胶电泳回收Sig-(Exendin-4)2DNA片段；HSA/pCR2.1重组质粒用C/"l、5amHl进行双酶切，同样用琼脂糖凝胶电泳回收线性化的HSA/pCR2.1DNA片段。(二)将回收Sig-(Exendin-4)2DNA片段DNA与HSA/pCR2.1DNA片段连接，构建重组质粒Sig-(Exendin-4)2-HSA/pCR2.1。连接体系一般为10uL，双酶切的HSA/pCR2.1质粒载体与双酶切Sig-(Exendin-4)2DNA的摩尔比为1:2-10，10xT4DNAligase缓冲液l|iL，T4DNAligaselpL,加无菌水至总体积为10jaL。连接反应于16"C恒温水浴锅内反应16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。阳性克隆鉴定是通过含Ampicilin的LB平板挑选阳性克隆，抽提质粒，并进行DNA测序确定融合基因序列的准确性。实施例4:(Exendin-4)2-HSA表达质粒的构建以下以(Exendin-4)2-HSA融合基因为例，说明表达载体质粒的构建。采用pYES3/CT为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备质粒后-20'C保存待用。具体如下，先对表达载体质粒pYES3/CT，进行Baw/n、五coRl双酶切。具体条件如下。表达载体质粒pYES3/CT，10|iL;S"m//1l|iL,五co/llpL，10x酶切缓冲液(H)(购自美国promega公司)，5pL;ddH20，33pL，总体积为50(iL。37'C恒温水浴箱内反应3小时，通过琼脂糖凝胶电泳回收线性化的pYES3/CT质粒DNA。Sig-(Exendin-4)2-HSA/pCR2.1DNA作同样的双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收分子量约2100bp的Sig-(Exendin-4)rHSA基因片段。将回收的Sig-(Exendin-4)2-HSADNA与上述双酶切的表达质粒pYES3/CT连接构建融合蛋白表达质粒EXHSA-pYES3/CT。连接体系一般为10pL，双酶切的pYES3/CT质粒载体与双酶切Sig-(Exendin-4)2-HSADNA的摩尔比为1:2-10，10xT4DNAligase缓冲液1)iL,T4DNAligaselnL，加无菌水至总体积为10pL。连接反应于16"C恒温水浴锅内反应16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。阳性克隆鉴定是通过含Ampicilin的LB平板挑选阳性克隆，抽提质粒，并进行DNA测序确定融合基因序列的准确性(图l)。实施例5:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表达工程菌的构建利用电转化方法和(Exendin-4)2-HSA融合基因为例，说明(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表达工程菌构建的方法。具体方法如下。首先挑选含有EXHSA-pYES3/CT表达载体质粒的细菌克隆，提取表达载体质粒。然后，用电转化的方法把质粒转入酿酒酵母INVScl中。质粒DNA提取方法按Promega公司质粒DNA纯化试剂盒操作说明进行。电转化方法转化酿酒酵母具体如下.先进行菌体的准备。挑取酵母单菌落，接种至含有5mLYPD培养基的50mL三角瓶中，30°C、250-300r/min培养过夜。然后取100-500pL的培养物接种至含有500mL新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30°C、250-300r/min培养过夜，至OD,达到1-1.5。再将细胞培养物于4°C，1500g离心5min，用500mL的冰预冷的ddH20将菌体沉淀重悬。离心后，再用250mL的冰预冷的ddH20将菌体沉淀重悬。再离心，用20mL的冰预冷的lmol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用lmL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5mL。然后用电击方法进行转化。具体如下将520pgEXHSA-pYES3/CT表达质粒DNA溶解在5~10|iLTE溶液中，与80pL的上述感受态菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min。然后根据相应的电转化仪，采用优化的电压、电流、电容等参数，进行电击。电击完毕后，加入lmL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的离心管中，将菌体悬液涂布于SCTrp-选择性平板上，每20060(^L涂布一块平板。将平板置于3(TC培养，直至单个菌落出现。推荐电击参数为电压1.5kV;电容25nF;电阻200Q。电击时间为410msec。实施例6:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白表达和纯化EXHSA-pYES3/CT质粒电转化酵母，经SCTip—筛选培养基平板挑选较饱满的菌落接于SCTrpf帝选培养基([腺嘌呤,L-精氨酸，半胱氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸,L-苏氨酸，尿嘧啶]各0.01%)中扩大培养，菌体生长到一定浓度后接于诱导培养基中([L-天冬氨酸，L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸,脯氨酸，L-丝氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸]各0.005%)发酵表达融合蛋白质。