一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基，属于农业生物【技术领域】。本发明的诱变培养基是在再生培养基的基础上添加30-40mg/L的平阳霉素。本发明获得红色马铃薯突变体的方法，是将紫色马铃薯方片置于诱变培养基培养15天，然后移至再生培养基上培养；培养条件：22±2℃、光照强度700lx、光照时间8h/d、相对湿度65-75%。采用本发明的诱导培养基及诱导方法，诱导15天后，则能诱导紫色马铃薯发生突变，通过进一步培养则能获得能够结出红色块茎的马铃薯再生苗。
【专利说明】一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基，属于农业生物
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 马铃薯是世界第四大粮食作物，也是我国食物安全体系的重要组成部分。马铃薯 营养丰富，有"地下苹果"之称。马铃薯含有丰富的抗氧化剂，主要的氧化剂是酚类，抗坏血 酸，类胡萝卜素，生育酚，a-硫辛酸，和硒。多酚类的抗氧化剂主要是L-酪氨酸，咖啡酸， 绿原酸等。而彩色马铃薯除了含有上述抗氧剂外，还富含具有明显抗氧化作用的保健型天 然花青素色素，它的含量是普通白肉马铃薯的两至三倍，甚至更高。另外，彩色马铃薯不仅 具有普通马铃薯的优良特性，并且肉质鲜艳，外观诱人，逐渐受到人们的喜爱。除原产地安 第斯外，其他地区的彩色马铃薯资源很少，中国也不例外，并且种植品种单一，主要为黄色 薯肉的马铃薯品种。由于中国国情的需要，前期的育种目标主要以高产为主。近年来，随着 生活水平的提高，人们开始选择更为健康的饮食，逐渐关注具有营养保健作用的彩色马铃 薯品种。我国通过品种引进等方式获得了彩色马铃薯品种，但是这些品种数量很少，且多为 晚熟品种，在我国表现为产量和品质较低。所以通过诱变途径获得新的彩色马铃薯品种可 以丰富马铃薯市场，满足人们的需要。
[0003] 目前诱变马铃薯突变体的主要采用EMS诱变和辐照技术，由于EMS具有极强的毒 性，并且所获的变异株容易恢复，所以应用受到限制。而辐照技术多产生负面的变异，正面 的变异很少。
【发明内容】
[0004] 为了获得彩色马铃薯的突变体，本研究利用紫色马铃薯薯块为材料，采用离体诱 变技术与平阳霉素再生技术相结合的方式，获得了红皮红肉的马铃薯突变体。
[0005] 本发明技术方案如下： 一种诱变培养基，在每升再生培养基的基础上添加30-40mg平阳霉素； 所述再生培养基包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝； 所述无机物包括浓度范围在165-2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁的硝酸盐、 磷酸盐、硫酸盐、氯化物，浓度范围在0. 〇25-38mg/L的微量元素碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、 钥、钻； 所述有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、 甘氨酸中的一种或两种以上； 所述植物激素包括玉米素、萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸中的一种或两 种以上。
[0006] 上述诱变培养基，优选的，所用再生培养基由以下组分组成； (1)无机物 大量元素 硝酸钾 1900- 2108mg/L 硝酸铵 1600-1700 mg/L 憐酸二氢!钟 165-175 mg/L 硫酸镁 360-380 mg/L 氯化钙 430-450 mg/L ; 微量元素 碘化钾 0? 8-0. 9 mg/L 砸酸 5. 5-6. 5 mg/L 硫酸锰 16-17. 5mg/L 硫酸锌 9-10 mg/L 钥酸钠 0? 2-0. 3 mg/L 硫酸铜 0? 02-0. 03 mg/L 氯化钴 0? 02-0. 03 mg/L 硫酸亚铁 27-28 mg/L 乙二胺四乙酸二钠 37-38 mg/L; (2) 有机物 水解酪蛋白 0-300 mg/L 酵母提取物 0-500 mg/L 水解乳蛋白 0_500mg/L 肌醇 80-120 mg/L 烟酸 0. 