表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途

表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
【专利摘要】本文报道，对于瞬时转染，人延伸因子1α启动子(含有内含子A)的使用提供增强的生产力(在LC-HC-SM组织中)，与使用SV40polyA信号序列相比，牛生长激素polyA信号序列的使用提供增强的生产力，在包含hCMV启动子的载体中，向bGH?PolyA信号序列加入HGT产生提高的生产力，载体组织LC(3`-5′)-HC-SM产生改善的表达。对于稳定库，据报道，用包含hEF1α启动子的载体产生的库在分批分析中显示增强的生产力，用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示减少的低产克隆数，且用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示更高的IgG表达稳定性。对于单克隆，据报道，选择标记放置在下游的载体组织(LC-HC-SM)对单克隆的生产力具有积极作用，且用包含bGH?polyA信号序列和hGT的载体产生的克隆具有更高的生产力。
【专利说明】表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
[0001]本文报道诸如启动子、POlyA信号序列和转录终止子的表达载体元件的新组合，表达载体组织，其组合，以及用于产生生产细胞系的新方法，如新的转染或选择方法，以及这些表达载体和生产细胞系在重组产生目的多肽中的用途。
【背景技术】
[0002]基因的转录水平可以对其表达水平具有强烈影响，并因此决定了细胞的生产力。它主要受三种载体元件影响:启动子、PolyA信号序列和(如果存在)转录终止子。
[0003]编码抗体重链的核酸通常包含在蛋白质成熟时去除的前导序列(信号序列)(约 57bp/19aa)、可变区 VH(约 350bp/115aa)和恒定区 CH(约 990bp/330aa)。编码抗体轻链的核酸通常由在蛋白质成熟时去除的前导序列(约66bp/22aa)、可变区VK或VL(约350bp/115aa)和恒定区 CK 或 CL(约 321bp/107aa)组成。
[0004]在真核细胞中重组产生抗体涉及产生表达系统(见McCafferty, J.等，(编辑)，Antibody Engineering, A Practical Approach.，IRL Press (1997))。为了发展抗体表达系统，产生包含轻链编码核酸的表达盒，该轻链编码核酸侧翼是启动子和多腺苷酸化(polyA)区。同样，产生包含重链编码核酸的重链表达盒，该重链编码核酸侧翼是启动子和polyA区。可以在包含重链和轻链表达盒二者的单个载体中将重链表达盒组合入轻链表达盒，或者可以整合入两个分开的载体。
[0005]US7, 053, 202中报道了免疫球蛋白DNA盒分子、单体(monobody)构建体、产生方法及其使用方法。在US5，168，062中，报道了含有人巨细胞病毒立即早期启动子调节DNA序列的转移载体和微生物。US5, 225，348中报道了含有人多肽链延伸因子_1 α的启动子区的DNA片段、其碱基序列及含有高度适用于具有高表达能力的广范围宿主细胞的DNA片段的表达质粒。在US5，266，491中，报道了含有SV40复制起点及具有人多肽链延伸因子_1 α基因的启动子区的DNA片段的表达质粒。US5，122，458中报道了重组DNA化合物和诸如tPA的多肽的表达。在US7，422，874中，报道了用于动物细胞的表达载体。
[0006]Sanna Pietro, P.报道了抗体Fab片段和全免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的表达(Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395)。Higuchi，K.等(J.1mmuno1.Meth.202 (1997) 193-204)报道了用于抗乙型肝炎表面抗原的人抗体的可变区的基因克隆的细胞展示文库。Kim，D.报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物表达系统(Biotechnol.Progressl9(2003) 1620-1622)。Costa, R.A.等(Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74 (2010) 127-138)报道了用于单克隆抗体产生的细胞工程的指导。Kim，D.W.等报道了用人延伸因子Ia启动子作为通用和有效的表达系统(Gene91 (1990) 217- 223)。Buchman，A.R.等(Mol.Cell.Biol.8 (1988) 4395-4405)报道了依赖内含子和不依赖内含子的基因表达的比较。Wang，F.等报道了哺乳动物细胞中的抗体表达(在 Therapeutic monoclonal antibodies-From bench to clinic, Wiley (2009) 557-572页中)。Li等(J.1mmunol.Meth.318(2007) 113-124)报道了用于重组IgG抗体的哺乳动物表达的不同载体设计的比较性研究。Ho，S.C.L.等报道了用于增强高单克隆抗体表达CHO细胞系的产生的IRES介导的三顺反子载体(J.Biotechnol.157(2011) 130—139)。Hotta, A.等(J.Biosc1.Bioeng.98(2004)298-303)报道了通过重组动物细胞产生抗-CD2嵌合抗体。Lee，J-C.等报道了肠道病毒71内部内糖体进入位点介导的高效蛋白质表达(Biotechnol.Bioeng.90 (2005) 656-662)。在 W02008/142124 中，报道了 Avian EBX⑩细胞中的重组蛋白质产生。
[0007]发明概述
[0008]已发现，表达载体的性能主要取决于其预期用途，用于瞬时转染、稳定库和单克隆选择的最佳载体不同。
[0009]为了突出主要发现:对于瞬时转染，抗体轻链和重链的双向表达及包括内含子A的全长hCMV启动子的使用是有利的。但是，对于稳定转染，已显示I)抗体轻链、2)抗体重链和3)选择标记的成行 排列是有利的。
[0010]虽然hEFl α启动子在稳定库中明显优于hCMV启动子，但发现了对单克隆水平的明显相反的作用。在此，用人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(hCMV)克隆获得了最高的生产力。
[0011]此外，hCMV启动子性能可以进一步通过将它与bGH POlyA信号和人胃泌素基因(hGT)的终止子序列组合来改善，其提高生产力和表达稳定性二者。
[0012]已发现，如果i)启动子是人巨细胞病毒启动子(hCMV)，polyA彳目号序列是牛生长激素PolyA信号序列(bGH polyA)，且终止子序列是人胃泌素基因转录终止子序列(hGT)，或2)启动子是人延伸因子I α启动子(hEFl a ), polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGH polyA),且终止子序列缺乏，则包含各含有启动子、结构基因和polyA彳目号序列及可选的终止子序列的抗体重链表达盒和抗体轻链表达盒的表达载体的使用导致转染后更高数目的产生/分泌抗体的细胞克隆。
[0013]通过使用上述表达载体，可以在转染后获得更高数目的产生/分泌抗体的细胞，从而减少了鉴定适合用于大规模重组抗体产生的高产细胞所需的努力。
[0014]因此，本文报道的一个方面是用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤:
[0015]a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞
[0016]-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒，
[0017]-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，和
[0018]从而获得大量重组哺乳动物细胞，
[0019]b)从该大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。
[0020]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0021]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0022]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
[0023]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
[0024]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
[0025]在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
[0026]本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤:
[0027]a)培养包含以下的哺乳动物细胞
[0028]-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒，
[0029]-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，和
[0030]b)从该细胞或培养基回收抗体。
[0031]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0032]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0033]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于稳定产生抗体。
[0034]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于瞬时产生抗体。
[0035]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
[0036]在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
[0037]本文报道的一个方面是表达载体，其包含:
[0038]-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒，
[0039]-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒。
[0040]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0041]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0042]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
[0043]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。[0044]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
[0045]已发现，对于稳定的重组抗体表达/分泌细胞系的产生，在将人延伸因子I α启动子(hEFla)与bGH polyA信号序列组合使用时，hGT终止子序列的存在降低了可获得的表
达产率。
[0046]本文报道的一个方面是用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤:
[0047]a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞
[0048]-按5’至3’方向包含hEFlα启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒，
[0049]-按5’至3’方向包含hEFlα启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒，和
[0050]从而获得大量重组哺乳动物细胞，
[0051]b)从该大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。
[0052]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0053]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0054]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
[0055]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
[0056]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
[0057]在一个实施方案中，该人延伸因子Ia启动子包含内含子A。
[0058]在一个实施方案中，该表达载体不含任何转录终止子序列。在一个实施方案中，该终止子序列是hGT序列。
[0059]在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
[0060]本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤:
[0061]a)培养包含以下的哺乳动物细胞
[0062]-按5’至3’方向包含hEFlα启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒，
[0063]-按5’至3’方向包含hEFlα启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒，和 [0064]b)从该细胞或培养基回收抗体。
[0065]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0066]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0067]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
[0068]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
[0069]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