发酵液经离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析显示70kd的蛋白质表达产物条带(图示2A，2-4)，Westernbloting试验显示能与Anti-Exendin-4抗体有特异性结合(图示2B，2-4)。将发酵上清液过SPSepharoseFF柱，捕获的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白质，再经过疏水型层析柱ButylSepharoseFF，阴离子交换层析DEAESepharoseFF分离精细纯化，获得纯度可以达98。/。以上的(Exendin-4)2-HSA(图示3)。实施例7:小鼠耐糖试验C57BL/6小鼠，雌雄各半，禁食18h,腹腔注射Exendin-4(10pg/kg)或(Exendin-4)2-HSA、Exendin-4-HSA(lmg/kg)。lh后腹腔注射葡萄糖(1.5mg/kg)，注射葡萄糖后分别于IO、20、30、60、120min尾静脉采血，用血糖仪测定血样中葡萄糖含量，观察上述待试品对小鼠血糖的影响。结果表明给药能有效地降低空腹血糖峰浓度，同时使血糖浓度曲线趋于平稳(图示4)。实施例8:血浆胰岛素测定取小鼠8只，通过腹腔注射(Exending-4)2-HSA1.0mg/kg或Exendin-410pg/mL(IP)，20分钟时眼眶取血，采用酶联免疫吸附方法(ELISA,—抗Anti-insulinantibodyD6C4;酉己对二抗Anti-insulinbiotinlatedantibodyD3E7，由ABCAntibody.com供应)对小鼠血清中的胰岛素进行检测，观察(Exending-4)2-HSA是否能有效地促进胰岛素分泌。结果显示(Exending-4)2-HSA使用组的胰岛素水平比对照组HSA高3.6倍(图示5)。实施例9:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的长效活性观察给小鼠腹腔注射(Exendin-4)2-HSA(1.0mg/kg)，于1、24、48、72、96小时注射葡萄糖(IP)，注射葡萄糖后不同时间点取血样，用血糖仪测定血样中葡萄糖含量，观察(Exendin-4)2-HSA在不同时间点对小鼠血糖的影响。与阴性对照HSA相比，(EXendin-4)2-HSA明显降低血糖峰值，血糖浓度波动较小，显示明显降低血糖作用，并具有长效特性(图示6)。实施例10:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白在糖尿病模型鼠上药效的观察糖尿病模型鼠BSKdb/db，其特征为高血糖(19-32mmol/L，血糖为正常鼠的2-3倍)，肥胖(40-56克/只，体重为正常鼠的2-3倍)，本实验通过小鼠腹腔注射(Exendin隱4)2國HSA(1.0mg/kg)，每两天一次，共12天，观察给药后30min、60min、2h、24h、48h小时血糖值；1、3、5、7、9、11天饮水，饮食，体重变化。与阴性对照药HSA相比，(Exendin-4)2-HSA明显降低糖尿病模型鼠BSKdb/db血糖峰值，具有显示降低血糖浓度的作用，并具有长效特性，结果见图示7A;明显减少糖尿病模型鼠BSKdb/db的摄食，饮水量及体重，结果见图示7B,C，D。实施例11:(Exendin-4)2-HSA融合蛋白的体内药代动力学给小鼠注射(Exendin-4)2画HSA(1.0mg/kg，IP)，于0、0.133、3、6、24、48、72、96h时间点取血样，采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测小鼠血清中的(Exendin-4)2-HSA浓度，并计算药代动力学参数。显示半衰期为33小时，具有长效特性，结果见图示8，而文献报道皮下注射Exendin-4的半衰期为2-4小时。序列表<210>SEQIDNO:1<211>39<212>PRT<213>Exendin-4氨基酸序列<400>1HisGlyGluGlyThrPheThrSerA印LeuSerLysGinMetGlu51015GluGluAlaValArgLeuPhelieGluTrpLeuLysAsnGlyGly202530ProSerSerGlyAlaProProProSer3539<210>SEQIDNO:2<211>585<212>PRT<213>HSA氨基酸序列<400>2AspAlaHisLysSerGluValAlaHisArgPheLysAspLeuGly51015GluGluAsnPheLysAlaLeuValLeulieAlaPheAlaGinTyr202530LeuGinGinCysProPheGluAspHisValLysLeuValAsnGlu354045ValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAspGluSerAlaGlu505560AsnCysAspLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAspLysLeuCys657075ThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMetAlaAspCys808590CysAlaLysGinGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGinHis95100105LysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuValArgProGluVal110115120AspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGluThrPheLeu125130135LysLysTyrAlaProGluThrGluCysLysLeuAspGinArgLeuPheLysAlaAlaGluPheValHisThrAspArgAlalieSerSerLysSerHisAspLeuProCysLysAsnLeuTyrGluLeuLeuArgCysAlaAlaGluPheLysAsnCysGluLeuTyrGlulieAlaLeuCysGluLysTrpAlaGluAspLysCysSerTyrTyrLeuAlaProLeuTyr140Leu155Gin170Leu185Cys200Ala215Glu230Cys245Leu260Leu275lie290Leu305Ala320Ala335Ala350Asp365Leu380Phe395PheAlaArgAlaValValCysAlaLysAlaAlaGluArgLysProValLysliePheAlaAspSerAlaSerHisLysGluGluAlaAlaArgThrHisGluGinAlaAspGluLeuLysGlyTyrCysValAspLysArgLysLysGlyGinLeuSerGinLeuAsplieCysGluPheAspHisProTyrGluGluLeuGluCysProGlyArg145Arg160Ala175Lys190Lys205Ser220Val235Leu250Cys265Glu280Asn295Val310Val325Asp340Thr355Tyr370Gin385Glu400HisProTyrPheAlaTyrAlaAlaSerSerPheGlyGluThrLeuGluLysAspGluPheTyrThrAlaAsnTyrLysCysSerGlyArgAspGluAsnProGluSerLeuSerLeuLysLeuLysAlaLeuLeuPheLeuCysGinLeuMetLysGlyValGluValliePheAlaArgProThrAlaAspLeuProAspMetValLysPheLysGinTyr150Phe165Pro180Lys195Ala210Lys225Lys240Asp255Ser270Glu285Ala300Val315Phe330Leu345Cys360Asp375Gin390Asn405AlaLeuLeuValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThr410415420ProThrLeuValGluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySer425430435LysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMetProCysAlaGlu440445450AspTyrLeuSerValValLeuAsnGinLeuCysValLeuHisGlu455460465LysThrProValSerAspArgValThrLysCysCysThrGluSer470475480LeuValAsnArgArgProCysPheSerAlaLeuGluValAspGlu485490495ThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPheHis500505510AlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGluArgGinlieLysLys515520525GinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThr530535540LysGluGinUuLysAlaValMetAspAspPheAlaAlaPheVal545550555GluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAlaGlu560565570GluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGlyLeu575580585<210>SEQIDNO:3<211>2067<212>DNA<213>(EXendin-4)2-HSA融合蛋白基因核苷酸序列<400>3Atgaagtgggtaacctttatttcccttxtttttctctttagctcggcttattccaggggt60gtgUtcgtcgacacggtgsaggtactttcacttctgatttgtctaagcaaatggaagaa120g犯gCtgtt8gattgttcattgaatggttg鄉aacggtggtccatcttctggtgctcca180ccaccatctc3cggtgaaggtactttcacttctgatttgtctaagc犯atgg3卿ag犯240gctgttagattgttcattga已tggttgaagaacggtggtccatcttctggtgctccacca300ccatctgatgcacscaagagtgaggttgctcatcgatttaa卿tttgggagaag已aaat360ttcaaagcctactcttcgtg犯tg犯tgctg已ggttg3tgttatstgaaaaaaaggtatattgcca犯gca3gtgtgcc已ctgagccagaaLCcaa3gtccgaccttgccatgtgaa^a^ccctgctgacttatgctg鄉cctgattactaagtgctgtgcctcttgtgggg卿gtacatcaactccaacagttatgtggaatccttggcccaaagagt犯gg卿gELCtgc已鄉ctgagtcaagctgtggtgttgattagtg犯tgagtgacaaMc^eicctatggtcttgcaac3tgatgtgc已cttgccag已agaagctgcttttcgatgaactgtctccaaaagatttcccaaac已cggaatg3gt3t已tctgctctgttggatgccttcattcaaaggatgtctgtcgtgctccgctgcagaaagagcctc3aattccaga^ctcttgtagatgttgcatgatg獄aggcgttaatgctga3gcs￡ictga3ccttaggctttgcctttgctagtaactgaaacttcatacctgaaatggctc幼agatgactgcttttcatacatccttacta^gaatgttcgggatg3已3tttgga_g3￡L已gctgagtttctgccatggatgaaaatcaaaaaatcccacagctgctg已tcttcctgggcgctgctgagatcctcatgaagaatttaatctgcgctattaggtctcaagaaatgccctgtgaaaacgccaaccatgctttaacattcaccacaaactgcaagctgttatggacctgctttat已已tgacagtatcttctttgcaaaaactttttggaggactgctgtgaacccaaaccg3c已stgaagttttatgccctgccaagctggggaaggcttagagctttcagc已g犯gtttg已tctgcttggattcgatct.tgcattgccgtttgttgaaaatgtttttgtcttgccaagatgctatgccaaaacaaaattgttcgttaca33CCt8gg^gcag犯gax;tgtaagtg已catcagctctggttccatgcagcttgttgagcgatgatttcggccgaggaggagcagtgtcccatgtgttgc已caaattatgtcccccgatt3g3CatttttcggaactcctCtg3t8犯gCcgtctgccaa卿catgggcccaagttagtaatgtgctgaccagtaaact已8gtgg3犯agt已aggatgtatgaatatgcaagtgttcgagtgagcttttccaags犯gt鄉tgggC3gatctatccgtg3gtc3ccaaaagtcgstgatcgtg犯acacagcttttgtgta_aaa<a_acttgatgagtcacacagttgcaggtgBg3CC已tttctttgcttgcctgcctgacagagactcagtagctxgcgacagatctttgacagggcgg卿g犯tgctgatg卿tgttgcaaaaacaag犯ggcatcactctagagtg已gcagcttaccccaagtgcaaatgttgtggtcctgaacatgctgcacaaacat已cgttactttctgagcaagcccaagag卿agtgctgttgctgca420■5406006607207808409009601020108011401200126013201380144015001560162016801740180018601920198020402067<210>SEQIDNO:4<211>663<212>PRT<213>(Exendin-4)2-HSA融合蛋白氨基酸序列<400>4HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGinMetGlu51015<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>GluArgAlaPhePheProLysAlaLeuThrLysValCysAlaAspAspGinAspSerlieLeuLeuGluLysMetProAlaAspLysAspValCysGlyMetPheLeuValValLeuLeuGluLysCysCysValPheAspGlulieLysGinAsnPheGinAsnAlaValSerThrProValGlySerLysCysAlaGluAspLeuHisGluLysLys290Glu305His320Arg335Ser350Ser365Leu380Lys395Tyr410Leu425Ala440Phe455Cys470Leu485Thr500Cys515Tyr530Thr545AlaPheThrAlaSerHisProAsnGluArgAlaLysGluLeuLeuCysLeuProTrpAlaAlaGluGluCysAspLeuLysLeuCyslieSerLeuTyrAlaTyrAlaLeuAlaAlaAspProLeuLeuPheValArgValGluLysHisSerValValSerValValCysAlaLysAlaAlaGluArgLysProValGluTyrValProValAspAla295Ser310His325Lys340Glu355Glu370Ala385Ala400Arg415Thr430His445Glu460Gin475Thr490Ser505Glu520Leu535Arg550ArgLeuSerLysLeuValGlyAspLeuTyrlieCysCysCysGluValGluAsnAspPheValLysAspValHisProAspTyrGluThrGluCysTyrGluProGinLeuGlyGluLysLysValArgAsnLeuAlaLysArgAsnGinLeuValThrLysGinArg300ThrAsp315LeuGlu330GluAsn345LysPro360AspGlu375GluSer390PheLeu405TyrSer420ThrLeu435AlaLys450AsnLeu465TyrLys■ProGin495GlyLys510MetPro525CysVal540CysCys555ThrGluValAspThrPhelieLysLysAlaAlaPhePheAlaLeuGlySerLeuVal560GluThrTyr575HisAlaAsp590LysGinThr605ThrLysGlu620ValGluLys635GluGluGly650Leu663AsnVallieAlaGinCysLysArgProCysLeuLeuCysLysArgProLysGluThrLeuValGluLysAlaLysAlaLeuValCysPhe565PheAsn580SerGlu595LeuVal610ValMet625AspAsp640AlaAla655SerAlaAlaGluLysGluLysHisAspAspLysGluSerGinLeuGlu570ThrPhe585ArgGin600LysPro615PheAla630ThrCys645AlaAla660权利要求1.一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是含有2个多肽区，其1区由多个促胰岛素分泌肽Exendin-4重复序列组成，其2区是人血清白蛋白HSA，1区通过其C-末端与第2区的N-末端直接连接，或1区通过其N末端与2区的C-末端直接连接，中间不加入任何连接肽，其结构式是(Exendin-4)n-HSA，n为Exendin-4重复序列组成的重复次数，n为2-8。2.根据权利要求1所述的(Exendin-4)n-HSA融合蛋白，其Exendin-4多肽氨基酸序列与序列SEQIDNO:1保持有至少90%的同源性。3.根据权利要求1所述的(Exendin-化-HSA融合蛋白，其特征是其1区的优选结构为(Exendin-4)2，得到(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，该结构可以增强融合蛋白的生物活性。4.根据权利要求1所述的(Exendin-4VHSA融合蛋白，其特征是Exendin-4重复序列各个序列之间的连结方式为上一个Exendin-4的C末端与下一个Exendin-4的N末端直接连接，中间不加入任何连接肽。5.根据权利要求1所述的(Exendin-化-HSA融合蛋白，其特征是2区多肽选自人血清白蛋白HSA，其氨基酸序列与序列SEQIDNO:2保持有至少90%的同源性。6.根据权利要求3所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其特征是基因核苷酸序列为SEQIDNO:3。7.根据权利要求3所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其特征是氨基酸序列为SEQIDNO:4。8.根据权利要求6所述的(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，其特征是其重组核苷酸序列插入在一种表达载体和细胞宿主系统。9.一种权利要求1-3所述的(Exendin-化-HSA融合蛋白的制备方法，其特征是包括转录，翻译，蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。10.—种利用权利要求1-3所述(Exendin-化-HSA融合蛋白的应用，其特征是使哺乳动物血糖水平正常化，用于制备非胰岛素依赖性糖尿病及肥胖者的治疗制剂。全文摘要一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物
技术领域：
。本发明涉及促胰岛素分泌肽(Exendin-4)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其含有2个多肽区，其1区由多个促胰岛素分泌肽Exendin-4重复序列组成，其2区是人血清白蛋白HSA，1区通过其C-末端与第2区的N-末端直接连接，或1区通过其N末端与2区的C-末端直接连接，中间不加入任何连接肽，其结构式是(Exendin-4)_n-HSA，n为Exendin-4重复序列组成的重复次数，n为2-8。所述(Exendin-4)_n-HSA融合蛋白的应用，使哺乳动物血糖水平正常化，用于制备非胰岛素依赖性糖尿病及肥胖者的治疗制剂，具有比Exendin-4化合物更好的稳定性和体内半衰期。文档编号C12N15/62GK101240033SQ200810018639公开日2008年8月13日申请日期2008年3月4日优先权日2008年3月4日发明者余传信,杨健良,王斯靖,琪高申请人:无锡和邦生物科技有限公司;江苏省血吸虫病防治研究所