4-0. 6 mg/L 盐酸批咳醇 0. 4-0. 6 mg/L 盐酸硫胺素 0? 05-0. 15 mg/L 甘氨酸 1-2 mg/L ; (3) 植物激素 6_苄氨基腺嘌呤 1-4 mg/L 萘乙酸 0? 001-0. I mg/L 激动素 0-2. 0 mg/L 玉米素 l-4mg/L 吲哚乙酸 0? 5-2 mg/L (4) 鹿糖 25-35 g/L ; (5) 倍力凝 3.5-4.5 g/L。 更优选的，所用再生培养基由以下组分组成； (1)无机物 大量元素 硝酸钾 2108 mg/L 硝酸铵 1650 mg/L 磷酸二氢钾170 mg/L 硫酸镁 370 mg/L 氯化1丐 440 mg/L ； 微量元素 碘化钾 0? 83 mg/L 硼酸 6. 0 mg/L 硫酸猛 16. 9 mg/L 硫酸锌 9. 6 mg/L 钥酸钠 0? 25mg/L 硫酸铜 0? 025mg/L 氯化钴 0? 025mg/L 硫酸亚铁 27. 8 mg/L 乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L ; (2) 有机物 水解酪蛋白 100 mg/L 酵母提取物 250 mg/L 水解乳蛋白 100mg/L 肌醇 100 mg/L 烟酸 0? 5 mg/L 盐酸批咳醇 0. 5 mg/L 盐酸硫胺素 0. I mg/L 甘氨酸 2 mg/L ; (3) 植物激素 6_苄氨基腺嘌呤 I. Omg/L 萘乙酸 0? 005 mg/L 激动素 0. 5 mg/L 玉米素 4 mg/L 口引哚乙酸 I mg/L (4) 蔗糖 30 g/L; (5) 倍力凝 4 g/L。 上述诱变培养基，其中平阳霉素的浓度优选为37. 5mg/L。
[0007] 上述诱变培养基配制方法：按照配方准确称量各组分，加去离子水充分溶解，定 容，调整pH至5. 8-6. 0,分装，121 °C灭菌15分钟；所用试剂为分析纯。
[0008] 上述诱变培养基，是在再生培养基的基础上添加了特定量的平阳霉素。没有添加 平阳霉素的再生培养基，仅能够将马铃薯茎块培育出没有发生突变的再生苗；而添加了平 阳霉素的诱导培养基，诱导15天后，则能诱导紫色马铃薯发生突变，通过进一步培养则能 获得能够结出红色块茎的马铃薯再生苗。而且，本发明通过进一步研究发现，激素种类和 水平、平阳霉素的浓度和诱导时间决定了诱导结果；如果激素种类和水平、平阳霉素的浓度 任何一因素超出本发明所限定的范围则无法获得目标再生苗"能够结出红色马铃薯的再生 苗"。
[0009] -种获得红色马铃薯突变体的方法， 将紫色马铃薯方片置于诱变培养基培养15天，然后移至再生培养基上培养；培养条 件：22±2°C、光照强度700 lx、光照时间8h/d、相对湿度65-75% ; 所述再生培养基为本发明上述的任意一种再生培养基； 所述诱变培养基为本发明上述的任意一种诱变培养基。
[0010] 所述培养条件是指诱变培养条件和再生培养条件。
[0011] 上述方法，在再生培养基上的培养时间根据再生苗的生长态势而定。本发明中，在 再生培养基上的培养时间为两个月。
[0012] 本发明的方法，采用先诱变培养15天，然后再在再生培养基上培养；二者的顺序 不能颠倒，否则无法获得目标再生苗。诱变培养的时间也不能改变，否则也无法获得目标再 生苗。本发明的光照培养条件，显著提高了再生苗数量。
[0013] 上述方法，其具体步骤为： 待处理样品的准备：取收获30天、还未发芽的紫色马铃薯块茎为材料；先用自来水将 其表面冲洗干净，然后用自来水连续冲洗30分钟以上，接着用0. 1%的升汞或次氯酸钠溶液 表面灭菌10分钟，最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次；在无菌条件下，用解剖刀将 紫色马铃薯块茎的皮切掉，切掉薯皮的厚度在Imm以上；然后将中间的薯肉切成长0. 5cm、 宽0. 5cm、厚度0. Icm的方片，即得紫色马铃薯方片； 块茎切片接种：将紫色马铃薯方片放置在本发明的块茎诱导突变体的培养基上，在温 度为22±2°C，光照强度700 lx，光照时间8h/d，相对湿度65-75%的培养室内培养15天 后移至再生培养基上。