[0070]在一个实施方案中，该人延伸因子Ia启动子包含内含子A。
[0071]在一个实施方案中，该表达载体不含任何转录终止子序列。在一个实施方案中，该终止子序列是hGT序列。
[0072]在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
[0073]本文报道的一个方面是表达载体，其包含:
[0074]-按5’至3’方向包含hEFla启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒，和 [0075]-按5’至3’方向包含hEFla启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒。
[0076]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0077]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0078]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
[0079]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
[0080]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
[0081]在一个实施方案中，该人延伸因子Ia启动子包含内含子A。
[0082]在一个实施方案中，该表达载体不含任何转录终止子序列。在一个实施方案中，该终止子序列是hGT序列。
[0083]已发现，对于抗体的稳定重组产生，包含以下的表达载体的使用导致稳定转染的重组哺乳动物细胞中提高的表达产率:
[0084]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
[0085]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
[0086]-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，[0087]由此三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。
[0088]与上文相反，已发现，对于抗体的瞬时重组产生，包含以下的表达载体的使用导致瞬时转染的重组哺乳动物细胞中提高的表达产率:
[0089]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
[0090]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
[0091]-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
[0092]由此该表达盒双向组织，由此该第一表达盒和该第二表达盒按相反方向排列。
[0093]术语“按相反方向”指一个表达盒按5’ - > 3’方向转录，一个表达盒按3’ - > 5’方向转录。
[0094]因此，本 文报道的一个方面是包含以下的表达载体在在哺乳动物细胞中稳定重组产生抗体中的用途:
[0095]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
[0096]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
[0097]-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
[0098]由此三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。
[0099]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0100]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0101]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二 POlyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
[0102]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEFl α启动子，该第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
[0103]在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是CHO细胞。
[0104]本文报道的一个方面是包含以下的表达载体:
[0105]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
[0106]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
[0107]-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
[0108]由此三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。[0109]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0110]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0111]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
[0112]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEFl α启动子，该第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
[0113]本文报道的一个方面是包含以下的表达载体在在哺乳动物细胞中瞬时重组产生抗体中的用途::
[0114]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
[0115]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
[0116]-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
[0117]由此该表达盒双向组织，由此该第一表达盒和该第二表达盒按相反方向排列。
[0118]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0119]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0120]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
[0121]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEFl α启动子，该第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
[0122]在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是HEK细胞。
[0123]本文报道的一个方面是包含以下的表达载体:
[0124]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
[0125]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
[0126]-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒， [0127]由此该表达盒双向组织，由此该第一表达盒和该第二表达盒按相反方向排列。
[0128]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0129]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。[0130]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
[0131]在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEFla启动子，该第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
[0132]此外，已发现，除了别的之外，包含含有内含子A的hCMV启动子和人EFl a启动子而不是不含内含子A的短的人CMV启动子的表达载体增强瞬时基因表达和库基因表达。
[0133]本文报道的一个方面是包含以下的表达质粒:
[0134]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸和第一polyA信号序列的
第一表达盒，
[0135]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸和第二polyA信号序列的
第二表达盒，
[0136]其中该表达盒中的一个或两个还在该polyA信号序列后面包含人胃泌素终止子序列。
[0137]在一个实施方案中，该第一和第二 polyA信号序列相互独立地选自SV40polyA信号序列和牛生长激素PolyA信号序列。
[0138]在一个 实施方案中，该第一和第二启动子相互独立地选自人CMV启动子、SV40启动子和人延伸因子Ia启动子。
[0139]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0140]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0141]在一个实施方案中，该第一表达盒和该第二表达盒单向排列。
[0142]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记双向排列。
[0143]本文报道的一个方面是本文报道的表达质粒在瞬时表达抗体或稳定表达抗体中的用途。
[0144]本文报道的一个方面是包含本文报道的表达质粒的真核细胞。
[0145]本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括步骤:
[0146]-培养包含本文报道的表达质粒的真核细胞或本文报道的细胞，
[0147]-从该真核细胞或培养基回收该抗体。
[0148]在一个实施方案中，该真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
[0149]本文报道的一个方面是包含以下的表达质粒:
[0150]-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸和第一polyA信号序列的
第一表达盒，
[0151]-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸和第二polyA信号序列的
第二表达盒，
[0152]其中该第一和/或第二启动子是人延伸因子I a启动子。
[0153]在一个实施方案中，该表达盒中的一个或两个在该polyA信号序列后面不包含人胃泌素终止子序列。
[0154]在一个实施方案中，该表达盒中的一个或两个不含人胃泌素终止子序列。
[0155]在一个实施方案中，该人延伸因子Ia启动子包含内含子A。
[0156]在一个实施方案中，该第一和第二 polyA信号序列相互独立地选自SV40polyA信号序列和牛生长激素PolyA信号序列。
[0157]在一个实施方案中，该第一和第二启动子相互独立地选自人CMV启动子、SV40启动子和人延伸因子Ia启动子。
[0158]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
[0159]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
[0160]在一个实施方案中，该第一表达盒和该第二表达盒单向排列。
[0161]在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。
[0162]在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记双向排列。
[0163]本文报道的一个方面是本文报道的表达质粒在瞬时表达抗体或稳定表达抗体中的用途。
[0164]本文报道的一个方面是包含本文报道的表达质粒的真核细胞。
[0165]本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括步骤:
[0166]-培养包含本文报道的表达质粒的真核细胞或本文报道的细胞，
[0167]-从该真核细胞或培养基回收该抗体。
[0168]在一个实施方案中，该真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
[0169]本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和polyA信号序列的表达质粒，由此该IRES元件是EMCV-1RES元件。
[0170]在一个实施方案中，该核酸编码抗体重链。
[0171]在一个实施方案中，该选择标记是式A-C-S的融合蛋白质，由此A是可检测多肽，C是蛋白水解/[目号序列，而S是选择标记。
[0172]在一个实施方案中，该蛋白水解信号序列是鸟氨酸脱羧酶的PEST序列。
[0173]在一个实施方案中，该可检测多肽是绿色荧光蛋白。
[0174]在一个实施方案中，该选择标记是新霉素。
[0175]本文报道的一个方面是编码按N端至C端方向包含绿色荧光蛋白、鸟氨酸脱羧酶的PEST序列和新霉素的多肽的核酸。
[0176]本文报道的一个方面是编码按N端至C端方向包含绿色荧光蛋白、鸟氨酸脱羧酶的PEST序列和新霉素的多肽的核酸在选择抗体分泌细胞中的用途。
[0177]本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和polyA信号序列的表达盒在选择抗体产生细胞中的用途，由此该IRES元件是EMCV-1RES元件。
[0178]在一个实施方案中，该核酸编码抗体重链。[0179]在一个实施方案中，该选择标记是式A-C-S的融合蛋白质，由此A是可检测多肽，C是蛋白水解/[目号序列，而S是选择标记。
[0180]在一个实施方案中，该蛋白水解信号序列是鸟氨酸脱羧酶的PEST序列。
[0181 ] 在一个实施方案中，该可检测多肽是绿色荧光蛋白。
