新型proNGF突变体及其在生产β-NGF中的用途

新型proNGF突变体及其在生产β-NGF中的用途
【专利摘要】本发明涉及proNGF突变体及其用途，具体而言是proNGF突变体用于生产人β-NGF的用途。本发明公开了由无活性的不可溶的proNGF突变体制备生物活性的人β-NGF的方法。本发明的proNGF突变体在天然蛋白酶切割位点R1SK3R4处的至少位置R1和K3中被除了Arg或Lys以外的任何氨基酸取代，其中所述的位置R1和K3对应于所述的人野生型proNGF序列的位置101和103。
【专利说明】新型proNGF突变体及其在生产β -NGF中的用途

【技术领域】
[0001]本发明涉及在天然蛋白酶切割位点处具有取代的新型proNGF突变体。本发明进 一步公开了由无活性的不可溶的proNGF突变体来生产生物活性的人β-NGF的方法，及 proNGF突变体用于生产人β -NGF的用途。

【背景技术】
[0002] 神经生长因子（β -NGF)是在神经元（感知和交感的）的生长和存活 中起关键作用的神经营养因子（Levi-Montalcini，R.，Science237(1987) 1154; Thoenen, Η. , etal. , Physiol. Rev. 60 (1980) 1284 ；Yankner, B. A. , etal. , Annu. Rev. Biochem. 51 (1982)845)。β-NGF属于生长因子的半胱氨酸结超家族，假设其为稳定的二 聚体蛋白质结构。此外，β-NGF促进中枢神经系统的类胆碱能神经元的生长、分化和活 力（Hefti，F. J.，J. Neurobiol. 25(1994) 1418)。用于重组人神经生长因子的可行的治疗 适应症包括外周感觉神经病变，例如与糖尿病有关或者在AIDS治疗中可能的副作用。用 于β-NGF的其他适应症为中枢神经病变，例如Alzheimer病。在这种情况下，记忆丧失 是类胆碱能神经元缺失的结果。此外，还发现β-NGF有效用于治疗人皮肤癌和角膜癌 (Bernabeietal· Lancetl999 ;Lambiaseetal. NEJM1998)。此外，青光眼的试验动物模型中， β -NGF还显示保护视网膜细胞免于退化和细胞凋亡，以及在一些受青光眼影响的患者中改 善视觉功能（LambiaseA，etal. PNAS2009)。
[0003] 成熟的人β-NGF为118个氨基酸的蛋白质，其被翻译为前原蛋白由241个氨基酸 组成。18个氨基酸的信号肽（前肽）在转移至内质网（ER)的过程中被切割。所得的前蛋 白（proNGF)通过蛋白酶切割除去原序列而在其N-末端被加工。成熟的人NGF显示与啮齿 动物（鼠科和大鼠）β-NGF具有高度的一致性（大约90 %)。就临床研究或治疗用途而言， 必须以高浓度提供β-NGF。小鼠的颌下腺是β-NGF的天然来源。但是，这些β-NGF的制 备是不同二聚体的各种混合物，因此不适用于治疗用途。此外，理想的是给与患者人类形式 的蛋白质。但是，在人类组织中，神经营养因子仅以低浓度存在。
[0004] 原序列为区别于成熟蛋白质的结构域（参见图1中的序列数据，其中原序列以黑 体表示）。这两个结构域通过暴露的蛋白酶切割位点而分离，其中所述的蛋白酶切割位点为 位于人proNGF序列（SEQIDN0:1)的位置101至104处的典型Arg-Ser-Lys-Arg的碱性氨 基酸靶序列。该基元为丝氨酸内切蛋白酶成对碱性氨基酸蛋白酶的天然切割位点。此外， 所述的切割位点可以通过其他合适的蛋白酶进行特异性的加工，优选的是在氨基酸精氨酸 (Arg，R)之后具有底物切割特异性的蛋白酶。例如，蛋白酶胰蛋白酶在碱性氨基酸（例如 赖氨酸（Lys，K)或精氨酸（Arg，R))之后进行切割。
[0005] 用于由无活性原形式的β -NGF制备生物活性的β -NGF的方法是本领域公知的。 例如，ΕΡ0994188Β1描述了由溶解度较低的无活性的原形式β -NGF制备生物活性的β -NGF 的方法。根据该方法，β-NGF可由重组不可溶的无活性proNGF得到，其中所述的不可溶的 无活性proNGF溶解于变性溶液中。之后，将溶解的proNGF转移至非或弱的变性溶液中。 变性的proNGF假设为生物活性构造，这可通过天然β -NGF中存在的二硫键测定。随后， proNGF的原序列被切割，由此得到活性的β -NGF。
