一株不动杆菌及其在石油降解中的应用的制作方法

本发明属于石油降解领域，具体涉及一种可用于降解石油的不动杆菌及其在石油污染土壤或水体中的应用。

背景技术：

石油是现代社会中最主要的能源之一。在石油开采、加工和运输过程中不可避免地会发生石油的泄漏，对环境造成污染，随着石油使用量的增加，石油污染问题日益突出。石油作为一种成分较为复杂的混合物，其去除方法主要有三种：物理方法、化学方法和生物方法。物理方法主要是吸附和隔离，只是将污染物转移并未完全去除；化学方法主要是萃取和氧化，处理成本高、污染物去除不彻底且容易引入二次污染；生物方法是指利用微生物降解石油污染物，其处理效果好、成本低、对环境影响较小，具有较好的应用前景。

石油主要污染表层20cm深度内的土壤，石油类污染物会堵塞土壤孔隙，改变土壤有机质中的碳氮比和碳磷比，造成土壤板结、理化性质发生改变，不再适宜生物生存。石油污染物跟土壤结合紧密不易去除，处理时间较长、处理难度较大。生物修复技术是石油污染原位修复处理的首选技术，但油田土壤中盐碱度较高，对生物有明显的抑制作用。提高盐碱地土壤生物修复效率的方法有两种：一是通过压碱、土壤改良和增加地表植被等方法降低土壤的盐碱度，但存在工作量大、耗时长、成本高的问题；二是筛选耐盐耐碱高效的石油降解菌株。

目前，已有大量的石油降解菌被分离纯化，如石油降解菌株pseudomonassp.j1(公开号cn102816712a：一株耐受高浓度聚合物的石油降解菌株及其应用)能够在24h内将无机盐培养基中2g/l的石油降解80％以上，但菌液的最大od600值仅为2.1；菌株pseudomonasaeruginosastrainsjtd-1在3天内能够将2g/l饱和烷烃完全降解，但菌体生物量od600值最大仅为1.7(liuh,xuj,liangrb,etal.characterizationofthemedium-andlong-chainn-alkanesdegradingpseudomonasaeruginosastrainsjtd-1anditsalkanehydroxylase.plosone.2014,9(8):e105506.)。这些石油降解菌大多生长缓慢，降解周期长。同时，已报道的石油降解菌株主要应用于常温、低盐、中性环境条件下，对于低温、含盐、碱性环境中的石油降解菌研究正处于起步阶段。因此分离和培养环境中高效、耐受石油烃浓度高、耐盐碱的石油烃降解菌株对石油污染的原位修复具有重要的意义。

将高效石油降解菌株固定到某种载体上制备成生物降解菌剂，利用生物降解菌剂对石油污染土壤进行原位修复技术是目前较受欢迎的方法。固定化载体根据来源不同可以分为化学载体和天然载体，化学载体的优点是固定菌体的效率高，缺点是成本高且会引入新的污染物；天然载体具有成本低且不会引入新的污染物等优点，但缺点是固定化效率较低。因此寻找和开发固定化效率高且不会影响土壤特性的天然载体是研究的一种思路。

菌糠是食用菌栽培后剩余的废料，其中含有食用菌菌丝、纤维素、半纤维素、木质素、各种酶类、多糖、有机酸、各种矿物质和生物活性物质等，有种类繁多含量丰富的氨基酸和菌类多糖等。近年来，我国年产各类食用菌已达上千万吨，居世界第一位。每年随之产生的菌糠总量也有近600万吨。这些废弃菌糠除部分被用作畜禽饲料、有机肥料、花土外，大部分按传统的处理方法丢弃或焚烧，不但造成资源浪费，而且导致霉菌和害虫滋生、空气中有害孢子和害虫的数量增加，从而造成环境污染。