[0182]在一个实施方案中，该选择标记是新霉素。
[0183]本文报道的一个方面是用于选择表达抗体的真核细胞的方法，其包括以下步骤:
[0184]-培养包含i)此方面中报道的表达质粒和ii)编码不由此方面中报道的表达质粒编码的各其他抗体链的核酸的真核细胞，
[0185]-选择表达该可检测多肽的细胞。
[0186]本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸和polyA信号序列的表达质粒，由此该IRES元件是EV71-1RES 元件。
[0187]在一个实施方案中，该启动子序列选自含有或不含内含子A的人CMV启动子序列、SV40启动子序列，和含有或不含内含子A的人延伸因子I α启动子序列。
[0188]在一个实施方案中，该polyA信号序列选自牛生长激素polyA信号序列和SV40polyA信号序 列。
[0189]在一个实施方案中，该质粒在polyA信号序列3’包含人胃泌素终止子序列。
[0190]本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸序列和polyA信号序列的表达质粒在表达抗体中的用途，由此该IRES元件是EV71-1RES元件。
[0191]在一个实施方案中，该启动子序列选自含有或不含内含子A的人CMV启动子序列、SV40启动子序列，和含有或不含内含子A的人延伸因子I α启动子序列。
[0192]在一个实施方案中，该polyA信号序列选自牛生长激素polyA信号序列和SV40polyA信号序列。
[0193]在一个实施方案中，该质粒在polyA信号序列的3’包含人胃泌素终止子序列。
[0194]本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤:
[0195]-培养包含本文报道的表达质粒的真核细胞，
[0196]-从该细胞或培养基回收该抗体，从而产生抗体。
[0197]在一个实施方案中，该hCMV启动子具有SEQ IDNO:01的序列。这是不含内含子A且不含5’ UTR的hCMV启动子。
[0198]在一个实施方案中，该hCMV启动子具有SEQ IDNO:02的序列。这是不含内含子A而含有5’ UTR的hCMV启动子。
[0199]在一个实施方案中，该hCMV启动子具有SEQ IDNO:03的序列。这是含有内含子A的全长hCMV启动子。
[0200]在一个实施方案中，该人延伸因子I α启动子具有SEQ ID NO:04的序列。这是不含内含子A的hEFla启动子。
[0201]在一个实施方案中，该人延伸因子I α启动子具有SEQ ID NO:05的序列。这是含有内含子A的hEFla启动子。
[0202]在一个实施方案中，该人延伸因子I α启动子具有SEQ ID NO:06的序列。这是含有内含子A且含有5’ UTR的短的hEFla启动子。
[0203]在一个实施方案中，该大鼠CMV启动子具有SEQ ID NO:07的序列。
[0204]在一个实施方案中，该SV40polyA信号序列具有SEQ ID NO:08的序列。
[0205]在一个实施方案中，该牛生长激素polyA信号序列具有SEQ ID NO:09的序列。
[0206]在一个实施方案中，该人胃泌素终止子具有SEQ ID NO:10的序列。
[0207]在一个实施方案中，该SV40启动子具有SEQ ID NO: 11的序列。
[0208]在一个实施方案中，该鸟氨酸脱羧酶的PEST序列由SEQ ID NO:12的序列编码。
[0209]在一个实施方案中，该GFP序列由SEQ ID NO:13的序列编码。
[0210]在一个实施方案中，该新霉素选择标记具有SEQ ID NO:14的序列。
[0211]在一个 实施方案中，该GFP-PEST-NE0融合多肽由SEQ ID NO:15的序列编码。
[0212]在一个实施方案中，该EMCV-1RES具有SEQ ID NO:16的序列。
[0213]在一个实施方案中，该EV71-1RES具有SEQ ID NO: 17的序列。
[0214]在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该抗体是双特异性抗体。
[0215]在一个实施方案中，该双特异性抗体具有特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性或结合部位，且该双特异性抗体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异性或结合部位。
[0216]在一个实施方案中，该表达载体包含:
[0217]-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒，
[0218]-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒，
[0219]-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒，
[0220]-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第四表达盒，
[0221]或
[0222]-按5’至3’方向包含启动子、编码抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒，
[0223]-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒，和
[0224]-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒，
[0225]由此该抗体轻链是两条抗体重链的共同轻链。
[0226]在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该表达载体包含:
[0227]-抗体轻链表达盒，
[0228]-第一抗体重链表达盒，
[0229]-第二抗体重链表达盒，和
[0230]-选择标记表达盒，
[0231]其中该抗体重链表达盒的至少一个、该抗体轻链表达盒和该选择标记表达盒单向排列，且
[0232]其中该单向表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列，或该单向表达盒按抗体轻链表达盒、抗体重链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。
[0233]在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该表达载体包含:
[0234]-第一抗体轻链表达盒，
[0235]-第二抗体轻链表达盒，
[0236]-第一抗体重链表达盒，
[0237]-第二抗体重链表达盒，和
[0238]-选择标记表达盒，
[0239]其中该抗体重链表达盒之一、该抗体轻链表达盒之一和该选择标记表达盒单向排列，且
[0240]其中该单向表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列，或该单向表达盒按抗体轻链表达盒、抗体重链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。 [0241]在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含白(hole)突变的抗体重链。
[0242]在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含杵(knob)突变的抗体重链。
[0243]在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链CHl结构域的抗体轻链，和/或该抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结构域的抗体轻链。
[0244]在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链，和/或该抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CHl结构域作为第一恒定结构域的抗体重链。
[0245]发明详述
[0246]1.一般方面
[0247]如本领域技术人员已知，重组DNA技术的使用使得能够产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如通过取代、改变、交换、缺失或插入来在单个或几个位置中修饰。该修饰或衍生化可以例如借助位点定向诱变来进行。本领域技术人员可以容易地进行这类修饰(见例如 Sambrook, J.等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, USA(1999))。重组技术的使用使得本领域技术人员能够用一种或多种异源核酸转化多种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但除了别的之外，隶属于不同物种的细胞可以具有不同的所谓密码子选择。由此相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由一种或多种不同的核酸编码。另外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。
[0248]重组DNA技术的使用使得能够产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如通过取代、改变、交换、缺失或插入来在单个或几个位置中修饰。该修饰或衍生化可以例如借助位点定向诱变来进行。本领域技术人员可以容易地进行这类修饰(见例如 Sambrook, J.等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York, USA(1999) ；Hames, B.D.和 Higgins, S.J., Nucleic acidhybridization-a practical approach, IRL Press, Oxford, England (1985))。
[0249]重组技术的使用使得能够用一种或多种异源核酸转化多种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但除了别的之外，隶属于不同物种的细胞可以具有不同的所谓密码子选择。由此相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由一种或多种不同的核酸编码。另外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。
[0250]定义
[0251]“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这类改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
[0252]本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。
[0253]“抗体片段”指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的部分，该部分结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’ _SH、F(ab' )2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);及从抗体片段形成的多特异性抗体。
[0254]术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种。
[0255]抗体的“种类”指它的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要种类的抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgGUIgG2UgG3UgG4UgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、Y和μ。
[0256]本文所用的术语“表达”指发生在细胞内的转录和/或翻译过程。可以根据存在于细胞中的相应mRNA的量来测定目的核酸序列在该细胞中的转录水平。例如，从目的序列转录的mRNA可以通过RT-PCR或通过Northern杂交来定量(见Sambrook等，1999,上文)。目的核酸编码的多肽可以通过多种方法来定量，例如通过ELISA，通过测定该多肽的生物学活性，或通过利用独立于这种活性的测定，如使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白的Western印迹或放射免疫测定(见Sambrook等，1999,上文)。
[0257]“表达盒”指包含在细胞中表达至少所含的核酸所必需的诸如启动子和聚腺苷酸化位点的调节元件的构建体。
[0258]“表达载体”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部元件的核酸。通常，表达质粒包含:例如用于大肠杆菌(E.coli)的原核质粒繁殖单位，其包含复制起点和选择标记；真核选择标记；及用于表达一个或多个目的结构基因的一个或多个表达盒，其各包含启动子、结构基因和聚腺苷酸化信号(polyA信号序列)。通常将基因表达置于启动子的控制下，并将这种结构基因称为与该启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则该调节元件和该核心启动子有效连接。
[0259]本文的术语 “Fe区”用来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)，NIH Pub I i cat ion91-3242 中所述的EU编号系统，也称为EU指数。
