基因的等温滚环复制与限制性内切酶检测方法及其试剂盒的制作方法

专利名称：：基因的等温滚环复制与限制性内切酶检测方法及其试剂盒的制作方法所属领域本发明是一种体外扩增基因片段和检测的方法，命名为RCA-RED。
背景技术：
：DNA的细胞外复制是现代分子生物学的最主要成就之一，也是现代生物学研究和应用中使用得最为普遍的手段。二十世纪五十年代，美国科学家孔伯格(ArthurKornberg)利用大肠杆菌的DNA聚合酶I在试管内复制DNA成功。八十年代后期，美国科学家穆理斯(KaryB.Mullis)发明了聚合酶链式反应(PCR)方法，该方法不仅能够复制，而且能够大量扩增目的基因。PCR实际上是以线性DNA为模板进行复制，主要反应因子有DNA模板，扩增片段两端的寡聚脱氧核苷酸引物(oligodeoxynucleotideprimers)，四种脱氧核苷酸(dNTP)，耐热DNA聚合酶，及适宜的离子和酸度条件。PCR反应的物理条件包括高温(通常为95℃，使DNA双链分离变性)，低温(通常为45-60℃，使引物与同源序列结合)和中温，即反应温度(通常为65-72℃，由DNA聚合酶合成DNA)三个阶段，每三个阶段构成一个循环，一般一个PCR反应需要25-40个循环。在理想情况下，PCR反应每经过一个循环，目的基因的数量就被扩增一倍，这样，在经过30个循环之后，一个目的基因分子就可能被扩增到十亿个以上(230)。在这些扩增的目的基因中，绝大多数DNA分子的长度由两个引物的位置所决定，也就是说，它们的长度都是一致的，因此可以通过凝胶电泳和DNA染色方法检测扩增片段的存在。PCR方法具有灵敏度高，简单、快速等优点，很快成为体外复制与扩增DNA的常规方法。但是，PCR也存在一些缺点，如它需要价格昂贵的DNA扩增仪，容易产生假阳性结果，不能够定量，等等。到了九十年代，有人发明了DNA的滚环复制扩增方法(RCA)。RCA与PCR的主要区别有四个第一，它的复制模板是环状的，复制方式是滚环式的，扩增出的DNA分子虽是线性的，但是其长度不等，一般是环状模板的整倍数。第二，用于RCA的DNA聚合酶都能够使与模板互补的DNA链脱落，同时合成新链。这个特点决定了RCA不需要PCR的变性、复性等变温条件，整个反应可以在恒温下进行，从而不需要DNA扩增仪。第三，由于在RCA反应中，复制模板直接来源于化学合成的DNA引物，它与目的基因的关系仅是形成互补结构，以便能够连接成环，所以从理论上讲，RCA能够直接检测DNA和RNA分子，而PCR只能够直接检测DNA分子。第四，RCA的扩增效率极高。有数据表明，PCR方法每小时可以使DNA扩增109，而RCA方法每小时可以使DNA扩增1012，相差达到千倍。不过，RCA扩增的DNA片段长度不等，常规的电泳方法不能够用来检测扩增的DNA，而是需要通过复杂的荧光和同位素标记技术来检测。这就极大地限制了它的应用。技术内容本发明的目的是，为克服现有技术存在的问题，提供一种基因的等温滚环复制与限制性内切酶检测方法，命名为RCA-RED(RollingCircleAmplification-RestrictionEnzymeDigestion)。通过在RCA的引物中设计限制性内切酶的识别位点，在RCA反应之后，用限制性内切酶将扩增的DNA切割成长度相等的片段，然后应用电泳方法来检测扩增产物的存在。该方法的基本步骤包括(1)、将DNA探针与待检样品的DNA或RNA混合，使DNA探针与目的基因杂交。该引物探针上有特定的限制性内切酶切割位点；(2)、加入DNA连接酶，使DNA探针连接成环状；(3)、加入DNA聚合酶和复制引物，今其以滚环方式复制并合成双链DNA；(4)、加入限制性内切酶，将复制的DNA切割成特定长度的片段；(5)、通过电泳，如平板琼脂糖凝胶电泳，垂直聚丙烯酰胺电泳，毛细管电泳等，检查特定长度的DNA片段。用RCA方法检测目的基因，其关键在于引物的设计。与PCR只需要一对引物不同，一个RCA反应一般至少需要以下数种引物1、环状复制模板大探针(简称C-探针)2、充寡聚脱氧核苷酸探针(简称G-探针)3、滚环复制引物(简称P1)4、互补链合成引物(简称P2)该方法可以在等温情况下使待检基因成指数扩增，用限制性内切酶切割成特定长度之后，其扩增的DNA可以通过电泳方法检测。无需价格昂贵的DNA扩增仪，可定量，可用于包括动物、植物和微生物的基因检测；以及可用于包括动物、植物和微生物的基因扩增。