专利名称：产红霉素多孢放线菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种其发酵液中能够分离得到新的化合
物的微生物菌株。
背景技术：
红霉素的类衍生物有很多种，以红霉素C进行分析，在其14元大环结构中14位上 没有羟基，6和18位间没有形成三元环。红霉素类药物的合成与开发主要集中于对14元环 上的3、5、6、11和12位等活泼羟基的取代上以及取代基的再取代反应，并获得了很好的红 霉素临床药物。但随着临床耐药菌的不断出现及这些菌的耐药性的增强，临床使用的红霉 素药物疗效正逐步降低，需要进一步开发新的抗生素药物。因此，新的结构及在此基础上进 行的衍生化反应所得到的系列化合物将为新一代红霉素药物开发提供很好的基础。这正是 该技术领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从新疆艾丁湖盐湖土样中分离得到的、其发酵液中能 够分离得到新的化合物的微生物菌株——产红霉素多孢放线菌。 本发明所述的产红霉素多孢放线菌命名为产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YIM 906001，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC M 208243。 本发明所述的产红霉素多孢放线菌系从中国新疆艾丁湖盐湖土样中分离获得的。 现保藏在国家知识产权局专利局保藏单位保藏，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心， 保藏单位地址中国，武汉大学，邮政编码430072。保藏日期为2007年10月9日，保藏编 号为CCTCC M 208243。 本发明所述的产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YM 90600Tj
类地位为细菌域、放线菌门、放线菌纲、多孢放线菌属Actinopolyspora。 本发明所述的产红霉素多孢放线菌是从新疆艾丁湖盐湖土样中，用纤维素酪素复
合盐培养基Cellulose-casein multi-salts (复合盐包括NaCl， KC1 and MgCl2)medium.，采用平板稀释涂布法，分离到一株嗜盐放线菌YM 90600T。 分离步骤为取盐湖土样2g、放入20ml已灭菌的含10 % NaCl溶液，37 °C振荡
(lOOr. p. m) 30分钟，取0. 2ml 10—2溶液、涂布于纤维素酪素复合盐平板培养基，37。C培养3
周，挑单菌落于ISP 4培养基培养、纯化2次，确认为纯菌株后，用于科研和保藏。菌种采用
冻干物安瓿管保藏、甘油管保藏和液氮保藏等保藏方式。
培养条件 培养基ISP 4培养基
(1%可溶性淀粉，0. 4% (NH4)2S04，0. 2% K2HP04，0. 2% MgS04 7H20，0. 4% CaC03，
10 % NaCl ， 1 % MgCl2 6H20， 1 % KC1 ， 2 % Agar)。 NaCl生长耐受范围2-25X，最适生长NaCl 5_10%。 最适生长pH :7-7. 5。 最适生长温度37t:。 好氧。 繁殖 用接种针取少量菌丝于ISP 4琼脂培养基，37t:培养7天后，基内菌丝开始生长、
为白色，气生菌丝还未发育；培养12天后，气生菌丝发育生长、为白色；培养20天到其生长
的对数期，基内菌丝白色、气生菌丝为白色到黄白色，无可溶性色素产生。 本发明所述的产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T菌
种描述 好氧、革兰氏阳性、中度嗜盐放线菌。基内菌丝和气生菌丝生长良好，基内菌丝会 发生断裂、气生菌丝成熟形成长孢子链、孢子椭圆形。最适生长在无机盐淀粉琼脂培养基， 中度生长在察氏琼脂培养基、燕麦琼脂培养基和马铃薯浸汁琼脂培养基，较弱生长在酵母 膏/麦芽膏琼脂培养基、甘油/天门冬酰胺琼脂培养基和营养琼脂培养基。基内菌丝颜色 为白色，气生菌丝颜色为白色到黄白色，没有可溶性色素产生。明胶液化阳性，降解淀粉、纤 维素和脲阴性。NaCl生长耐受范围2-25% (w/v)，最适生长NaCl浓度、pH和温度分别为 5-10^、7-7.5和37。C。全细胞水解产物含meso-二氨基庚二酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯 糖和核糖。优势甲基奈醌为MK-9(H4)。主要脂肪酸含iso-C化。，iso-C则和anteiso-C^。。 DNA基因的G+C含量是67mol%。 本发明所述菌株的发酵液中能够分离得到新的红霉素类似物，具有抗菌、肿瘤细 胞活性(MTT法)。
具体实施方式
实施例 用本发明所述的产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T 制备新化合物6， 18-环氧-14羟基红霉素内酯B。 —、产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T菌株的发酵处 理 a、斜面培养ISP 4+10% NaCl，37。C下培养15天至气生孢子长出； b、种子培养ISP 4(无琼脂)+10% NaCl，37t:下，250转/分，培养IO天； c、发酵培养在发酵培养基中，37摄氏度下，250转/分，培养30天，发酵培养基
的组成及比例大豆粉20g，蛋白胨2g，葡萄糖20g，淀粉5g，酵母膏2g， NaCl 74g， K2HP04