[0260]“Fe区”是众所周知的术语，根据抗体重链的木瓜蛋白酶切割定义。在一个实施方案中，本文报道的复合物可以包含人Fe区或衍生自人来源的Fe区作为抗体重链铰链区多肽。在另一实施方案中，该Fe区是IgG4亚类的人抗体的Fe区，或IgGl、IgG2或IgG3亚类的人抗体的Fe区，其以这样的方式修饰，使得没有Fe Y受体(例如Fe Y RIIIa)结合和/或没有Clq结合可被检测到。在一个实施方案中，该Fe区是人Fe区，且尤其是来自人IgG4亚类或来自人IgGl亚类的突变Fe区。在一个实施方案中，该Fe区来自具有突变L234A和L235A的人IgGl亚类。1864显示减少的？(^受体(Fe Y RIIIa)结合，但其他IgG亚类的抗体显示强结合。但是，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc糖类的丧失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Iys288、Thr307、Gln311、八811434或/和把8435是在改变时也提供减少的？(^受体结合的残基(Shields，R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604 ；Lund, J.等，FASEB J.9(1995) 115-119 ；Morgan, A.等，Immunology86 (1 995) 319-324 ;EP0307434)。在一个实施方案中，本文报道的一个方面中待表达的抗体是关于IgG4亚类或IgGl或IgG2亚类的Fe Y受体结合，在L234、L235和/或D265中具有突变，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，该突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236 (PVA236表示用PVA取代IgGl的从氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸密码给出)或IgG4的EFLG)。在一个实施方案中，该突变是IgG4的S228P及IgGl的L234A和L235A。抗体的Fe区直接涉及ADCC (依赖抗体的细胞毒性)和CDC (依赖补体的细胞毒性)。不结合Fe Y受体和/或补体因子Clq的复合物不引出抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。杵修饰表示抗体CH3结构域中的突变T366W(Kabat编号)。臼修饰表示抗体CH3结构域中的突变T366S、L368A和Y407V。除杵和臼修饰外，一个CH3结构域中可以存在突变S354C，另一个CH3结构域中可以存在突变Y349C。
[0261]“构架区”或“FR”指高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下顺序出现在 VH (或 VL)中:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0262]术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有包含本文定义的Fe区的重链的抗体。
[0263]“基因”表示核酸，其是例如染色体上或质粒上可以影响肽、多肽或蛋白质的表达的区段。除编码区(即结构基因)外，基因包含其他功能性元件来例如信号序列、一个或多个启动子、内含子和/或终止子。
[0264]术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，但可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
[0265]“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0266]“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR (例如CDR)对应于非人抗体的那些，全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以可选地包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。
[0267]本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的区域中的每一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR ;三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3) oHVR —般包含来自高变环和/或来自“互补决定区” (CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基 26-32 (LI)、50-52 (L2) ,91-96 (L3) ,26-32 (Hl) ,53-55 (H2)和 96-101 (H3)(Chothia，C.和 Lesk，A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性 CDR(CDR-L1、CDR_L2、⑶R-L3、⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3)存在于LI的氨基酸残基24_34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、Hl的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65和H3的氨基酸残基 95-102 (Kabat, E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIHPublication91-3242)。除VH中的CDRl外，CDR —般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在⑶R的称为缩短的⑶R或 a-CDR 的区域内。示例性 a-CDR(a-CDR-Ll、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2 和a-CDR-H3)存在于LI的氨基酸残基31_34、L2的氨基酸残基50_55、L3的氨基酸残基89-96、Hl的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102 (Almagro,J.C.和 Fransson, J.，Front.Biosc1.13(2008) 1619-1633)。除非另有说明，本文按照 Kabat等，上文编号可变结 构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)。
[0268]“内部核糖体进入位点”或“IRES”描述这样的序列，其在功能上促进独立于IRES的基因5'的翻译起始，并允许在动物细胞内从单个转录物翻译两个顺反子(可读框)。IRES提供独立的核糖体进入位点用于翻译刚好处于其下游(下游在本文中可与3’互换使用)的可读框。不像细菌mRNA(其可以是多顺反子，即编码从mRNA顺次翻译的几种不同多肽)，动物细胞的大多数mRNA是单顺反子，仅编码一种蛋白质的合成。对于真核细胞中的多顺反子转录物，翻译将从最靠近5’的翻译起始位点起始，在第一终止密码子处终止，转录物将从核糖体释放，导致仅翻译mRNA中的第一编码多肽。在真核细胞中，具有与转录物中的第二或后续可读框有效连接的IRES的多顺反子转录物允许连顺次翻译该下游可读框来产生由同一转录物编码的两种或多种多肽。之前已描述了 IRES元件在载体构建中的用途，见例如Pelletier, J.等，Nature334 (1988) 320-325 ; Jang,S.K.等，J.Virol.63 (1989) 1651-1660 ；Davies, Μ.V.等，J.Virol.66 (1992) 1924-1932 ；Adam, M.A.等，J.Virol.65(1991)4985-4990 ;Morgan，R.A.等 Nucl.AcidsRes.20(1992)1293-1299 ；Sugimoto, Y 等，Biotechnologyl2(1994)694-698 ；Ramesh, N.等，NucI.Acids Res.24 (1996) 2697-2700 ;和 Mosser，D.D.等，BioTechniques22(1997) 150-152)。
[0269]本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意具体的方法来产生抗体。例如，待按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，其包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
[0270]“天然抗体”指天然存在的具有不同结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由形成二硫键的两条相同的轻链和两条相同的重链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分配至两个类型之一，称为K和λ。 [0271]本文所用的“核酸”指由单核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t (或RNA中的u)组成的聚合物分子，例如DNA、RNA或其修饰。此多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一种或多种天然存在的多核苷酸分子与一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。此定义还涵盖其中改变(例如通过诱变)、缺失或加入了一个或多个核苷酸的天然存在的多核苷酸分子。核酸可以是分离的，或整合入另一核酸(例如表达盒)、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸同样表征为其由单核苷酸组成的核酸序列。
[0272]对本领域技术人员而言，将例如多肽的氨基酸序列转化为编码此氨基酸序列的相应核酸序列的流程和方法众所周知。因此，核酸表征为其由单核苷酸组成的核酸序列，并同样表征为由此编码的多肽的氨基酸序列。
[0273]本文所用的“核酸”指编码可以重组产生的多肽的天然存在或部分或完全非天然存在的核酸。核酸可以由分离的或通过化学手段合成的DNA片段建成。核酸可以整合入另一核酸，例如表达质粒或真核宿主细胞的基因组/染色体中。质粒包括穿梭质粒和表达质粒。通常，该质粒还将包含原核繁殖单位，该原核繁殖单位含有原核生物中的质粒的分别用于复制和选择的复制起点(例如ColEl复制起点)和选择标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性基因)。
[0274]“有效连接的”指两种或多种成分的并列，其中所述成分处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系中。例如，如果启动子和/或增强子顺式作用来控制或调节所连接的序列的转录，则它与编码序列有效连接。通常，但并非必然，“有效连接的”DNA序列是相邻的，且在有必要连接两个蛋白质编码区(如分泌前导序列和多肽)时是相邻和符合(可读)框的。但是，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它冰粉必然与该编码序列相邻。增强子无需是相邻的。如果增强子增加编码序列的转录，则该增强子与该编码序列有效连接。有效连接的增强子可以位于编码序列上游、编码序列内或编码序列下游，且距启动子相当的距离。如果聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游端，使得转录通过该编码序列进入该聚腺苷酸化序列，则它与该编码序列有效连接。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游端(3’端)，使得翻译通过该编码序列行进至该终止密码子并在此处终止，则它与该外显子核酸序列有效连接。通过本领域已知重组方法来实现连接，例如，使用PCR方法和/或通过方便的限制位点处的连接。如果不存在方便的限制位点，则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
[0275]“多顺反子转录单位”是其中一个以上的结构基因处于同一启动子的控制下的转
录单位。
[0276]本申请内所用的术语“聚腺苷酸化信号”指用来诱导特定核酸序列区段的初级转录物的切割和聚腺苷酸化的核酸序列。包含聚腺苷酸化信号的3’非翻译区可以选自含有衍生自SV40、牛生长激素(bGH)基因、免疫球蛋白基因和胸苷激酶基因(tk，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶聚腺苷酸化信号)的聚腺苷酸化信号的3’非翻译区。
[0277]“启动子”指控制与它有效连接的基因/结构基因或核酸序列的转录的多核苷酸序列。启动子包含用于RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所使用的启动子将在考虑在其中表达所选择的序列的宿主细胞的细胞类型中具有功能。包括来自多种不同来源的组成型、诱导型和阻抑型启动子的大量启动子为本领域公知(并在诸如GenBank的数据库中标识)，且可作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(例如从诸如ATCC的保藏机构以及其他商业或个人来源)。
[0278]“启动子”包含指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子定位在基因的5’非编码或非翻译区中，靠近结构基因的转录起始位点。启动子内在起始转录中发挥作用的序列元件常表征为共有核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT 序列、分化特异性元件(DSE ；McGehee, R.E.等，Mol.Endocrinol.7 (1993) 551)、环 AMP 应答兀件(CR Es)、血清应答兀件(SRE ；Treisman, R., Seminars in CancerBiol.1 (1990)47)、糖皮质激素应答元件(GRE)及其他诸如CRE/ATF(0' Reilly, Μ.Α.等，J.Biol.Chem.267(1992) 19938), AP2 (Ye, J.等，J.Biol.Chem.269 (1994) 25728)、SPl、cAMP应答元件结合蛋白(CREB ；Loeken, M.R.，Gene Expr.3 (1993) 253)和八核苷酸因子(一般见 Watson 等，(编辑)，Molecular Biology of the Gene,第 4 版(The Benjamin/CummingsPublishing Company, Inc.(1987))及 Lemaigre, F.P.和 Rousseau, G.G., Biochem.J.303 (1994) 1-14)的转录因子的结合位点。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而提高。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调节。还已知阻抑型启动子。例如，c-fos启动子在生长激素结合其在细胞表面上的受体时特异性激活。可以通过由例如CMV启动子及随后的两个Tet操纵基因位点组成的人工杂合启动子来达到受四环素(tet)调节的表达。Tet阻抑物与两个Tet操纵基因位点结合，并阻断转录。加入诱导物四环素时，Tet阻抑物从Tet操纵基因位点释放,转录继续(Gossen, M.和Bujard, H.,PNAS89 (1992) 5547-5551)。对于包括金属硫蛋白和热休克启动子的其他诱导型启动子，见例如 Sambrook 等(上文)和 Gossen 等，Curr.0pin.Biotech.5 (1994) 516-520。在已鉴定为用于高水平表达的强启动子的真核启动子有SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-1启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、中国仓鼠延伸因子la (CHEF-1，见例如US5，888，809)、人EF-1 α、泛素和人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV IE)。