技术实现要素：

针对现有技术问题，本发明的目的之一是提供一种用于降解石油的高效菌株，且其可以耐低温、耐盐、耐碱。获得菌株如下：

一株不动杆菌，分类名为acinetobacterbaylyi，命名为acinetobacterbaylyilhk，已于2017年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏号为cctccm2017264。

本发明的目的之二是提供acinetobacterbaylyilhk在降解石油中的应用。

进一步地，所述应用具体为将acinetobacterbaylyilhk菌液直接投加到石油污染的水体或者土壤中；或将acinetobacterbaylyilhk固定到载体上制备成菌剂，再将菌剂施用到石油污染的水体或者土壤中。

进一步地，所述载体为菌糠，优选粒径≤300微米的无菌菌糠。

进一步地，所述菌糠的处理方法为高压蒸汽灭菌处理，将灭菌后的菌糠于40-60℃烘干至恒重后，粉碎机粉碎过30-50目筛，在蒸馏水中浸泡1-4h，调节ph到6.5-7.5，置于40-60℃烘干至恒重。

进一步地，所述菌剂中acinetobacterbaylyilhk有效活菌数与菌糠干重的比例为0.1×10¹⁰-5×10¹⁰个/g。

进一步地，所述菌剂的制备方法为将acinetobacterbaylyilhk菌液与菌糠直接混合均匀，得到直混菌剂。

进一步地，为减少菌剂的水分，以利于储存和运输，将其制成冻干菌剂，制备方法如下：向acinetobacterbaylyilhk菌液中加入150-300g/l甘油混匀，再与菌糠混合均匀，置于真空冷冻干燥仪中进行干燥处理，得到冻干菌剂。

进一步地，所述真空冷冻干燥的参数为-44℃预冷3h，升温至-34℃升华10h，继续升温至31℃，即得到冻干菌剂。

进一步地，应用于石油降解的acinetobacterbaylyilhk处于对数生长期或稳定期，其菌体密度为0.1×10¹⁰-5×10¹⁰个/ml。

进一步地，所述acinetobacterbaylyilhk的培养采用lb液体培养基，配方为：氯化钠10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l。

进一步地，所述acinetobacterbaylyilhk的培养条件为：温度25-37℃、ph为6.5-7.5、培养时间12h-48h、转速100-200rpm，优选温度30℃、ph7.0、培养时间48h、转速170rpm。

进一步地，所述菌剂用于石油污染土壤修复的使用方式为：保持土壤25wt％-30wt％的水分含量，按照每平方米土壤1kg菌剂的用量进行菌剂的播种，并对表层0-20cm土壤进行翻耕，使之与菌剂充分混合。

相比于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)本发明提供的acinetobacterbaylyilhk菌株能以柴油为唯一碳源生长，因此可以用于石油的降解，特别是水体、土壤中石油污染物的降解；其培养方法简单、生长周期短、生物量大，耐受石油烃浓度高、应用范围较广；在lb液体培养基中培养12小时od600nm的吸收值可达6.0以上，24小时od600nm的吸收值可达8.0以上，可在短时间内获得高浓度菌体。

(2)本发明采用食用菌菌糠作为固定化载体材料制备成菌剂，菌糠为自然废弃物，价格低廉，含有丰富的营养成分，不会引入新的污染物，不会影响土壤特性，一方面为农业废弃物提供资源化利用的出路，另一方面食用菌菌糠可以为石油降解菌提供寄居空间和营养物质，起到改善土壤质量的作用。

(3)本发明菌剂所用固定化方法为吸附法，仅需将菌液与菌糠混合均匀即可，制备工艺简单，生产费用低，处理效果好。

(4)菌株能够在ph9.0、30℃、氯化钠浓度3％的柴油无机盐培养基中生长良好，降解效率为53.5％，因此菌株具有耐低温、耐盐碱性能，可用于盐度为0-3％，ph为6-9的土壤中石油污染物的降解。本发明菌剂对石油污染土壤，尤其是盐碱地地区有明显的修复效果，可用于大面积石油污染土壤的生物修复。

