一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，包括96微孔板和显色剂，96微孔板的孔中设置有原油和NaCl晶体，原油的量为1～10mg/孔，NaCl晶体在每孔中的质量不同，NaCl晶体的质量在微孔中在1mg-51mg范围呈质量梯度递增设置，或在10mg-100mg范围呈质量梯度递增设置，显色剂是质量百分浓度为0.1%～1%的碘硝基四氮唑水溶液。操作过程简单，仅需稀释石油烃降解菌等操作；试剂消耗量少，检测一个样品仅需几毫升试剂；占用设备空间小，检测一个样品仅占用约0.1L的培养箱体积；试废液少，检测一个样品仅产生几毫升废液；通量高，可同时测定数十组石油烃降解菌。
【专利说明】一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于环境微生物检测【技术领域】，涉及一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒。
技术背景
[0002]大多数石油污染通常发生在高盐环境中，例如石油污染盐溃化土壤、石油污染海水和石油污染高盐废水等。目前，石油污染高盐环境的治理已经引起人们的重视，特别是采用添加石油烃降解菌的生物方法是一种治理石油污染高盐环境的有效策略。其中，石油烃降解菌的耐盐特性是影响治理效果的关键。只有耐盐性较好的石油烃降解菌才能在高盐环境中生存，从而进一步降解石油烃，消除石油污染。因此，石油烃降解菌的耐盐特性是考察其是否能应用于石油污染高盐环境治理的重要特征。
[0003]目前用于检测石油烃降解菌耐盐特性的方法主要是摇瓶检测法。通常需要配制10~100ml含有不同浓度NaCl的液体培养基，接入待测的石油烃降解菌，经过一定时间的培养，通过测定菌体浓度的变化来判断石油烃降解菌的耐盐特性。该方法操作过程较为繁琐、试剂消耗量大、占用设备空间大，产生的测试废液较多，并且通量较低。采用高通量的微量化测定试剂盒是解决这一问题的有效途径。目前，微量化测定试剂盒已经广泛应用于多种指标的测定。例如:中国专利(201020629009)公布了一种采用微孔板检测饲用植酸酶活性试剂盒，以微孔板为反应载体，结构简便、使用方便，大大了提高工作效率，实现了大量样品的同时测定；中 国专利(201220134074)公布了一种羟基维生素D检测试剂盒，微孔内包被有高特异性鼠羟基维生素D单克隆抗体层，提高了测定的线性范围；美国专利(US6428974B1)公布了一种用于抗菌药品测试的微孔板，具有操作简单、重复性好的优点；欧洲专利(EP1865074B1)公布了一种用于反转录PCR的微孔板，大大简化了反转录PCR的操作。因此，采用微量化测定试剂盒检测石油烃降解菌的耐盐特性具有较强的技术可行性。然而，目前国内外并没有石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒的相关专利。
【发明内容】
[0004]针对石油烃降解菌耐盐特性传统检测方法操作过程较为繁琐等缺陷，本发明的目的是提供一种操作过程简单、试剂消耗量少、占用设备空间小、测试废液少和通量高的石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒。
[0005]本发明的技术方案概述如下:
[0006]一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，包括96微孔板和显色剂，所述96微孔板的孔中设置有原油和NaCl晶体，所述原油的量为I~IOmg/孔，所述NaCl晶体在每孔中的质量不同，NaCl晶体的质量在微孔中在lmg-51mg范围呈质量梯度递增设置，或在IOmg-1OOmg范围呈质量梯度递增设置，所述显色剂是质量百分浓度为0.1%~1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0007]所述原油的量优选为5mg/孔。[0008]优选的是:NaCl晶体的质量在微孔中在lmg_51mg范围呈质量梯度递增设置为lmg、6mg、llmg、16mg、21mg、26mg、31mg、36mg、41mg、46mg 和 51mg 或 lmg、llmg、21mg、31mg、4 lmg 和 5 lmg o
[0009]优选的是:NaCl晶体的质量在微孔中在IOmg-1OOmg范围呈质量梯度递增设置为 10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 和 100mg 或 10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg 和IOOmg0
[0010]优选的是:显色剂是质量百分浓度为0.5%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0011]本发明的优点:
[0012]①操作过程简单，仅需要稀释石油烃降解菌等操作；
[0013]②试剂消耗量少，检测一个样品仅需几毫升试剂；