[0279]“启动子”可以是组成型或诱导型。增强子(即作用于启动子来增加转录的顺式作用DNA元件)可以有必要与启动子结合发挥作用来提高单独用启动子所获得的表达水平，且可以作为转录调节元件包括。通常，含有启动子的多核苷酸区段也将包括增强子序列(例如 CMV 或 SV40)。
[0280]本申请内所用的术语“稳定转化的”、“稳定转染的”或“稳定的”指外源核酸可遗传地和稳定地整合入宿主细胞基因组/染色体。在选择性生长条件下(即在一种或多种选择标记的存在下)细胞选择过程之后获得稳定转染的细胞。
[0281]“结构基因”指不含信号序列的基因区域，即编码区。
[0282]术语“转录终止子”指向RNA聚合酶发出终止mRNA合成的信号的长度为50-750个碱基对的DNA序列。尤其是在使用强启动子时，在表达盒的3’端用非常有效(强)的终止子来防止RNA聚合酶通读是明智的。无效的转录终止子可以导致操纵子样mRNA的形成，其可以是不希望的(例如质粒编码的)基因表达的原因。
[0283]在本发明的范围内，可以用基本上本领域已知的转染方法中的任一种来获得转染的细胞。例如，可以借助电穿孔或显微注射来将核酸引入细胞。备选地，可以使用诸如FuGENE6 (Roche Diagnostics GmbH,德国)、X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH,德国)和LipofectAmine (Invitrogen Corp.,美国)的脂转染试剂。还备选地，可以通过基于反转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒的适当的病毒载体系统来将核酸引入细胞(Singer，
0.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl (2004) 5313-5314)。
[0284]本申请内所用的术语“瞬时转染”指其中引入细胞的核酸不整合入该细胞的基因组或染色体DNA的方法。它实际上作为染色体外元件(例如作为附加体)维持在细胞中。附加体的核酸的转录过程不受影响，且例如产生由附加体的核酸编码的蛋白质。瞬时转染产生“瞬时转染的”细胞。
[0285]术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(见例如Kindt，T.J.等，KubyImmunology,第 6 版，W.H.Freeman and C0.，N.Y.(2007),第 91 页)。单个 VH 或 VL 结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(见例如Portolano, S.等，J.1mmunol.150(1993)880-887 ；Clackson, T.等，Nature352 (1991) 624-628)。
[0286]本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
[0287]抗体
[0288]本文提供的方法和组合物用于产生重组单克隆抗体。抗体可以具有多种结构，如但不限于单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、单价抗体、多价抗体(例如二价抗体)。
[0289]在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’ -SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段即下文所述的其他片段。某些抗体片段的综述见Hudson, P.J.等，Nat.Med.9 (2003) 129-134。scFv 片段的综述见例如 Plueckthun, A.，In:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 卷，Rosenburg 和 Moore (编辑)，Springer-Verlag, New York (1994)，第 269-315 页；还见 W01993/16185、US5, 571，894 和US5, 587，458。包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab' )2片段的讨论见美国专利号US5，869，046。
[0290]双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的(见例如 EP0404097 ；W01993/01161 ；Hudson,P.J.等，Nat.Med.9 (2003) 129-134 ;和 Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 6444-6448)。三抗体和四抗体还描述于 Hudson,P.J.等，Nat.Med.9 (2003) 129-134 中。
[0291]单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham, MA ;见例如 US6, 248，516B1)。
[0292]可以通过包括但不限于本文所述的完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生的多种技术来制备抗体片段。
[0293]在某些实施方案中，该抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如US4, 816，567 ;和 Morrison, S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81 (1984) 6851-6855 中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“种类转换”抗体，其中种类或亚类已从亲本抗体的种类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0294]在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体来降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)衍生自非人抗体，FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体还将可选地包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，用对应的来自非人抗体(例如从其衍生HVR残基的抗体)的残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
[0295]人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro, J.C.和Fransson,J.，Front.Biosc1.13 (2008) 1619-1633 中，并进一步描述于例如 Riechmann,1.等，Nature332 (1988) 323-329 ;Queen,C.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86 (1989) 10029-10033 ；US5, 821，337、US7, 527，791、US6, 982，321 和 US7, 087，409 ；Kashmiri, S.V.等，Methods36 (2005) 25-34 (描述 SDR(a-CDR)移植);Padlan，Ε.A.，Mol.1mmunol.28(1991)489-498(描述“重修表面”)；Dall，Acqua，W.F.等，Methods36 (2005) 43-60(描述 “FR 改组”)；Osbourn, J.等，Methods36 (2005) 61-68 ；和Klimka, A.等，Br.J.Cancer83 (2000) 252-260 (描述 FR 改组的“指导选择”途径)中。
[0296]可以用来进行人源化的人构架区包括但不限于:用“最适”法选择的构架区(见例如Sims，M.J.等，J.1mmunol.151(1993)2296-2308);衍生自具体亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(见例如Carter, P.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89 (1992) 4285-4289 ；和 Presta, L.G.等，J.1mmunol.151 (1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(见例如Almagro, J.C.和Fransson,J.，Front.Biosc1.13(2008) 1619-1633);和衍生自筛选FR文库的构架区(见例如 Baca, M.等，J.Biol.Chem.272 (1997) 10678-10684 和 Rosok, M.J.等，J.Biol.Chem.271(199692 2611-22618)。
[0297]在某些实施方案中，该抗体是人抗体。可以用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体通常描述于 van Dijk, Μ.Α.和 van de Winkel, J.G., Curr.0pin.Pharmacol.5 (2001) 368-374 及 Lonberg, N.，Curr.0pin.Tmmunol.20 (2008) 450-459 中。
[0298]可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合入动物的染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述见Lonberg，N.,Nat.Biotech.23(2005) 1117-1125，还见例如描述
XEN0M0USE? 技术的 US6, 075，181 和 US6, 150，584 ；描述HuMab? 技术的 US5, 770，429 ;描述 K-M MOUSE?.技术的 US7，041，870 ；描述 VelociMoUSe⑧技术的 US2007/0061900。
可以例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区。 [0299]还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor, D.,J.1mmunol.133(1984)3001-3005 ；Brodeur, B.R.等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York(1987),51-63 页；及Boerner, P.等，J.1mmunol.147(1991)86-95)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于 Li，J.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA103 (2006) 3557-3562 中。其他方法包括描述于例如US7, 189，826 (描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni, J.，XiandaiMianyixue26 (2006) 265-268 (描述人-人杂交瘤)中。人杂交瘤技术(三元杂交瘤技术)也描述于 Vollmers, H.P.和 Brandlein, S.，Histology and Histopathology20 (2005) 927-937及 Vollmers,H.P.和 Brandlein, S.,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology27 (2005) 185-191 中。
[0300]还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这类可变结构域序列与希望的人恒定区组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
[0301]可以针对具有一种或多种希望的活性的抗体筛选组合文库来分离抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体文库并针对具有希望的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于例如Hoogenboom, H.R.等，Methods inMolecular Biologyl78 (2001) 1-37 中，并进一步描述于例如 McCafferty, J.等，Nature348 (1990) 552-554 ；Clackson, T.等，Nature352 (1991) 624-628 ；Marks, J.D.等，J.Mol.Biol.222(1992) 581-597 ；Marks, J.D.和 Bradbury, A., Methods in MolecularBiology248(2003) 161-175 ；Sidhu, S.S.等，J.Mol.Biol.338(2004)299-310 ；Lee,C.V.等，J.Mol.Biol.340 (2004) 1073-1093 ；Fellouse, F.A.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl (2004) 12467-12472 ;及 Lee，C.V.等，J.1mmunol.Methods284 (2004) 119-132 中。