[0014] 将切掉薯皮的厚度限定在Imm以上，是为了防止块茎的芽眼组织的存在。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为紫色马铃薯及其红色突变体(红色马铃薯）的外貌图； 图2为紫色马铃薯及其红色突变体(红色马铃薯）的切面图。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 称取： (1) 无机物：硝酸钾2108mg，硝酸铵1650 mg，磷酸二氢钾170 mg，硫酸镁370 mg，氯化 ?丐440 mg,碘化钾0. 83 mg,硼酸6. 0 mg,硫酸猛16. 9 mg,硫酸锌9. 6mg，钥酸钠0. 25mg，硫 酸铜0. 025mg，氯化钴0. 025mg，硫酸亚铁27. 8 mg,乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg ; (2) 有机物：水解酪蛋白100 mg,酵母提取物250 mg,水解乳蛋白IOOmg,肌醇100 mg, 烟酸0. 5 mg,盐酸批卩多醇0. 5 mg,盐酸硫胺素0. I mg,甘氨酸2 mg ; (3) 植物激素：6-苄氨基腺嘌呤I. Omg，萘乙酸0. 005mg，激动素0. 5mg，吲哚乙酸 I. Omg,玉米素 4mg ; (4) 蔗糖 30 g; (5) 倍力凝 4g; 配制方法：将称取的各组分加去离子水充分溶解，定容至1L，调整pH至5. 8-6.0,分装， 121°C灭菌15分钟，得再生培养基； 还可以先将称取的无机物、有机物和植物激素加去离子水充分溶解配成母液，再加入 其余组分充分溶解，定容1L，调整pH至5. 8-6. 0,分装，灭菌得再生培养基。
[0017] 实施例2 称取： (1) 无机物：硝酸钾1900 mg，硝酸铵1650 mg，磷酸二氢钾170 mg，硫酸镁370 mg，氯化 ?丐440 mg,碘化钾0.83 mg,硼酸6.0 mg,硫酸猛16. 9 mg,硫酸锌9. 6 mg,钥酸钠0.25mg， 硫酸铜〇. 〇25mg，氯化钴0. 025mg，硫酸亚铁27. 8 mg,乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg ; (2) 有机物：肌醇100 mg,烟酸0. 5 mg,盐酸批卩多醇0. 5 mg,盐酸硫胺素0. I mg,甘氨 酸 2 mg ; (3) 植物激素：6-节氨基腺噪呤I. Omg，萘乙酸0. Olmg,激动素0. 5mg，卩引哚乙酸I. Omg， 玉米素4mg ; (4) 蔗糖 30 g; (5) 倍力凝 4 g ; 配置方法：同实施例1。
[0018] 实施例3 称取： (1) 无机物：硝酸钾1900 mg，硝酸铵1600 mg，磷酸二氢钾175 mg，硫酸镁360 mg，氯化 ?丐430 mg,碘化钾0.83 mg,硼酸6.0 mg,硫酸猛16. 9 mg,硫酸锌9. 6 mg,钥酸钠0.25mg， 硫酸铜〇. 〇25mg，氯化钴0. 025mg，硫酸亚铁27. 8 mg,乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg ; (2) 有机物：肌醇100 mg,烟酸0. 5mg，盐酸批B多醇0. 5 mg,盐酸硫胺素0. lmg，甘氨酸1 mg ； (3) 植物激素：6-苄氨基腺嘌呤I. Omg，萘乙酸0. 005mg，激动素0. 5mg，吲哚乙酸 I. Omg,玉米素 4mg ; (4) 蔗糖 30 g; (5) 倍力凝 3.5 g; 配置方法：同实施例1。
[0019] 实施例4 称取： (1) 无机物：硝酸钾2108mg，硝酸铵1700 mg，磷酸二氢钾165 mg，硫酸镁380 mg，氯化 ?丐450 mg,碘化钾0. 83 mg,硼酸6. 0 mg,硫酸猛16. 9 mg,硫酸锌9. Omg,钥酸钠0. 25mg，硫 酸铜0. 025mg，氯化钴0. 025mg，硫酸亚铁27. 8 mg,乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg ; (2) 有机物：水解酪蛋白100 mg,酵母提取物250 mg,水解乳蛋白200mg，肌醇100 mg, 烟酸0. 5 mg,盐酸批卩多醇0. 5 mg,盐酸硫胺素0. I mg,甘氨酸2 mg ; (3) 植物激素：6-节氨基腺噪呤I. Omg，萘乙酸0. Olmg,激动素0. 5mg，卩引哚乙酸I. Omg， 玉米素4mg ; (4) 蔗糖 30 g; (5) 倍力凝 4.5 g; 配置方法：同实施例1。