[0006] 人proNGF包含天然蛋白酶（成对碱性氨基酸蛋白酶）切割位点 Arg-Ser-Lys-Arg,因此具有以下序列基兀：I^SK3!?4。就特定的生产过程（例如需要"良好作 业规范"（GMP)质量水平的那些）而言，诸如酶之类的材料必须以高品质提供。目前，蛋白 酶成对碱性氨基酸蛋白酶并非为GMP级可利用的蛋白酶。
[0007] 因此，选择备选的蛋白酶（胰蛋白酶（EC3. 4. 21. 4))来切割proNGF，从而得到成 熟的β-NGF蛋白质。丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶在碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸的羧基一侧切 割肽链。在人proNGF中，人proNGF中天然形成的切割位点包含具有碱性氨基酸的3个位 置（SEQIDN0:1的位置101、103和104 ;在本文中备选地称为R1、K3和R4)。因此，通过胰蛋 白酶切割proNGF可以根据切割发生的确切位点而得到多种不同的切割产物。典型的切割 产物为SK 3R4- β -NGF和R4- β -NGF、以及成熟的β -NGF。由于β -NGF蛋白质的二聚化将导 致更多数量（至多达6种）的不均一的产物，这些产物必须在随后的步骤中纯化，所以该问 题恶化（参见图2a)。
[0008] 本发明潜在的技术问题及其解决方法
[0009] 用于生产β -NGF的方法在现有技术中已经描述。但是，目前可利用的生产过程具 有几个缺点，例如不均一的β -NGF产物和β -NGF的低产率。
[0010] 使用胰蛋白酶切割野生型proNGF来生产β -NGF显示效率较低，这迫使使用极大 量的酶以便得到足够产率的切割β -NGF。这具有多个缺点，它们都会影响随后的纯化过程。 首先，其进一步降低了切割的选择性，这导致消化的多种产物。其次，必须将β-NGF由酶中 纯化出来，这是因为所述的酶毫无疑问不能存在于最终的蛋白质样品中。这意味着多个纯 化工序以除去大量的胰蛋白酶。因此，在现有技术的工序中将胰蛋白酶作为切割酶使用会 导致β -NGF极低的产率或蛋白质的纯化问题。
[0011] 本领域当然仍需要不具有上述缺点的生产β-NGF的方法。因此，本发明潜在的问 题是提供以高品质、高效率和高产率来生产β-NGF的新方法。此外，本发明潜在的问题是 提供β-NGF的生产过程，其得到高产率的β-NGF，并且是有效的、强力的、可升级的且可再 生的。
[0012] 本发明的优点是由新型的proNGF突变体来生产β -NGF。新型的突变体会得到产 率良好的均一的β -NGF产物，这是因为新型的proNGF突变体会防止被蛋白酶不均一的消 化并由此得到不均一的β-NGF产物。本发明的问题通过提供本发明的proNGF突变体以及 通过本发明所述由该proNGF突变体来生产β -NGF的方法而得到解决。
[0013] 与野生型相比，新型突变体使得在本发明的突变proNGF中的相关位点处，胰蛋白 酶的切割效率意外且显著地增高。与野生型中使用的量相比，上述结果允许使用极低量的 蛋白酶胰蛋白酶，结果使得由酶本身及由切割产物所产生的β -NGF的纯化问题减少。
[0014] 上述问题得到解决并且优点通过独立权利要求的主题而取得。本发明的优选的实 施方案包含在从属权利要求中，以及以下说明书、实施例和附图中。
[0015] 上述概述不必描述本发明所解决的所有问题。其他问题以及解决方法在技术人员 研究本申请之后可以是显而易见的。
[0016] 发明概述
[0017] 本发明的第一个方面涉及proNGF突变体，其中蛋白酶切割位点至少在R1和κ 3位 置处被选自非碱性氨基酸和组氨酸的氨基酸所取代，其中所述的R1和Κ3位置对应于人野生 型 proNGF 序列（SEQIDN0:1)的位置 101 和 103。
[0018] 本发明的第二个方面涉及由无活性的不可溶的proNGF突变体来制备生物活性的 人β -NGF的方法，其中所述的proNGF突变体至少在天然蛋白酶切割位点fSK3!?4的位置R 1 和K3处被取代，其中所述的位置R1和K3对应于人野生型pr〇NGF序列（SEQIDN0:1)的位 置101和103,所述的额方法包括：⑴提供根据本发明的 pr〇NGF突变体；以及（ii)切割 proNGF突变体，以得到活性的人β -NGF。
[0019] 具体而言，本发明涉及以下过程：
[0020] a.将所述的proNGF突变体溶解于变性溶液中；
[0021] b.将proNGF突变体转移至重折叠溶液中，其中所述的变性proNGF假设为生物活 性构造；