图1是C-探针的基本结构示意图；C-探针是RCA-RED的主要成分，由左、右靶区和P1互补区、P2区组成。C-探针还可以有其它区域。限制性内切酶位点一般位于C-探针内。图2是RCA复制模板的形成示意图；C-探针的靶区和G-探针在与目的基因的互补序列杂交后，经DNA连接酶连接成一个环状DNA。这就是RCA中的复制模板。图3是RCA-RED原理流程图。图4为应用RCA-RED方法检测噬菌体λDNA的电泳照片C-探针是RCA反应的主要探针，是长度在50到500核苷酸之间的单链DNA，5’端有磷酸根基团，3’端为羟基。5’端磷酸根基团的作用是它能够与3’端羟基在连接酶的作用下连接成共价键。C-探针的最佳长度在100-200个核苷酸左右。C-探针两端各10-30个左右核苷酸为靶标区，与目的基因的一条链互补，形成一个有缺口或无缺口的单链DNA环状结构。这个缺口可以是1-50个核苷酸，一般在5-10个核苷酸。缺口的长度也就是下面G-探针的长度。如缺口长度为0，则不需要G-探针。在靶标区之间，是所谓的间隔区，根据不同需要可以有多个区域，但有两个区域是必须的，一个是P1互补区，一个是P2区，其序列一个与引物P1互补，另一个与引物P2相同。详见图1。G-探针是一个完全与目的基因互补的寡聚脱氧核苷酸链，5’端有磷酸根基团，3’端为羟基。它的长度在数个到几十个核苷酸之间，一般为5-10个核苷酸左右。G-探针的主要作用是填充C-探针的左右靶标区与目的基因互补杂交之后形成的缺口。在DNA连接酶的作用下，C-探针与G-探针组成了一个由共价键连接起来的单链环状DNA。这就是RCA复制的模板。C-探针的靶标区和G-探针决定RCA-RED反应的特异性，也就是说，只有在它们与目的基因序列杂交之后，反应才可能继续进行下去。详见图2。P1是一个单链寡聚脱氧核苷酸，长度在10-50核苷酸之间，一般在20个核苷酸左右。它与C-探针上的P1互补区通过氢键互补，成为RCA反应中DNA合成起始引物。P2是一个单链寡聚脱氧核苷酸，长度在10-50核苷酸之间，一般在20个核苷酸左右。它与C-探针上的P2区序列一致，其作用是与新合成的DNA链上的P2互补区杂交，成为第二条DNA链合成的起始引物。本发明的最主要之处就是在复制模板(C-探针与G-探针连接而成的DNA环)内设计限制性内切酶位点。在RCA反应结束后，通过该内切酶把扩增出的多聚模板DNA切割成特定长度的片段。一般说来，限制性内切酶切割位点可以在C-探针内，也可以在G-探针内，但最好是在C-探针之内。限制性内切酶位点可以在C-探针的任何地方，如靶标区，间隔区等。复制模板内可以有多个不同的限制性内切酶位点，但以2-3个最为适宜。限制性内切酶可以是识别四个硷基序列的酶，如AluI，HaeIII，Sau3AI，TaqI，也可以是识别六个硷基序列的酶，如BamHI，EcoRI，HindIII，SalI，也可以是其他任何限制性内切酶。一般来说，应该首先选用来自耐热细菌和对反应条件要求不苛刻的内切酶。设计限制性内切酶位点的原则是就某一个限制性内切酶来说，整个复制模板内该酶的切割位点不应超过5个，一般不超过3个，最好只有1个。RCA-RED的探针和引物中只有C-探针的靶标区和G-探针是特异序列，其它序列属于武断随机序列，此处称之为核心序列。为了方便引物设计，可以先构建好一系列核心序列，具有不同长度(50，80，100，130，160，200个硷基)和不同限制性内切酶位点，然后补充目的基因的靶标区序列。由于存在长度和酶切位点的差异，从理论上讲，一个RCA-RED反应可以检测数个不同基因或一个基因的序列多态性。RCA-RED的一般步骤如下(详见图3)1、在试管内加入待测样品的DNA和C-探针与G-探针，在适宜的条件下令其杂交；2、加入DNA连接酶，使C-探针与G-探针连接成共价环状DNA；3、加入DNA聚合酶和P1，P2引物，开始合成单链及双链DNA；4、加入限制性内切酶，将合成的DNA切割成单位长度；5、将切割后的DNA在凝胶中电泳，然后通过染色观察特定长度的DNA片段。实例1应用RCA-RED方法检测噬菌体λDNA噬菌体λ是一种细菌病毒，其基因组为双链DNA，全长约4万8千硷基(48kb)。