[0020] 实施例5 采用实施例1的配比和配置方法制备五份再生培养基(每份为1L)，然后分别加入 20mg、30mg、37. 5mg、40mg、55mg平阳霉素；即得相应的诱变培养基D1、A1、A2、A3、D2; 分别采用实施例2-4的配比和配置方法制备再生培养基(每份为1L)，然后均加入 37. 5mg平阳霉素；即得相应的诱变培养基A4、A5、A6。
[0021] 诱变实验 步骤一、待处理样品的准备： 取收获30天、还未发芽的紫色马铃薯块茎为材料，先用自来水将其表面冲洗干净。然 后用自来水连续冲洗30分钟以上，接着用0. 1%的生汞表面灭菌10分钟(也可用次氯酸钠 溶液)，最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次。在无菌条件下，用解剖刀将紫色马铃 薯块茎的皮切掉。为了防止块茎的芽眼组织的存在，切掉薯皮的厚度应在Imm以上。然后 将中间的薯肉切成长〇. 5cm、宽0. 5cm、厚度0. Icm的方片，即得紫色马铃薯方片； 步骤二、诱变、再生培养 诱变、再生培养（1):将8块紫色马铃薯方片分别放置在诱变培养基A1、A2、A3、A4、A5、 A6、Dl、D2上培养15天；然后移至相应的再生培养基上培养两个月；分别获得再生苗；培养 条件：22°C，光照强度700 lx，光照时间8h/d，相对湿度70% ; 诱变、再生培养（2):将一块紫色马铃薯方片放置在诱变培养基A2上培养15天；然后 移至相应的再生培养基上培养两个月获得再生苗；培养条件：22°C，自然光照条件，相对 湿度70% ; 诱变、再生培养（3):将一块紫色马铃薯方片放置在诱变培养基A2上培养5天后，然后 移至相应的再生培养基上，培养条件：22°C，光照强度700 lx，光照时间8h/d，相对湿度 70%。
[0022] 诱变、再生培（4):将一块紫色马铃薯方片放置在诱变培养基A2上培养20天后，然 后移至相应的再生培养基上，培养条件：22°C，光照强度700 lx，光照时间8h/d，相对湿度 70%。
[0023] 步骤二中，所述"移至相应的再生培养基"是指：将在诱变培养基A1、A2、A3、D1、D2 培养过的马铃薯方片均转移至实施例1制备的再生培养基；将在诱变培养基A4培养过的马 铃薯方片均转移至实施例2制备的再生培养基；将在诱变培养基A5培养过的马铃薯方片均 转移至实施例3制备的再生培养基；将在诱变培养基A6培养过的马铃薯方片均转移至实施 例4制备的再生培养基； 按照上述实验步骤进行多次实验；统计在不同培养条件下获得的再生苗的平均数量占 所接种块茎数的百分比；然后将再生苗在相同的条件下栽培，观察所收获的马铃薯块茎的 颜色；结果如表1所示。
[0024] 表1，不同诱变、再生培养条件下马铃薯再生情况
【权利要求】
1. 一种诱变培养基，其特征在于，在每升再生培养基的基础上添加30-40mg平阳霉素； 所述再生培养基包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝； 所述无机物包括浓度范围在165-2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁的硝酸盐、 磷酸盐、硫酸盐、氯化物，浓度范围在0. 〇25-38mg/L的微量元素碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、 钥、钻； 所述有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、 甘氨酸中的一种或两种以上； 所述植物激素包括玉米素、萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸中的一种或两 种以上。