[0022] c.由所述的重折叠溶液纯化所述的proNGF突变体；
[0023] d.切割所述的proNGF突变体的原序列，从而得到活性的β -NGF。
[0024] 本发明的第三个方面涉及proNGF突变体在制备人β -NGF中的用途，其中在人类 野生型pr〇NGF(SEQIDN0:1)的位置101至104处，至少天然蛋白酶切割位点RiSK 3R4的位置 101处的精氨酸和位置103处的赖氨酸被非碱性氨基酸取代。
[0025] 本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含由proNGF突变体生产的β -NGF、以 及可药用的载体或稀释剂，其中在人类野生型proNGF (SEQIDN0:1)的位置101至104处，至 少天然蛋白酶切割位点PSK3!?4的位置101处的精氨酸和位置103处的赖氨酸被选自非碱 性氨基酸和组氨酸的氨基酸取代。
[0026] 本发明概述不必描述本发明所解决的所有特征。其他实施方案将通过随后的发明 详述的观点变得显而易见。
[0027] 发明详述
[0028] 定义
[0029] 在详细描述本发明之前，应该理解的是本发明不限于本文所描述的具体的方法 学、方案和试剂，这些都是可以改变的。此外，应该理解的是本文使用的术语仅仅是为了描 述具体的实施方案，并无意于限定本发明的范围，本发明的范围仅通过所附权利要求书来 限定。除非另作说明，否则本文使用的技术和科学术语都具有本发明所属【技术领域】的任一 普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0030] 在整个说明书及所附的权利要求书中，除非内容另外需要，否则词语" compr i se " 及其变体（例如"comprises"和"comprising"）都将被理解为暗示涵盖了所述的一个整数 或步骤、或一组整数或步骤，但是不排除任何其他的整数或步骤、或一组整数或步骤。
[0031] 在本说明书的整个内容中引用了多个文件（例如：专利、专利申请、科学出版物、 说明书等）。本文所引用的这些文件均不能解释为承认本发明被之前现有技术所公开。
[0032] 序列：本文所指的所有序列均在所附的序列表中公开，这些序列表及其全部内容 和公开均为本说明书的一部分。
[0033]当术语"大约"与数值联合使用时，其是指涵盖了一定范围内的数值，所述范围的 下限比所示的数值小5%，并且所述范围的上限比所示的数值大5%。
[0034] 术语"proNGF"或"pro-NGF"是指原形式的人β-NGF。全部人proNGF序列在 SEQIDN0:1中定义（图la)。为了获得成熟的β-NGF，前肽proNGF必须被蛋白酶切割。 β -NGF的原序列为区别于成熟的β -NGF的结构域。在这两个结构域之间，在SEQIDN0:1的 位置101至104处具有天然的蛋白酶切割位点Arg-Ser-Lys-Arg(在本文中称为的作 4， SEQIDN0:9)。可以通过合适的蛋白酶（具体为成对碱性氨基酸蛋白酶）特异性地加工切割 位点。
[0035] 术语"proNGF突变体"或"proNGF突变蛋白"是指通过氨基酸的取代对原形式的 β -NGF进行的修饰。本发明的proNGF突变蛋白是至少在位置K3和R1 (对应于野生型proNGF 序列（SEQIDN0:1)的位置101和103)处，在天然蛋白酶切割位点#SK3R4处（SEQIDN0:9)被 选自非碱性氨基酸和组氨酸的氨基酸所取代。
[0036] 在本发明优选的实施方案中，位置K3 (对应于位置1〇3)处的氨基酸赖氨酸被丙氨 酸取代（参见图 ld，SEQIDN0:4;图 le，SEQIDN0:5;图 lg，SEQIDN0:8)。
[0037] 在本发明的另一个优选的实施方案中，位置R1(对应于位置101)处的氨基酸精氨 酸被缬氨酸取代（参见图 lb, SEQIDN0:2 ;图 le，SEQIDN0:5 ;图 lg，SEQIDN0:8)。
[0038] 在本发明的另一个实施方案中，氨基酸精氨酸#(对应于野生型proNGF序列 (SEQIDN0:1)的位置104)还可以被任何氨基酸取代，其中所述的氨基酸允许通过蛋白水解 切割对proNGF进行加工，从而得到β-NGF，优选的是碱性氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸。例 如，位置R 4处丙氨酸的存在使proNGF免于被加工成β-NGF。因此，本发明的突变体不包含 位置104处的丙氨酸。