0. 5g， MgS04 7H20 0. 5g， Na2S04 10H20 25g， KC115g， MgCl2 6H20 10g， CaS04 2H20 5g，
CaC03 2g，去离子水1000ml ， pH 7. 8 ; 操作过程取一接种环长好的菌株孢子，接入温热灭菌过的种子培养基中 (50ml/250ml三角烧瓶)，置于摇床上37。C下，250转/分，培养10天，制备种子培养液；再 将种子培养液以10%的接种量接种于发酵培养基中(500ml/2000ml三角烧瓶)，发酵摇瓶于37。C下，250转/分，培养30天；
二、制备提取物及化合物分离 发酵终止后，fC下4000转/分离心将菌丝体与发酵液分开，向发酵液中加入甲乙 酮萃取三次，每次用量为1/3体积，减压除去甲乙酮，得发酵粗提取物，菌丝体用丙酮浸泡3 次，每次用量约2000ml ;减压除去丙酮，将丙酮浸出物与甲乙酮提取物合并，得菌株粗提取 物；粗提取物经硅胶柱层析、S印hadex LH-20柱层析、ODS柱层析及HPLC制备得6， 18_环氧 红霉素内酯B。 6，18-环氧红霉素内酯8外观呈白色粉末，分子式为(:21113608，结构式如下
<formula>formula see original document page 5</formula> 上述化合物为红霉素母核的一个新的衍生物，具有两个不同于已知红霉素结构的 特点，一是独特的含氧三元环状稳定结构，二是14位上的羟基取代。这两个特点在研究开 发新一代的红霉素药物中有很重要的意义，14位上活泼的羟基为发生新的取代反应提供了 更多的反应位点，在此基础上可以在3位、5位和14位的羟基可以进行各种取代反应，产生 出不同于已知和临床上使用的新的红霉素药物。本化合物具有抗肿瘤、抗菌的作用，临床可 用于敏感菌所致的各种感染。上述化合物可用于合成新一代红霉素类药物的前体物质，为 合成新的红霉素提供了一种新的骨架。 以上述化合物5个浓度对H1299、 A549、 MCF10A、 DU145、 SK0V-3、 NCI-H460、 HT29、 HCT-15、MCF7等多种肿瘤细胞株进行了抗肿活性的筛选，表明该物质在0. lmg/mL对肿瘤细 胞株具有一定的抑制活性。同时，抑菌实验证实，在目标菌株中，对枯草芽孢杆菌(细菌，抑 菌圈直径3mm)、肺炎链球菌(细菌，抑菌圈直径5mm)、棒束孢菌(真菌，抑菌圈直径lmm)等 具有抑制作用，但对真菌的抑制作用较弱。 本发明所述的产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YIM 906001的 16S rRNA部分基因由679个碱基组成，其序列如下 1 ggcgcgcttc acacatgcaa gtcgagcgat ggcgccggtt ttcggatcgg tgtgcagagc
61 ggcggacggg tgagtaacac gtgagtaacc tgccctgggc gtggggataa ccctgggaaa121ctggggcteataccggatggccctgcctattcgcatggatgggtgggg朋aggttcatct181tcgtaagggggtgttccggcttggg鄉ggctcgcggcccatcagcttgttggtgcggtg241agggcgtacc朋ggcgatg3cgggtagccggcctg卿gggtgatcggcc3C3Ctggg3C301tgagacacggcccagactcctacgggaggc3gC3gtggggaattttgcgcElEltgggCggEl361agcctgacgcagcgacgccgtgtggggg3ggacggccttcgggttgte朋cctctttcgg421ccctgacgaatgtgacggtaggggcte朋gaagcgccggctaactacgtgccagcagccg481cggt朋tecgtagggcgcgagcgttgtccggatttactgggcgte朋gggctcgtaggcg541gtttgtcgcgtcggtcgtgga朋tgtctggcttaactgggcacgtgcggctgatacgggc601agactcgagggcggteggggc朋gcgg朋ttcctggtgtagCggtg朋Eltgcgcagatet
661 caggaggaac accgatggcc
权利要求
一种产红霉素多孢放线菌，其特征在于命名为产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC M 208243。
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种其发酵液中能够分离得到新的化合物的微生物菌株。本发明所述的产红霉素多孢放线菌命名为产红霉素多孢放线菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC M208243。本发明所述的产红霉素多孢放线菌系从中国新疆艾丁湖盐湖土样中分离获得的。现保藏在国家知识产权局专利局保藏单位保藏，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址中国，武汉大学，邮政编码430072。保藏日期为2007年10月9日。本发明所述菌株的发酵液中能够分离得到新的红霉素类似物，具有抗菌、肿瘤细胞活性(MTT法)。
文档编号C12R1/01GK101748081SQ200810233710
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者唐蜀昆, 姜成林, 徐丽华, 李文均, 赵立兴 申请人:云南大学