附图说明

图1菌株lhk的扫描电镜图；

图2菌株lhk的菌落照片；

图3菌株lhk的系统发育进化树；

图4实施例2中温度对菌株lhk生长的影响；

图5实施例2中ph对菌株lhk生长的影响；

图6实施例2中盐度对菌株lhk生长的影响；

图7实施例4菌糠颗粒的扫描电镜图；

图8实施例4固定菌体后的菌糠颗粒扫描电镜图。

生物材料样品保藏信息：

不动杆菌(acinetobacterbaylyilhk)，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2017年5月15日，保藏编号：cctccm2017264。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

以下实施例中所用的培养基配方为：

无机盐培养基：12.6g/lk2hpo4·3h2o，3.4g/lkh2po4，1.0g/lna2so4，0.2g/lmgso4·7h2o，微量金属盐溶液1ml/l。

微量金属盐溶液：0.05g/lcacl2·2h2o，0.05g/lcucl2·2h2o，0.008g/lmnso4·h2o，0.04g/lfeso4·7h2o，0.05g/lznso4，0.1g/lna2moo4·2h2o，0.05g/lna2wo4·2h2o，0.038g/lcocl2·6h2o，0.02g/lmncl2·4h2o，0.0124g/lh3bo3。

lb液体培养基：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，ph7.0。

柴油无机盐培养基：无机盐培养基中加入终浓度1％的柴油。

筛选培养基平板：lb液体培养基中加入1.5％琼脂。

以上培养基使用前均在0.1mpa、121℃灭菌30min；柴油的灭菌方法为过滤除菌，在接种时加入相应量的柴油。

实施例1acinetobacterbaylyilhk菌株的获得

1、石油降解菌的筛选、分离及纯化

(1)菌株来源：石油降解菌从辽河油田石油污染的土壤中分离获得。

(2)菌株的富集：

a.取5g石油污染的污泥样品，加入到含有1％柴油的柴油无机盐培养基中，30℃振荡培养箱中恒温培养5天，振荡频率为170rpm。

b.从上一步培养液中取上清液5ml，转接至新的含有1％柴油的柴油无机盐培养基中，30℃振荡培养箱中培养5天，振荡频率为170rpm。

c.重复步骤b四次，至柴油无机盐培养基中的溶液较为澄清。

(3)菌株的纯化

将步骤(2)中最终得到的培养液按照10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸的倍数进行梯度稀释并分别涂布到不同的lb固体培养基平板上，30℃倒置培养24h后平板上长出单菌落，挑取不同形态的单菌落至柴油无机盐培养基中。于30℃、170rpm恒温震荡摇床中培养5天，选取生长较好的(od600nm吸收值较高)菌株8株进行编号和保藏。

2、菌株lhk的形态观察和生理生化鉴定

在筛选到的8株菌株中，编号为lhk的菌株在以柴油为唯一碳源的培养基中生长较快。扫描电镜观察该菌株的菌体为球形(图1)，直径约为0.4～0.5μm，长度约为0.6～0.8μm，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色为阴性。在lb固体培养基上的菌落形态为球性(图2)，表面光滑，边缘整齐，湿润，半透明，白色菌落。

3、菌株lhk的16srdna分子学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，sanprep柱式基因组提取试剂盒)提取菌株lhk的全基因组，采用细菌16s通用引物27f(5′-gagtttgatcatggctcag-3′)和1492r(5′-ggttaccttgttacgatc-3′)对其16srdna进行pcr扩增，反应体系如表1所示。

表1pcr反应体系

pcr反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸5min。菌株lhk的16srdna测序结果如seqidno.1所示。通过比对发现菌株lhk跟acinetobacterbaylyib2(genbank登录号：af509820)的序列相似度最高(99％)，因此菌株lhk属于不动杆菌属，将其命名为acinetobacterbaylyilhk。将菌株lhk的16srdna序列利用mega6.0软件构建系统发育进化树，如图3所示。