[0039] 表1. proNGF和proNGF突变蛋白的蛋白酶切割位点（X是指任何氨基酸，但是非 Arg 或 Lys)

【权利要求】
1. 一种proNGF突变体，其中蛋白酶切割位点RiSK3R4至少在位置R 1和K3被选自非碱 性氨基酸和组氨酸的任何氨基酸取代，所述的位置R1和Κ 3对应于人野生型pr〇NGF序列 (SEQIDN0:1)的位置 1〇1 和 103。
2. 根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101和 103处被除了精氨酸或赖氨酸以外的任何氨基酸取代。
3. 根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101和 103处被选自以下的任何氨基酸取代：丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪 氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨 酸、半胱氨酸和脯氨酸。
4. 根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101和 103处被选自以下的任何氨基酸取代：丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪 氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸。
5. 根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的天然蛋白酶切割位点在位置101 和103处被选自丙氨酸和缬氨酸的任何氨基酸取代。
6. 根据权利要求1至3所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置101 处被缬氨酸取代。
7. 根据权利要求1至6所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在位置103 处被丙氨酸取代。
8. 根据权利要求1至7所述的proNGF突变体，其中在所述的位置R4处的氨基酸选自精 氨酸或赖氨酸，其中所述的位置Μ对应于人野生型proNGF序列（SEQIDN0:1)的位置104。
9·根据权利要求1至8所述的proNGF突变体，其中在所述的人野生型proNGF序列 (SEQIDN0:1)的位置102处的取代氨基酸选自丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨 酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸。
10. 根据权利要求1至9所述的proNGF突变体，其中在所述的人野生型proNGF序 列（SEQIDN0:1)的位置101处的氨基酸被缬氨酸取代，在所述的人野生型 pr〇NGF序 列（SEQIDN0:1)的位置1〇2处的氨基酸被丝氨酸取代，在所述的人野生型 pr〇NGF序列 (SEQIDN0:1)的位置1〇3处的氨基酸被丙氨酸取代，并且其中在所述的人野生型 pr〇NGF序 列（SEQIDN0:1)的位置104处的氨基酸被精氨酸取代。
11. 根据权利要求1至10所述的具有SEQIDN0:5的proNGF突变体。
12. 根据权利要求1至11所述的proNGF突变体，其中所述的突变体是通过在原核细胞 中重组表达而获得的。
13. 根据权利要求12所述的proNGF突变体，其中所述的突变体是通过在E. coli中重 组表达而获得的。
14. 一种制备生物活性的人β -NGF的方法，其包括： (i) 提供根据权利要求1至13的任意一项所述的proNGF突变体；以及 (ii) 切割所述的proNGF突变体，以便得到活性的人β-NGF。
15. 权利要求14所述的方法，其包括以下步骤： a.通过包涵体溶解，将根据权利要求1-13的任意一项所述的proNGF突变体溶解于变 性溶液中； b. 将所述的proNGF突变体转移至重折叠溶液中，其中所述的变性的ProNGF假设生物 活性构造； c. 纯化所述的重折叠 proNGF突变体； d. 切割所述的proNGF突变体的原序列，从而得到所述的活性的@_NGF。