在13861至13920硷基之间，其序列如下(GenBankNo.215104)5’GCGGTGAGTGCCTCCTTTGTACTGTCCACGCCGACGGAAACGGATGGCGCTGTTTTTCCG3’根据上面的序列，设计了噬菌体λ的RCA-RED引物C-探针5′p-CAGTACAAAGGAGGCACTCTAGGGTCTGTGTACAAGCTTTCGAACCCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCCAGCGCCATCCGTTTCCG-OH3′其中，5’端为一个磷酸根基团，用“P”表示，3’端是个羟基，用“OH”表示。5’端的19个硷基(CAGTACAAAGGAGGCACTC)是左靶标区，与λ基因组序列13866-13884互补；3’端的18个硷基(CAGCGCCATCCGTTTCCG)是右靶标区，与λ基因组序列13895-13913互补；两个靶标区之间的53个硷基为间隔区，内含P1互补区(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)，其中有一个HindIII酶切位点AAGCTT，和P2区(CTCGACTTGGAACCTGAAGG)，其中有一个TaqI酶切位点TCGA。在上述四个区域之间，该C-探针上还有3个短片段，用作间隔，其中之一为EcoRI酶切位点GAATTC。G-探针5’p-TCGGCGTGGA-OH3’，与λ基因组序列13885-13894(TCCACGCCGA)互补；P15’HO-CGAAAGCTTGTACACAGAC-OH3’，与C-探针上的P1互补区(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)互补；P25’HO-CTCGACTTGGAACCTGAAG-OH3’与P2区序列相同。检测步骤1、将C-探针和G-探针(各为50-100nM)与噬菌体λ的DNA(10-100ng)在T4DNA连接酶缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP，25μg/mlBSA)中混合，反应体积为50μl。在95℃加热3分钟，降至室温，然后加5个卫斯单位(WeissUnits)的T4DNA连接酶，37℃30分钟；2、从上述反应液中取出25μl反应物，与等体积的下列混合液混合50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mMDTT，400μMdNTP，0.2μMP1引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃15分钟后，再加0.2μMP2引物，50ngφ29DNA聚合酶，30℃60分钟；3、加入等量的11酚/氯仿混合液，混匀，离心5分钟，取上层水相，加十分之一体积的3M醋酸钠(pH6.0)，2.5倍体积的95％乙醇，14000rpm离心15分钟，将沉淀溶解在10μl纯水或TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5，0.1mMEDTA)中；4、将上述DNA用EcoRI或HindIII或TaqI在15μl反应体积中切割，其反应条件分别是EcoRI100mMTris-HCl，pH7.5，50mMNaCl，10mMMgCl2，0.025％TritonX-100，37℃60分钟；HindIII10mMTris-HCl，pH8.4，50mMNaCl，10mMMgCl2，1mMDTT，37℃60分钟；TaqI10mMTris-HCl，pH8.4，100mMNaCl，10mMMgCl2，65℃60分钟；5、加入3μl6X电泳样品缓冲液(30％甘油，0.25％溴酚蓝染料)，在3％的琼脂糖或5％的聚丙烯酰胺中电泳，然后用溴化乙锭或硝酸银染色，检查100bpDNA带。说明第二步中的DNA聚合酶可以是φ29DNA聚合酶，也可以是其他具有能够使与模板互补的DNA链与模板脱离，并且缺少5’到3’外切酶活性的DNA聚合酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)，噬热菌VentRTMDNA聚合酶(NewEnglandBiolab)，噬菌体T5DNA聚合酶，噬菌体M2DNA聚合酶，等等。第三步(DNA纯化和浓缩)可以省略，也可以用市场上销售的DNA纯化试剂盒来替代。如果省略第三步，可以把扩增的DNA直接用限制性内切酶在相应的缓冲液中切割。