[0302]在某些噬菌展示方法中，分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆VH和VL基因的库，并在曬菌体文库中随机组合,然后按Winter,G.等,Ann.Rev.1mmunol.12 (1994) 433-455中所述针对结合抗原的噬菌体筛选该文库。噬菌体通常作为单链Fv (scFv)片段或作为Fab片段展示抗体片段。来自免疫的来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按Griffiths，A.D.等，EMBO J.12 (1993) 725-734所述克隆(例如从人)首次用于实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫。最后，还可以按 Hoogenboom，H.R.和 Winter，G.，J.Mol.Biol.227 (1992) 381-388 所述，通过从干细胞克隆未重排V基因区段，并用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并实现体外重排来合成制备首次用于实验的文库。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如 US5, 750，373、US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936 和 US2009/0002360。
[0303]本文将分离自人抗体文库的抗体或抗体片段视为人抗体或人抗体片段。
[0304]在某些实施方案中，该抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性中的一种针对第一抗原，另一种针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与同一抗原的两个不同表位结合。还可以用双特异性抗体来将细胞毒性剂定位至表达该抗原的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
[0305]用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见 Milstein，C.Cuello, A.C.，Nature305 (1983) 537-540 ；W093/08829 ;及 Traunecker，A.等，EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵入臼”改造(见例如US5, 731，168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体:用于制备抗体Fe-异二聚体分子的工程静电引导作用(W02009/089004);交联两种或多种抗体或片段(见例如US4，676，980和Brennan，M.等，Science229 (1985) 81-83);用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(见例如Kostelny, S.A.等，J.1mmunol.148(1992) 1547-1553);使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如 Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 6444-6448)；使用单链 Fv(scFv) 二聚体(见例如 Gruber, Μ.等，J.1mmunol.152 (1994) 5368-5374);按例如Tutt, A.等，J .1mmunol.147 (1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
[0306]本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如 US2006/0025576)。
[0307]该抗体可以是含有与第一抗原以及另一不同抗原结合的抗原结合部位的“双重作用 Fab” 或“DAF” (见例如 US2008/0069820)。
[0308]该抗体或片段还可以是W02009/080251、TO2009/080252、TO2009/080253、W02009/080254, W02010/112193、W02010/115589、W02010/136172, W02010/145792 或W02010/145793中所述的多特异性抗体。
[0309]方法
[0310]在某些实施方案中，用本文提供的方法来改变(即提高或降低)抗体糖基化的程度。
[0311]在抗体包含Fe区时，可以改变附着于Fe区的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fe区的CH2结构域的Asn297(见例如 Wright，A.和 Morrison，S.L.，TIBTECH15 (1997) 26-32)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于GIcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的抗体变体。
[0312]在一个实施方案中，所提供的方法导致产生具有缺乏附着(直接或间接)于Fe区的岩藻糖的糖类结构的抗体。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。相对于通过例如W02008/077546中所述的MALD1-TOF质谱法测量的附着于Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fe区中的约297位(Fe区残基的Kabat EU编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以定位在297位上游或下游约±3氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能(见例如US2003/0157108 ；US2004/0093621)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括:US2003/0157108 ；W02000/61739 ；W02001/29246 ；US2003/0115614 ；US2002/0164328 ；US2004/0093621 ；US2004/0132140 ；US2004/0110704 ；US2004/0110282 ；US2004/0109865 ；W02003/085119 ；W02003/084570 ；W02005/035586 ；W02005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ；Okazaki, A.等，J.Mol.Biol.336 (2004) 1239-1249 ;Yamane_0hnuki, N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的 Lecl3CH0 细胞(Ripka, J.等，Arch.Biochem.Biophys.249 (1986) 533-545 ；US2003/0157108 ;及W02004/056312，尤其是在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87 (2004) 614-622 ；Kanda, Y.等，Biotechnol.Bioeng.94 (2006) 680-688 ；andW02003/085107)。
[0313]在某些实施方案中，所提供的方法可以用来产生具有二等分寡糖的抗体，例如其中附着于抗体Fe区的双触角寡糖被GlcNAc 二等分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如W02003/011878、US6，602，684和US2005/0123546中。还可以产生在附着于Fe区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类变体描述于例如W01997/30087, W01998/58964 和 W01999/22764 中。
[0314]可以用例如US4，816，567中所述的重组方法和组合物产生抗体。核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(或已用以下转化):(I)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0, Sp2/0)。在一个实施方案中，提供制备抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。 [0315]为了重组产生抗体，分离编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。
[0316]适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fe效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达见例如US5, 648，237、US5, 789，199和US5, 840, 523 ;还见Charlton，K.A., In:Methods in Molecular Biology, 248 卷，Lo, Β.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa, NJ (2003)，245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以从可溶级分中的细菌糊分离抗体，并可以进一步纯化。
[0317]除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株(见 Gerngross, T.U.，Nat.Biotech.22 (2004) 1409-1414 ;和 Li,
H.等，Nat.Biotech.24 (2006) 210-215)。
[0318]适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。 [0319]植物细胞培养物也可以用作宿主(见例如US5，959，177、US6, 040, 498、US6, 420, 548、US7, 125，978和US6，417，429 (描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIB0DIES? 技术))。
[0320]脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用驯化为悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CVl细胞系(C0S-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham, F.L.等，J.Gen Virol.36 (1977) 59-74中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK);小鼠支持细胞(描述于例如Mather，J.P.，Biol.R印rod.23(1980)243-252中的TM4细胞)；猴肾细胞(CVl);非洲绿猴肾细胞(VER0-76)；人宫颈癌细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK) ;buffalo大鼠肝细胞(BRL3A);人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2);小鼠乳腺肿瘤(MMT060562);描述于例如Mather，J.P.等，AnnalsN.Y.Acad.Sc1.383 (1982) 44-68中的TRI细胞；MRC5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR阴性(DHFR-)CHO细胞(Urlaub，G.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77 (1980) 4216-4220);及骨髓瘤细胞系，如 YO,NSO 和 Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki，P.和Wu，A.M.,Methods inMolecular Biology, 248 卷，Lo, Β.K.C.(编辑)，Humana Press, Totowa, NJ (2004)，255-268页。
[0321]I1.本发明的具体方面
[0322]已发现，取决于载体组织，表述载体的性能(I)因载体设计而不同，及(2)同一载体在瞬时转染和稳定转染之间不同。
[0323]已发现，用于瞬时转染和稳定转染的最佳载体组织可以明显不同。不受限于此理论，几点可以促成这些差异:1)宿主基因组中整合的载体拷贝之间的转录干扰现象，其取决于各载体设计并对各载体设计特异，且不存在于瞬时系统中；2)选择方法和选择严格性的影响，其取决于各载体组织，且在稳定系统中而不是在瞬时系统中发挥重要作用；及3)最佳的LC与HC多肽的比值，其对单克隆抗体的瞬时表达和稳定表达而言明显不同，且在瞬时转染中低于稳定转染中。
[0324]已发现，对于瞬时转染，LC和HC的双向表达达到了所有测试的载体组织中最高的产物效价。不受限于理论，假定此载体设计满足最佳的IgG表达的两条标准A) LC和HC多肽的高表达水平和B)最佳的“瞬时”LC: HC多肽比，及C)LC和HC的双向表达也可以最小化转录干扰机制，如RNA聚合酶的通读作用。
[0325]但是，已发现，对于稳定转染，LC和HC的双向表达比成行组织LC-HC-SM更差。不受限于此理论:1)LC、HC和SM的表达盒的趋同组织可减少整合的载体拷贝之间的转录干扰现象；2)LC在HC的上游明显便于对稳定转染而言最佳(更佳)的LC: HC多肽比；及3)选择标记的下游放置明显提高了选择的严格性。此外，发现产生IgG的细胞的百分比和细胞系的生产力提高。对于在抗体表达盒上游双向包含选择标记的载体，虽然选择的严格性明显提闻，但提闻选择压力的浓度未提闻稳定库或克隆的生广力(数据未显不)。
[0326]已发现，用hEFl α启动子和bGH polyA信号同时交换hCMV启动子和SV40poly信号在抗体表达盒单向组织时显著提高瞬时产物效价，但在双向放置LC和HC表达盒时降低产物效价。
[0327]已发现，hEFla启动子产生大量产生良好的克隆及非常少量的非产生或低产生克隆。但是，hEFl a启动子的最好的单克隆在补料分批分析中的产物效价低于hCMV启动子的克隆。但hCMV启动子的排序靠前的克隆的总数相对低，它们的鉴定通常需要高筛选努力。