[0014]③占用设备空间小，检测一个样品仅占用约0.1L的培养箱体积；
[0015]④试废液少，检测一个样品仅产生几毫升废液；
[0016]⑤通量高，可同时测定数十组石油烃降解菌。
【具体实施方式】
[0017]本发明提供一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒原理为:将石油烃降解菌用BH培养基等无机盐培养基稀释，加入到本发明试剂盒的96微孔板的微孔中。由于96微孔板的不同的孔中设置有原油和不同重量的NaCl晶体，因此形成了不同盐浓度的培养基。石油烃降解菌培养过程中仅在合适的盐浓度下生长，其生长情况可以通过添加显色剂碘硝基四氮唑后观察其颜色变化来测定。
[0018]BH培养基的配方为:磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，硝酸铵lg，硫酸镁0.2g，氯化铁0.05g,氯化钙0.02g,加水至1000ml。
[0019]本发明以环境微生物学为理论依据，综合极端微生物学和高通量检测技术的相关理论知识，针对石油烃降解菌耐盐特性传统检测方法的诸多缺陷，设计本检测试剂盒，采用固定化原油和不同重量NaCl晶体的96微孔板结合碘硝基四氮唑显色剂检测石油烃降解菌耐盐特性。
[0020]下面通过具体实施例阐述本发明，目的在于使本领域的技术人员能够更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0021]本发明实施例所使用的两个菌:食烧烃戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)CGMCCN0.6845 和克伯村鸟氨酸微菌(Ornithinimicrobium kibberense) CGMCC N0.6844 是验证本发明的试剂盒的有效性的，并不对本发明的试剂盒的保护范围进行限制。
[0022]食烧烃戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)由本申请的发明人从石油污染盐溃化土壤中分离筛选得到，具有石油烃高效降解特征和耐盐特征。菌株于2012年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并已存活，保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，电话:010-64807355，其微生物保藏编号为 CGMCC N0.6845。
[0023]克伯村鸟氨酸微菌(Ornithinimicrobium kibberense)由发明人从石油污染盐溃化土壤中分离筛选得到，具有石油烃高效降解特征和耐盐特征。菌株于2012年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并已存活，保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，电话:010-64807355，其微生物保藏编号为 CGMCC N0.6844。
[0024]实施例1
[0025]一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，包括96微孔板和显色剂，96微孔板的孔中设置有原油和NaCl晶体，原油的量为5mg/孔，NaCl晶体在每孔中的质量不同，NaCl晶体的质量在微孔中在lmg-51mg范围呈质量梯度递增设置为lmg、6mg、llmg、16mg、21mg、26mg、31mg、36mg、41mg、46mg和51mg,显色剂是质量百分浓度为0.1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0026]本实施例试剂盒的使用:
[0027]将食烷烃戈登氏菌(Gordonia alkanivorans) CGMCC N0.6845用BH培养基稀释10倍，加入到本发明的试剂盒中的96微孔板的设置有原油和NaCl晶体的孔中，每孔加入200ul，培养7天，每孔加入50ul显色剂，测得该菌株可在21mg的NaCl中生长，即可耐受浓度为10.5%的NaCl。检测操作共耗时lOmin，共消耗试剂3ml。
[0028]实施例2
[0029]一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，包括96微孔板和显色剂，96微孔板的孔中设置有原油和NaCl晶体，原油的量为IOmg/孔，NaCl晶体在每孔中的质量不同，NaCl晶体的质量在微孔中在lmg-51mg范围呈质量梯度递增设置为lmg、llmg、21mg、31mg、4Img和51mg，显色剂是质量百分浓度为0.1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0030]本实施例试剂盒的使用:`[0031]将食烷烃戈登氏菌(Gordonia alkanivorans) CGMCC N0.6845用BH培养基稀释10倍，加入到本发明的试剂盒中的96微孔板的设置有原油和NaCl晶体的孔中，每孔加入200ul，培养7天，每孔加入30ul显色剂，测得该菌株可在21mg的NaCl中生长，即可耐受浓度为10.5%的NaCl。检测操作共耗时lOmin，共消耗试剂2.5ml。