阴性对照可以使用没有噬菌体污染的大肠杆菌DNA。图4为应用RCA-RED方法检测噬菌体λDNA的电泳照片按照文中的步骤做完RCA反应之后，将DNA用酒精沉淀，用限制性内切酶切割，然后在琼脂糖凝胶中电泳。DNA用溴化乙锭染色后，在紫外光下拍照。1RCA反应中没有λDNA的阴性对照2-5RCA反应中加有λDNA，然后没有加限制性内切酶(泳道2)，和分别加EcoRI(泳道3)，HindIII(泳道4)，TaqI(泳道5)。6DNA分子量标准，从下至上为50，100，200，300，400，600，1000，1500，2000bp.实例2应用RCA-RED方法检测马传染性贫血病毒马传染性贫血病毒(EquineInfectiousAnemiaVirus，EIAV)属逆转录病毒科慢病毒属(lentivirus)，基因组是单链RNA，全长约8kb。在侵染寄主之后，EIAV的基因组被转录成DNA，并且整合到寄主的基因组之中，以“前病毒(proviral)DNA”的形式存在。EIAV与同属于慢病毒属的HIV(俗称爱滋病毒)在基因组结构、基因编码蛋白及基因调控方式等方面有许多相似之处，因此该病毒成为研究慢病毒感染和致病机制及病毒酶功能的重要模型。检测EIAV感染以血清学方法为主，通常是检查马的血液中是否含有EIAV的抗体。八十年代初，中国科学家沈荣显等人在世界上首次发明马传染性贫血病毒疫苗，并且在全国推广。虽然该疫苗有效地控制了EIAV病的蔓延，但由于注射疫苗使所有的马匹都产生了EIAV的抗体，因此常规的血清学检测方法不再能够从EIAV疫苗接种的马匹中区分EIAV的携带者。发明一种新的，快速、准确的EIAV检测方法就成了当务之急。EIAV基因组编码膜蛋白gag基因的序列相对比较保守，部分序列如下(GenBankNo.AF033820，901-1000)5′TCATGATAGATGGGGCTGGAAACAGAAATTTTAGACCTCTAACACCTAGAGGATATACTACTTGGGTGAATACCATACAGACAAATGGTCTATTAAATGA3′根据上面的序列，设计了RCA-RED的下列引物C-探针5′p-CTGTTTCCAGCCCCATCTATCTAGGGTCTGTGTACAAGCTTTCGAACCCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCCCTCTAGGTGTTAGAGGTCT-OH3′其中，5’端的21个硷基(CTGTTTCCAGCCCCATCTATC)是左靶标区，与EIAV基因组序列905-925互补；3’端的20个硷基(CCTCTAGGTGTTAGAGGTCT)是右靶标区，与EIAV基因组序列933-952互补；两个靶标区之间的53个硷基为间隔区，内含P1互补区(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)，其中有一个HINDIII酶切位点AAGCTT，和P2区(CTCGACTTGGAACCTGAAGG)，其中有一个TAQI酶切位点TCGA。在上述四个区域之间，该C-探针上还有3个短片段，用作间隔，其中之一为EcoRI酶切位点GAATTC。G-探针5’p-AAAATTT-OH3’，与EIAV基因组序列926-932(AAATTTT)互补；P15’HO-CGAAAGCTTGTACACAGAC-OH3’，与C-探针上的P1互补区(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)互补；P25’HO-CTCGACTTGGAACCTGAAG-OH3’与P2区序列相同。检测步骤1、用DNA提取试剂盒(Promega，Qiagen等厂家产品)从马的血液中提取DNA，用其中约100ng与C-探针和G-探针(各为50-100nM)在T4DNA连接酶缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP，25μg/mlBSA)中混合，反应体积为50μl。