[0328]已发现，在瞬时转染中以及稳定转染中，对于含有hCMV启动子的载体，在与SV40或bGH polyA信号组合时，hGT的使用显著提高生产力。但是，对于含有hEfla启动子的载体，在与bGH polyA信号组合时，它对产物效价的影响可忽略。因此，已发现，hGT对载体性能的影响依赖于所使用的启动子。
[0329]用于充分控制的大规模发酵中的最终评价的适当克隆的选择通常基于摇瓶中的分批或补料分批分析。已发现，一些表达载体或元件的性能和排序在分批和补料分批分析之间存在差异。在分批分析中而不是在补料分批分析中，对于含有hCMV启动子的载体，用bGH polyA信号取 代SV40polyA提高了生产力。在分批分析中而不是在补料分批分析中，hGT对克隆的产物效价无显著影响。选择标记的放置或启动子(hEfla或hCMV启动子)不同的载体之间的差异在分批分析中中度显著，但在补料分批分析中强烈显现。表达水平和比产生速率在补料分批模式中比在分批模式中高。
[0330]已发现大多数克隆的补料分批分析和2L发酵的性能的良好相关，不仅在绝对产物效价的水平上，还在不同载体和克隆之间的排序上。
[0331]已发现，与在抗体表达盒上游双向放置选择标记相比，选择标记的下游放置轻微减少了生产力丢失。不受限于理论，这可能是由于提高的选择严格性，因此更高的mRNA水平或改善的LC: HCmRNA或多肽比。两种因素都可导致对生产力变化的更高耐受性。
[0332]与SV40polyA信号相比，bGH polyA信号显著降低克隆中抗体表达的稳定性。但是，在bGH polyA信号下游插入hGT明显提高了表达的稳定性。hGT对稳定性的积极作用在缺乏选择压力的情况下最明显。
[0333]稳定库的稳定性分析揭示，在用hCMV产生时，细胞快速丧失生产力，但在用hEfla启动子产生时则不然。令人惊奇地，对于含有hEfla启动子的载体，hGT降低克隆的生产力，但轻微提高它们的稳定性。
[0334]只有少部分克隆在选择过程之后显著产生抗体。但是，载体组织的修饰和/或元件的修饰显著提高产生IgG的克隆与不产生IgG的克隆的比值。不同的载体组织及因此决定选择严格性的选择标记的不同表达水平也明显影响产生IgG的细胞的百分比。基于筛选过程的数据的统计模拟证明，一些表达载体还具有显著减少筛选过程中的工作量的潜能。这一事实对生物制药公司的成本具有主要影响。
[0335]转录过程的改善
[0336]启动子的转录起始
[0337]启动子决定基因的转录水平，因此对细胞系的生产力和稳定性具有强烈影响:
[0338]-启动子介导的转录起始决定可以翻译为重组蛋白质的mRNA的量；
[0339]-尽管稳定整合，但克隆的长期生产力可以快速降低(由于遗传基因沉默(例如通过启动子甲基化));
[0340]-启动子活性依赖于细胞类型。
[0341]描述了在多种细胞系中显示为强启动子的启动子。已知内含子可以包含增强子样元件。通常，第一内含子(内含子A)包含大多数调节元件。此内含子A是全长天然启动子序列/组织内第一个出现的内含子。
[0342]PolyA信号介导的mRNA的聚腺苷酸化
[0343]mRNA的聚腺苷酸化具有多种功能。它强烈影响mRNA的细胞核输出、翻译起始和mRNA稳定性。因此，聚腺苷酸化过程的效率对基因的表达水平和因此对生产力具有强烈影响。
[0344]几篇出版物 已显示，聚腺苷酸化信号可以对蛋白质表达具有强烈影响。据报道，在取代SV40polyA信号时，由牛生长激素衍生的polyA信号(bGHpolyA信号)可以产生增强的蛋白质表达。
[0345]已发现，牛生长激素polyA信号可以在抗体链的重组产生中具有改善的特性。
[0346]转录终止子支持的转录终止
[0347]包含在表达载体中的元件可以相互强烈干扰(转录干扰)。这是由于转录过程中的竞争。例如，由于空间限制和转录机器的资源的可用性降低，亚适启动子接近转录因子和/或RNA聚合酶。干扰还可以发生在不同的紧密相邻的表达盒之间。例如，可以出现由无效的(inefficient)转录终止引起的RNA聚合酶从第一表达单位通过第二表达单位的通读。
[0348]据报道，无效的转录终止可以导致转录干扰，其可以导致基因的无效表达。人胃泌素基因转录终止子(hGT)的使用可以改善转录终止，从而促成重组蛋白质的增强的表达。此作用取决于与hGT组合的启动子。已知其他有效的转录终止子。
[0349]已发现，通过在抗体表达盒的早期SV40polyA信号之后插入人胃泌素转录终止子的序列，可以达到增强转录终止和防止例如抗体轻链和抗体重链的表达盒之间的转录干扰。
[0350]结果
[0351]本文报道用于增强一个或多个编码核酸，例如编码抗体链的结构基因的表达的表达载体。
[0352]已发现，在正确选择和排列转录所需的遗传元件时，表达该结构基因的重组细胞的生产力改善。
[0353]-polyA信号序列和转录终止子序列
[0354]在载体p5068中，表达盒由SV40polyA信号终止。
[0355]在载体px6001中，表达盒还包含放置在SV40PolyA信号下游的人胃泌素转录终止子(hGT)。[0356]在载体px6007中，表达盒由bGH polyA信号和hGT转录终止子终止。
[0357]在载体px6008，表达盒由不含附加的转录终止子的bGH polyA信号终止。
[0358]将这些载体瞬时转染入CHO-Kl细胞，转染6天后，收集细胞培养物上清，并通过ELISA测定培养上清中所产生的抗体的量。
[0359]与对照载体p5068相比，bGH polyA信号取代SV40polyA信号和SV40polyA信号后面加入/插入人胃泌素终止子(hGT)导致瞬时表达的生产力提高约45%至30%。与对照载体P5068相比，bGH polyA信号和人胃泌素终止子(hGT)的组合导致最大的效价提高(+58% )。
[0360]
【权利要求】
1.用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤: a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞: -按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表 达盒； 从而获得大量重组哺乳动物细胞； b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
3.权利要求1至2任一项的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
4.权利要求1至3任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
5.权利要求1至3任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
6.权利要求1至5任一项的方法,其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
7.权利要求1至4和6任一项的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。
8.权利要求1至4和6至7任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
9.权利要求1至8任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
10.权利要求1至4和6至8任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。
11.权利要求1至3和5至8任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
12.用于产生抗体的方法，其包括以下步骤: a)培养包含以下的哺乳动物细胞: -按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；和 b)从所述细胞或培养基回收所述抗体。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
14.权利要求12至13任一项的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
15.权利要求12至14任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒单向排列用于稳定产生抗体。
16.权利要求12至14任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于瞬时产生抗体。
17.权利要求12至16任一项的方法,其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
18.权利要求12至15和17任一项的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。
19.权利要求12至15和17至18任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
20.权利要求12至19任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
21.权利要求12至15和17至20任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细胞。
22.权利要求12至14和16至20任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
23.表达载体，其包含: -按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒。
24.权利要求23的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
25.权利要求23至24任一项的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
26.权利要求23至25任一项的表达载体,其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
27.权利要求23至25任一项的表达载体，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
28.权利要求23至27任一项的表达载体,其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
29.权利要求23至26和28任一项的表达载体，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。
30.权利要求23至26和28至29任一项的表达载体，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
31.用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤: a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞: -按5’至3’方向包含hEFl α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒; -按5’至3’方向包含hEFl α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒；和从而获得大量重组哺乳动物细胞； b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。
32.权利要求31的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
33.权利要求31至32任一项的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
34.权利要求31至33任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
35.权利要求31至33任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
36.权利要求31至35任一项的方法,其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
37.权利要求31至34和36任一项的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。
38.权利要求31至34和36至37任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
39.权利要求31至 38任一项的方法，其特征在于所述人延伸因子Ia启动子含有内含子A0
40.权利要求31至39任一项的方法，其特征在于所述表达载体不含任何转录终止子序列。
41.权利要求40的方法，其特征在于所述终止子序列是hGT序列。
42.权利要求31至41任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
43.权利要求42的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。
44.权利要求42的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
45.用于产生抗体的方法，其包括以下步骤: a)培养包含以下的哺乳动物细胞: -按5’至3’方向包含hEFl α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒; -按5’至3’方向包含hEFl α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒；和 b)从所述细胞或培养基回收所述抗体。
46.权利要求45的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
47.权利要求45至46任一项的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
48.权利要求45至47任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
49.权利要求45至47任一项的方法，其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
50.权利要求45至49任一项的方法,其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
51.权利要求45至48和50任一项的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。
52.权利要求45至48和50至51任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