[0032]实施例3
[0033]一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，包括96微孔板和显色剂，96微孔板的孔中设置有原油和NaCl晶体，原油的量为Img/孔，NaCl晶体在每孔中的质量不同，NaCl晶体的质量在微孔中在IOmg-1OOmg范围呈质量梯度递增设置为10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg和IOOmg,显色剂是质量百分浓度为1%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0034]本实施例试剂盒的使用:
[0035]将食烷烃戈登氏菌(Gordonia alkanivorans) CGMCC N0.6845用BH培养基稀释10倍，加入到本发明的试剂盒中的96微孔板的设置有原油和NaCl晶体的孔中，每孔加入200ul，培养7天，每孔加入30ul显色剂，测得该菌株可以在20mg的NaCl中生长，即可耐受浓度为10%的NaCl。检测操作共耗时lOmin，共消耗试剂2.5ml。
[0036]实施例4
[0037]一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，包括96微孔板和显色剂，96微孔板的孔中设置有原油和NaCl晶体，原油的量为2mg/孔，NaCl晶体在每孔中的质量不同，NaCl晶体的质量在微孔中在IOmg-1OOmg范围呈质量梯度递增设置为10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg 和lOOmg，所述显色剂是质量百分浓度为5%的碘硝基四氮唑水溶液。
[0038]本实施例试剂盒的使用:[0039]将克伯村鸟氨酸微菌(Ornithinimicrobiumkibberense)CGMCC N0.6844 用 BH 培养基稀释10倍，加入到本发明的试剂盒中的96微孔板的设置有原油和NaCl晶体的孔中，每孔加入200ul，培养7天，每孔加入30ul显色剂，测得该菌株可以在20mg的NaCl中生长，即可耐受浓度为10%的NaCl。检测操作共耗时lOmin，共消耗试剂2.5ml。
【权利要求】
1.一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，其特征在于包括96微孔板和显色剂，所述96微孔板的孔中设置有原油和NaCl晶体，所述原油的量为I~IOmg/孔，所述NaCl晶体在每孔中的质量不同，NaCl晶体的质量在微孔中在lmg-51mg范围呈质量梯度递增设置，或在IOmg-1OOmg范围呈质量梯度递增设置，所述显色剂是质量百分浓度为0.1%~1%的碘硝基四氮唑水溶液。
2.根据权利要求1所述一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，其特征在于所述原油的量为5mg/孔。
3.根据权利要求1所述一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，其特征在于所述NaCl晶体的质量在微孔中在lmg-51mg范围呈质量梯度递增设置为lmg、6mg、llmg、16mg、21mg、26mg、31mg、36mg、41mg、46mg和 51mg 或 lmg、llmg、21mg、31mg、41mg 和 51mg。
4.根据权利要求1所述一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，其特征在于所述NaCl晶体的质量在微孔中在IOmg-1OOmg范围呈质量梯度递增设置为10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 和 IOOmg 或 10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、7Omg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg 和 IOOmg。
5.根据权利要求1所述一种石油烃降解菌耐盐特性微量化检测试剂盒，其特征在于所述显色剂是质量百 分浓度为0.5%的碘硝基四氮唑水溶液。
【文档编号】C12R1/01GK103589774SQ201310305544
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】王新新, 吴亮, 谭耀模, 杨勇, 亓俊良, 安伟, 牛志刚, 陈宇 申请人:中国海洋石油总公司, 中海油能源发展股份有限公司, 中海石油环保服务（天津）有限公司