在95℃加热3分钟，然后加5个卫斯单位(WeissUnits)的T4DNA连接酶，37℃30分钟；2、从上述反应中取出25μl，与等体积的下列混合液混合50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mMDTT，400μMdNTP，0.2μMP1引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃15分钟后，再加0.2μMP2引物，50ngφ29DNA聚合酶，30℃60分钟；3、加入等量的1∶1酚/氯仿混合液，混匀，离心5分钟，取上层水相，加十分之一体积的3M醋酸钠(pH6.0)，2.5倍体积的95％乙醇，14000rpm离心15分钟，将沉淀溶解在10μl纯水或TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5，0.1mMEDTA)中；4、将上述DNA用EcoRI或HindIII或TaqI在15μl反应体积中切割，其反应条件分别是EcoRI100mMTris-HCl，pH7.5，50mMNaCl，10mMMgCl2，0.025％TritonX-100，37℃60分钟；HindIII10mMTris-HCl，pH8.4，50mMNaCl，10mMMgCl2，1mMDTT，37℃60分钟；TaqI10mMTris-HCl，pH8.4，100mMNaCl，10mMMgCl2，65℃60分钟；5、加入3μl6X电泳样品缓冲液(30％甘油，0.25％溴酚蓝染料)，在3％的琼脂糖或5％的聚丙烯酰胺中电泳，然后用溴化乙锭或硝酸银染色，检查100bpDNA带。说明本方法也可以用来直接检查EIAV的mRNA先从马的血液中纯化总RNA，然后与探针杂交。第二步中的DNA聚合酶可以是φ29DNA聚合酶，也可以是其他具有能够使与模板互补的DNA链与模板脱离，并且缺少5’到3’外切酶活性的DNA聚合酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)，噬热菌VentRTMDNA聚合酶(NewEnglandBiolab)，噬菌体T5DNA聚合酶，噬菌体M2DNA聚合酶，等等。第三步(DNA纯化和浓缩)可以省略，也可以用市场上销售的DNA纯化试剂盒来替代。如果省略第三步，可以把扩增的DNA直接用限制性内切酶在相应的缓冲液中切割。阴性对照可以使用来自健康马匹的血液样品，或来自无EIAV污染的马细胞培养样品。实例3应用RCA-RED方法检测大肠杆菌中的毒素基因大肠杆菌(Escherichiacoli)是食物和饮料中主要污染微生物，导致人畜腹泄，严重者能够引起死亡。目前国际上倾向于将致泻性大肠杆菌菌分为5类，包括肠产毒性大肠埃希氏菌(Entero-toxigenicE.coli，ETEC)、肠致病性大肠埃希氏菌(Entero-pathogenicE.coli，EPEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(Entero-InvasiveE.coli，EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(Entero-HemorrhagicE.coli，EHEC)和肠集聚性粘附大肠埃希氏菌(Entero-AggregativeE.coli，EAggEC)。不同类型的病菌差异主要是因为它们携带的毒素基因，如热敏性毒素(heat-labiletoxins，LTI，LTIIa，LTIIb)、热稳性毒素(heat-stabletoxins，STI，STII)、维罗毒素(verotoxin，VT1，VT2，VT2e)、志贺氏菌样毒素(shiga-liketoxin，SLTI，SLTII)等。目前，检查大肠杆菌的方法主要有细菌培养、血清学和生物化学方法。细菌培养需要时间较长，并且很难从培养物的形态上鉴定致病类型。血清学方法需要特异的抗体，生物化学方法比较繁琐复杂。研究出一种能够快速、准确地从食物和饮水中检测、鉴定出这些毒素基因的方法，具有重大的社会和经济意义。RCA-RED方法会在这方面具有巨大潜力。大肠杆菌基因组中，普遍存在一种叫做uspA(universalstressprotein)的基因，一般可以用来作为鉴定大肠杆菌的阳性参照。