实施例2acinetobacterbaylyilhk的耐低温、耐盐、耐碱性能

1、温度(℃)对菌株lhk生长量的影响

采用单因素变量，将等量的菌株lhk菌液接种到相同条件下的柴油无机盐液体培养基(ph＝7.0、盐度0％)中，分别在25℃、30℃、37℃条件下，培养6d，每24h取样测定其od600nm的吸收值，来衡量其生长量大小。研究发现菌株lhk在低温25℃和30℃条件下生长优于37℃，如图4所示。

2、初始ph对菌株lhk生长量的影响

采用单因素变量，将等量的菌株lhk菌液接种到相同条件下的柴油无机盐液体培养基(ph＝7.0、盐度0％)中，调节初始ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在30℃恒温振荡培养6d，取样测定其od600nm吸收值，菌株lhk在ph为6-9的范围内均能较好的生长，如图5所示。

3、盐度(氯化钠浓度)对菌株lhk生长量的影响

采用单因素变量，将等量的菌株lhk菌液接种到盐度分别为0％、1％、2％、3％、5％的初始ph值7的柴油无机盐液体培养基中，在30℃恒温培养7d，取样测定其od600nm吸收值，菌株lhk在盐度为0-3％的范围内均能较好的生长，如图6所示。

实施例3acinetobacterbaylyilhk的水体修复试验

将菌株lhk按照1％的接种量接种至含有1％柴油的无机盐培养基中，置于30℃、170rpm恒温振荡摇床中培养7d后，利用紫外分光光度法测定对柴油的降解效率。结果如表2所示。

表2不同条件下菌株lhk对无机盐培养基中柴油的降解效率

实施例4acinetobacterbaylyilhk菌剂的制备

1、acinetobacterbaylyilhk菌液的制备

将分离纯化的acinetobacterbaylyilhk接种到lb培养基中，在170rpm、30℃条件下进行培养，培养48h左右，测量od600nm的吸收值在8.0左右，菌体密度在3×10¹⁰个/ml。

2、食用菌菌糠的预处理

处理步骤：

(1)灭菌：将废弃的菌糠进行高压蒸汽(121℃，30min)灭菌处理；

(2)粉碎：将灭菌后的菌糠平铺于50℃烘箱中烘干至恒重后，用粉碎机将干燥的菌糠粉碎，过30目筛；

(3)浸泡：将过筛后的菌糠在蒸馏水中浸泡2h，调节ph到7.0左右；

(4)干燥：置于50℃烘箱中烘干至恒重后，即得到菌糠颗粒。

3、acinetobacterbaylyilhk的固定化

(1)直混菌剂

将acinetobacterbaylyilhk菌液(菌体密度在3×10¹⁰个/ml)和处理后的菌糠颗粒按照体积质量比1:1的比例充分混合制备成直混菌剂。

(2)冻干菌剂

考虑到上述方法制备的菌剂水分含量较高，向acinetobacterbaylyilhk菌液中加入150g/l甘油后再与菌糠颗粒进行充分混匀，将混合后的菌剂置于真空冷冻干燥仪中进行干燥处理，得到冻干菌剂。

实施例5直混菌剂的土壤修复试验

将实施例4制备的直混菌剂应用于辽河河口石油污染土壤(石油浓度为1mg/kg，盐度1％，ph为7.5)中，保持土壤25wt％-30wt％的水分含量，以播种的方式，每平方米土壤施用1kg直混菌剂，并对表层0-20cm土壤进行翻耕，使之与固定化石油降解菌剂充分混合，并保证土壤良好的通气性。修复时间为20d，测定石油污染物的去除率为65％。

实施例6冻干菌剂的土壤修复试验

与实施例5的不同之处在于：每平方米土壤施用1kg实施例4制备的冻干菌剂，修复时间为20d，测定石油污染物的去除率为59％。

sequencelisting

<110>青岛农业大学;中国海洋大学

<120>一株不动杆菌及其在石油降解中的应用

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