16. 权利要求15所述的方法，其中所述的变性溶液包含：含有（i)离散物质、（^)螯合 齐!J、（iii)缓冲剂和（iv)还原剂的溶液。
17. 权利要求16所述的方法，其中所述的变性溶液包含： i. 1-8M 胍盐-HC1，优选为 4-6M ; ii. 0. OlMTris ； iii. l-50mMEDTA ； iv. l-100mM，选自谷胱甘肽（GSH)或半胱氨酸； v. pH7. 0-10. 0。
18. 权利要求17所述的方法，其中所述的变性溶液包含： i. 4M 胍盐-HC1 ; ii. 0. lMTris ； iii. lOmMEDTA ； iv. 5mMGSH或半胱氨酸； ν· ρΗ8· 0〇
19. 根据权利要求15所述的方法，其中所述的重折叠溶液包含： i. 0· 5-1. 0Μ的分子伴侣； ii. Ι-lOmM的金属螯合剂； iii. 0. 1-lOmM的氧化还原改组系统； iv. ρΗ8. 0-ρΗ11. 0〇
20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述的重折叠溶液包含： i. 0.75M精氨酸； ii. 5mMEDTA ； iii. ImML-半胱氨酸和5mML-Cysteine，或者lmMGSSG(氧化的谷胱甘肽）和5mMGSH(还 原的谷胱甘肽）； iv· pH9. 5〇
21. 根据权利要求15和17-20所述的方法，其中所述的重折叠是以脉冲复性的形式进 行的。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中与脉冲复性过程中所述的最终重折叠体积相 关，所述的胍盐HC1的浓度不超过〇. 3M，所述的蛋白质的浓度/脉冲不应该超过5〇μ g/ml。
23. 根据权利要求15的任意一项所述的方法，其中所述的proNGF突变体是通过混合模 式层析而纯化的。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述的层析柱为具有合成亲和配体的混合模式 材料柱。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中混合模式材料柱为具有4-巯基-乙基-吡啶 (MEP)、己基氨基（HEA)、苯丙氨基（PPA)、2-巯基-5苯并咪唑磺酸（MBI)、CaptoMMC(GEHC)、 N-苯甲基-N-甲基乙醇胺（GEHC)、CHT羟磷灰石或CHTfluoroapatide的柱。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述的混合模式材料柱为具有4-巯基-乙 基-吡啶（MEP)的柱。
27. 根据权利要求14至26所述的方法，其中所述的原形式的proNGF突变体是通过蛋 白酶切割的。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中其中所述的原形式的proNGF突变体是通过丝氨 酸蛋白酶切割的。
29. 根据权利要求28的任意一项所述的方法，其中所述的原形式的proNGF突变体是通 过胰蛋白酶切割的。
30. 权利要求27至29所述的方法，其中所述的胰蛋白酶与proNGF突变体的比例为 1:200-1:100000。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中根据重量，所述的胰蛋白酶与proNGF突变体的 比例为 1:5000-1:20000。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述的胰蛋白酶与proNGF突变体的比例为 l:10000(w/w)的比例。
33. 权利要求14至32所述的方法，其进一步包括纯化β -NGF的额外步骤。
34. 权利要求33所述的方法，其进一步包括通过柱层析纯化β-NGF的额外步骤。
35. 权利要求34所述的方法，其进一步包括通过SPSepharoseHP柱纯化β-NGF的额外 步骤。
36. 根据权利要求1-14的任意一项所述的proNGF突变体在生产β -NGF中的用途。
【文档编号】C07K14/48GK104203264SQ201280062855
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月19日
【发明者】S·洛里, B·简诺瓦斯基, H·帕特克, D·卡特曼, A·帕蒂尔, A·安东 申请人:瓦克化学有限公司