2. 根据权利要求1所述诱变培养基，其特征在于，所用再生培养基由以下组分组成； (1) 无机物 大量元素 硝酸钾 1900- 2108mg/L 硝酸铵 1600-1700 mg/L 憐酸二氧钟 165-175 mg/L 硫酸镁 360-380 mg/L 氯化钙 430-450 mg/L ; 微量元素 碘化钾 0? 8-0. 9 mg/L 砸酸 5. 5-6. 5 mg/L 硫酸锰 16-17. 5mg/L 硫酸锌 9-10 mg/L 钥酸钠 0? 2-0. 3 mg/L 硫酸铜 0? 02-0. 03 mg/L 氯化钴 0? 02-0. 03 mg/L 硫酸亚铁 27-28 mg/L 乙二胺四乙酸二钠 37-38 mg/L; (2) 有机物 水解酪蛋白 0-300 mg/L 酵母提取物 0-500 mg/L 水解乳蛋白 0_500mg/L 肌醇 80-120 mg/L 烟酸 0. 4-0. 6 mg/L 盐酸批咳醇 0. 4-0. 6 mg/L 盐酸硫胺素 0? 05-0. 15 mg/L 甘氨酸 1-2 mg/L ; (3) 植物激素 6_苄氨基腺嘌呤 1-4 mg/L 萘乙酸 0? 001-0. 1 mg/L 激动素 0-2. 0 mg/L 玉米素 l-4mg/L 吲哚乙酸 0? 5-2 mg/L (4) 鹿糖 25-35 g/L ; (5) 倍力凝 3.5-4.5 g/L。
3.根据权利要求2所述诱变培养基，其特征在于，所用再生培养基由以下组分组成； (1) 无机物 大量元素 硝酸钾 2108 mg/L 硝酸铵 1650 mg/L 磷酸二氢钾170 mg/L 硫酸镁 370 mg/L 氯化440 mg/L ； 微量元素 碘化钾 0? 83 mg/L 硼酸 6. 0 mg/L 硫酸猛 16. 9 mg/L 硫酸锌 9. 6 mg/L 钥酸钠 0? 25mg/L 硫酸铜 0? 025mg/L 氯化钴 0? 025mg/L 硫酸亚铁 27. 8 mg/L 乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L ; (2) 有机物 水解酪蛋白 100 mg/L 酵母提取物 250 mg/L 水解乳蛋白 100mg/L 肌醇 100 mg/L 烟酸 0? 5 mg/L 盐酸批咳醇 0. 5 mg/L 盐酸硫胺素 0. 1 mg/L 甘氨酸 2 mg/L ; (3) 植物激素 6_苄氨基腺嘌呤 1. Omg/L 萘乙酸 0? 005 mg/L 激动素 0. 5 mg/L 玉米素 4 mg/L 口引哚乙酸 1 mg/L (4) 蔗糖 30 g/L; (5)倍力凝 4 g/L。
4. 根据权利要求1、2或3所述诱变培养基，其特征在于，其中平阳霉素的浓度为 37. 5mg/L〇
5. -种获得红色马铃薯突变体的方法，其特征在于： 将紫色马铃薯方片置于诱变培养基培养15天，然后移至再生培养基上培养；培养条 件：22±2°C、光照强度700 lx、光照时间8h/d、相对湿度65-75% ; 所述再生培养基为权利要求1-4中任意一项所述的再生培养基； 所述诱变培养基为权利要求1-4中任意一项所述的诱变培养基。
6. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，在再生培养基上的培养时间为两个月。
7. 根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，其具体步骤为： 待处理样品的准备：取收获30天、还未发芽的紫色马铃薯块茎为材料；先用自来水将 其表面冲洗干净，然后用自来水连续冲洗30分钟以上，接着用0. 1%的升汞或次氯酸钠溶液 表面灭菌10分钟，最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次；在无菌条件下，用解剖刀将 紫色马铃薯块茎的皮切掉，切掉薯皮的厚度在1_以上；然后将中间的薯肉切成长0. 5cm、 宽0. 5cm、厚度0. lcm的方片，即得紫色马铃薯方片； 块茎切片接种：将紫色马铃薯方片放置在本发明的块茎诱导突变体的培养基上，在温 度为22±2°C，光照强度700 lx，光照时间8h/d，相对湿度65-75%的培养室内培养15天 后移至再生培养基上。
【文档编号】A01H4/00GK104381127SQ201410526873
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】刘芳, 杨元军, 王培伦, 董道峰, 陈广侠, 马蕾 申请人:山东省农业科学院蔬菜花卉研究所