53.权利要求45至52任一项的方法，其特征在于所述人延伸因子Ia启动子含有内含子A0
54.权利要求45至53任一项的方法，其特征在于所述表达载体不含任何转录终止子序列。
55.权利要求54的方法，其特征在于所述终止子序列是hGT序列。
56.权利要求45至55任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
57.权利要求56的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细 胞。
58.权利要求56的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
59.表达载体，其包含: -按5’至3’方向包含hEFl α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒; -按5’至3’方向包含hEFl α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒。
60.权利要求59的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
61.权利要求59至60任一项的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
62.权利要求59至61任一项的表达载体,其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
63.权利要求59至61任一项的表达载体,其特征在于所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
64.权利要求59至64任一项的表达载体,其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
65.权利要求59至62和64任一项的表达载体，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。
66.权利要求59至62和64至65任一项的表达载体，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
67.权利要求59至66任一项的表达载体，其特征在于所述人延伸因子Ia启动子含有内含子A。
68.权利要求59至67任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体不含任何转录终止子序列。
69.权利要求68的表达载体，其特征在于所述终止子序列是hGT序列。
70.包含以下的表达载体用于在哺乳动物细胞中稳定重组产生抗体的用途: -按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一 polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二 polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒；和 -按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒； 由此所述三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。
71.权利要求70的用途，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
72.权利要求70至71任一项的用途，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
73.权利要求7 0至72任一项的用途，其特征在于所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二 PolyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述转录终止子序列存在且是hGT终止子序列。
74.权利要求70至72任一项的用途，其特征在于所述第一和第二启动子是hEFlα启动子，所述第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列,所述表达盒不含转录终止子序列。
75.权利要求70至74任一项的用途，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
76.权利要求70至75任一项的用途，其特征在于所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
77.表达载体，其包含: -按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一 polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二 polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒；和 -按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒； 由此所述三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。
78.权利要求77的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
79.权利要求77至78任一项的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
80.权利要求77至79任一项的表达载体，其特征在于所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二 PolyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述转录终止子序列存在且是hGT终止子序列。
81.权利要求77至79任一项的表达载体，其特征在于所述第一和第二启动子是hEFl α启动子，所述第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述表达盒不含转录终止子序列。
82.包含以下的表达载体用于在哺乳动物细胞中瞬时重组产生抗体的用途: -按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一 polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二 polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒；和 -按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒； 由此所述表达盒双向组织，由此所述第一表达盒和所述第二表达盒按相反方向排列。
83.权利要求82的用途，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
84.权利要求82至83任一项的用途，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
85.权利要求82至8 4任一项的用途，其特征在于所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二 PolyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述转录终止子序列存在且是hGT终止子序列。
86.权利要求82至84任一项的用途，其特征在于所述第一和第二启动子是hEFlα启动子，所述第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列,所述表达盒不含转录终止子序列。
87.权利要求82至86任一项的用途，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞和SP2/0细胞。
88.权利要求82至87任一项的用途，其特征在于所述哺乳动物细胞是HEK细胞。
89.表达载体，其包含: -按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一 polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二 polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒；和 -按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒； 由此所述表达盒双向组织，由此所述第一表达盒和所述第二表达盒按相反方向排列。
90.权利要求89的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
91.权利要求89至90任一项的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
92.权利要求89至91任一项的表达载体，其特征在于所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二 PolyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述转录终止子序列存在且是hGT终止子序列。
93.权利要求89至91任一项的表达载体，其特征在于所述第一和第二启动子是hEFl α启动子，所述第一和第二 polyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述表达盒不含转录终止子序列。
94.表达质粒，其按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和polyA信号序列，由此所述IRES元件是EMCV-1RES元件。
95.按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和PolyA信号序列的表达盒的用途，用于选择产生抗体的细胞，由此所述IRES元件是EMCV-1RES元件。
96.用于选择表达抗体的真核细胞的方法，其包括以下步骤: -培养包含i)权利要求94的表达质粒和ii)编码不由权利要求94的表达质粒编码的另一抗体链的核酸的真核细胞； -选择表达所述可检测多肽的细胞。
97.表达质粒，其按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸序列和polyA信号序列，由此所述IRES元件是EV71-1RES元件。
98.按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸序列和PolyA信号序列的表达质粒的用途，用于表达抗体，由此所述IRES元件是EV71-1RES 元件。
99.用于选择表达抗体的真核细胞的方法，其包括以下步骤: -培养包含i)权利要求97的表达质粒和ii)编码不由权利要求97的表达质粒编码的另一抗体链的核酸的真核细胞； -选择表达所述可检测多肽的细胞。
100.权利要求1至99任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述表达载体包含: -按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒； -按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒； -按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第四表达盒； 或 -按5’至3’方向包含启动子、编码抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒； -按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒；和 -按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒；由此所述抗体轻链是两条抗体重链的共同轻链。
101.权利要求1至100任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述表达载体编码双特异性抗体。
102.权利要求100至101任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述双特异性抗体具有特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性或结合部位，且所述双特异性抗体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异性或结合部位。
103.权利要求100至102任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述表达载体包含: -抗体轻链表达盒； -第一抗体重链表达盒； -第二抗体重链表达盒；和 -选择标记表达盒。
104.权利要求100至103任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述表达载体包含: -第一抗体轻链表 达盒； -第二抗体轻链表达盒； -第一抗体重链表达盒； -第二抗体重链表达盒；和 -选择标记表达盒。
105.权利要求100至104任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含白突变的抗体重链。
106.权利要求100至105任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含杵突变的抗体重链。
107.权利要求100至106任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链CHl结构域的抗体轻链变体，和/或所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结构域的抗体轻链。
108.权利要求100至107任一项的表达质粒或用途或方法，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CHl结构域作为第一恒定结构域的抗体重链。
【文档编号】C07K16/00GK104011075SQ201280062793
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月22日
【发明者】P·M·许尔斯曼, H·克内根 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司