根据大肠杆菌的LTI和STI毒素基因以及uspA基因的核酸序列，设计出如下C-探针和G-探针uspA基因靶标区序列(GenBankNo.AF346731，369-420)5′GGCTCGCCCATACAATGCGAAAGTTTCTCTGATCCACGTAGATGTAAACTAC3′C-探针5′p-CGCATTGTATGGGCGAGCCTAGTGACTTACGGTCTGTGTACAAGCTTTCGAAGGATCCCTCGACTTGGAACCTGAAGGATAGAATTCGTAGTTTACATCTACGTGGATCAGA-OH3′其中各区部分用空格分开，顺序分别为左靶标区，间隔，P1互补区(含HindIII位点)，间隔(含BamHI位点)，P2区(含TaqI位点)，间隔(含EcoRI位点)，右靶标区。G-探针P-GAAACTTT-OH复制模板全长120；特异酶切位点BamHI。LTI基因靶标区序列(GenBankNo.S60731，248-294)5′GATCACGCGAGAGGAACACAAACCGGCTTTGTCAGATATGATGACGG3′C-探针5′p-GTGTTCCTCTCGCGTGATCTGGTCTGTGTACAAGCTTTCGGATATCCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCCCGTCATCATATCTGACAAAG-OH3′其中各区部分用空格分开，顺序分别为左靶标区，间隔，P1互补区(含HindIII位点)，间隔(含EcoRV位点)，P2区(含TaqI位点)，间隔(含EcoRI位点)，右靶标区。G-探针P-CCGGTTT-OH复制模板全长100；特异酶切位点EcoRV。STI基因靶标区序列(GenBankNo.M25607，331-383)5′CCCTCTTTTAGTCAGTCAACTGAATCACTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC3′C-探针5′p-GACTGACTAAAAGAGGGTAGGATATGTACATGAAGTACTTTGTCTGTGTACAAGCTTTCGAACCGGTACCTTACAGTTCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCGTAATTTTCTCTTTTGAAGAGTCAAC-OH3′其中各区部分用空格分开，顺序分别为左靶标区，间隔，P1互补区(含HindIII位点)，间隔(含KpnI位点)，P2区(含TaqI位点)，间隔(含EcoRI位点)，右靶标区。G-探针P-TGATTCAGTT-OH复制模板全长140；特异酶切位点KpnI。上面的三组探针都使用如下复制引物P15’HO-CGAAAGCTTGTACACAGAC-OH3’，与C-探针上的P1互补区互补；P25’HO-CTCGACTTGGAACCTGAAG-OH3’与P2区序列相同。检测步骤1、收集样品水中的大肠杆菌通过离心方法收集，固体样品上的大肠杆菌通过在无菌水中浸洗后离心收集。也可以将收集的样品在培养基中培养4-8小时，富集之后收集。分离出的细菌样品或者用DNA提取试剂盒(Promega，Qiagen等厂家产品)提取DNA，或者直接加入无菌水，或0.5％Tween20，95℃5分钟使细胞裂解，离心2分钟后取上清液使用。2、取约100ng样品DNA与上述三组C-探针和G-探针(各为50-100nM)分别或合在一起在T4DNA连接酶缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP，25μg/mlBSA)中混合，反应体积为50μl。在95℃加热3分钟，然后加5个卫斯单位(WeissUnits)的T4DNA连接酶，37℃30分钟；3、从上述反应中取出25μl，与等体积的下列混合液混合50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mMDTT，400μMdNTP，0.2μMP1引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃15分钟后，再加0.2μMP2引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃60分钟；4、加入等量的1∶1酚/氯仿混合液，混匀，离心5分钟，取上层水相，加十分之一体积的3M醋酸钠(pH6.0)，2.5倍体积的95％乙醇，14000rpm离心15分钟，将沉淀溶解在10μl纯水或TE缓冲液(10nMTris-HCl，pH7.5，0.1mMEDTA)中；5、将上述DNA用限制性内切酶在15μl反应体积中切割。6、加入3μl6X电泳样品缓冲液(30％甘油，0.25％溴酚蓝染料)，在3％的琼脂糖或6％的聚丙烯酰胺中电泳，然后用溴化乙锭或硝酸银染色，检查100bpDNA带。说明本方法中，uspA是鉴定大肠杆菌的探针，也是整个RCA-RED反应的阳性对照。如果用BamHI切割后，应该检查出120bp的DNA带，否则为试验失败。uspA的阴性对照为Pseudomonassp.，Klebsiellapneunomiae等细菌的DNA样品。在三组探针单独用来检测时，EcoRI或HindIII或TaqI的切割应该得到相同的结果，而EcoRV和KpnI的切割则分别检测LTI和STI基因，其长度分别为100和140bp。在三组探针合在一起用来检测时，EcoRI或HindIII或TaqI的切割应该得到相同的结果，即全部为阳性时，应该出现100，120，140bp三条带。用BamHI或EcoRV或KpnI切割时，分别检查uspA(120bp)，LTI(100bp)，和STI(140bp)的存在。RCA-RED试剂盒的组成1、从生物体内提取、纯化DNA或RNA，或DNA/RNA的试剂根据检测对象的性质(动物、植物、真菌、细菌等)，本试剂盒提供不同的试剂。这些试剂可以是自制的，也可以是从其他制造商处购买的；2、T4DNA连接酶及其反应缓冲液；3、纯净水；4、DNA聚合酶(如φ29DNA聚合酶，T5DNA聚合酶，M2DNA聚合酶等)及其反应缓冲液。这些酶可以是自制的，也可以是从其他厂家购买的；5、四种脱氧核苷酸，即dATP，dCTP，dGTP，dTTP；6、限制性内切酶(如EcoRI，BamHI，HindIII，TaqI，SalI，EcoKV，Smal，等)及其反应缓冲液每个试剂盒内包括1-3种内切酶，具体种类根据探针设计的不同而不同；7、特定目的基因的引物包括，但不限于C-探针，G-探针，P1、P2引物，如马传染性贫血前病毒DNA检测试剂盒，地中海血病基因检测试剂盒，大肠杆菌毒素基因检测试剂盒，转基因植物检测试剂盒等；8、阳性目的基因对照；9、正常生物样品(阴性)对照；10、使用说明书。权利要求1.一种基因的等温滚环复制与限制性内切酶检测方法，命名为RCA-RED，其基本步骤包括(1)、将DNA探针与待检样品的DNA或RNA混合，使DNA探针与目的基因杂交。该引物探针上有特定的限制性内切酶切割位点；(2)、加入DNA连接酶，使DNA探针连接成环状；(3)、加入DNA聚合酶和复制引物，今其以滚环方式复制并合成双链DNA；(4)、加入限制性内切酶，将复制的DNA切割成特定长度的片段；(5)、通过电泳，如平板琼脂糖凝胶电泳，垂直聚丙烯酰胺电泳，毛细管电泳等，检查特定长度的DNA片段；2.根据权利要求1所述的基因的等温滚环复制与限制性内切酶检测方法，其特征是RCA-RED引物的设计方法，包括在环状复制模板上加入限制性内切酶切割位点。3.根据权利要求1或2所述方法而组装的RCA-RED试剂盒，其中包括(1)、从生物体内提取、纯化DNA或RNA，或DNA/RNA的试剂；(2)、T4DNA连接酶及其反应缓冲液；(3)、纯净水；(4)、DNA聚合酶及其反应缓冲液；(5)、四种脱氧核苷酸，即dATP，dCTP，dGTP，dTTP；(6)、限制性内切酶及其反应缓冲液；(7)、针对特定目的基因设计的引物，包括，但不限于C-探针，G-探针，P1、P2引物；(8)、阳性目的基因对照；(9)、正常生物样品(阴性)对照；(10)、使用说明书。全文摘要本发明公开了一种基因的等温滚环复制与限制性内切酶检测方法及其试剂盒,其主要内容是,在试管内用特定DNA探针与目的基因杂交,用DNA连接酶把探针连接成环之后,以滚环方式复制、扩增DNA模板,然后通过限制性内切酶将扩增的DNA降解成一定长度的片段,最后通过电泳来检测目的基因是否被扩增。与通用的聚合酶链式反应(PCR)相比,用本方法检测特定的基因序列不需要价格昂贵的DNA扩增仪,可以直接检测DNA和RNA分子,具有简单、方便、经济、灵敏度高、特异性强等优点。可用于包括动物、植物和微生物的基因检测和基因扩增。试剂盒根据检测对象的性质(动物、植物、真菌、细菌等)提供不同的试剂,令检测更方便。文档编号C12Q1/68GK1384208SQ0113343公开日2002年12月11日申请日期2001年11月7日优先权日2001年11月7日发明者葛莘申请人:哈尔滨工业大学糖业研究院