新的核糖核酸内切酶的制作方法

专利名称：：新的核糖核酸内切酶的制作方法新的核糖核酸内切酶
技术领域：
[OOOl]本发明涉及一种可用于基因工程领域的新的序列特异性的核糖核酸内切酶。技术背景有报道称一些原核质粒具有分离后杀灭(PSK)宿主的功能，质粒从宿主中脱落出，以维持在宿主中的质粒。这种质粒具有毒素-抗毒素基因。抗毒素与细胞中的毒素相结合以灭活毒素。抗毒素容易被蛋白酶卩絲军。抗毒素被蛋白酶糊和勺结果是稳定毒素激舌(非专利文件l)。这种毒素-抗毒素基因还存在于大多数原核生物的染色体中。它们可对各种应激做出应答，并在编程性细胞死亡中发挥作用。虽然这种毒素的功能尚未得至院封正实，但是已提出CcdB和ParE可控制耙DNA促旋酶的复制，以及RelE和Doc可控制转录(非专利文件l和2)。至少五种毒素RelE、ChpAK(MazF)、ChpBK、YoeB和YafQ存在于大肠杆菌中(非专利文件2)。Chnstensen等人已经报导了RelE是一种以核糖体依赖性的方式识别特定三核苷酸密码子以切割mRNA的核糖核酸内切酶(非专利文件3和4)。此外，Chnstensen等人还报导了ChpAK、ChpBK和YoeB也是以核糖体和密码子依赖性的方式切割mRNA的核糖核酸内切酶(非专利文件5和6)。Inouye等人证实MazF(ChpAK)是一种非以核糖体依赖性的方式识别特定核苷酸ACA以切割mRNA的核糖核酸内切酶(非专利文件7和8)。Munoz-Gomez等人报导用MazF对RNA的切割是NAC特异性的(非专利文件9)。Inouye等人证实质粒R100中的PemK是一种可通过识别特定核苷酸UAH(H是C、A或U)以切割mRNA的核糖核酸内切酶(专利文件l、非专利文件IO)。如上所述，已知RelE或PemK族的毒素可能是以核苷酸特异性的方式切割mRNA的核糖核酸内切酶。更具体而言，PemK族毒素可能是以非核糖体依赖性的方式识别特定核苷酸以切割mRNA的核糖核酸内切酶。很多PemK族毒素存在于原核生物中，并且人们已经深入^:究、比较了它们的序列(非专利文件l和ll)。Anantharaman等人在毒素相关的遗传信息和已经完成遗传分析的生物体的相关遗传信息的基础上，fflil基因邻近分析(geneneighborhoodanalyses)来对毒素进行系统分类，并由未知功能的蛋白推测毒素样蛋白(非专利文件12)。此外，通过分析还提出不仅ReE和PemK，Doc族的蛋白和具有PIN结构域的蛋白均可能具有核糖核酸酶的活性。已经在耐放射微球菌(D側ococotfra血Wwrara)中发现了两种PemK族的毒素(非专利文件13)。并在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中发现了七种PemK族的毒素。相同的毒素还存在于牛分枝杆菌(A/戸tocten'謂6ov0中。至于以序列特异性的方式切割核苷酸的酶，已经发现很多可切割双链DNA的限制内切酶并且广泛用于基因工程领域。以序列特异性方式切割单链RNA的酶，己经发现可特异性地在G核苷酸行切割的核糖核酸酶Tl并用于基因工程领域(非专利文件14)。但可识别单链RNA中的多个核苷酸并进行特异性切割的酶的数量仍然很少。在基因工程领域中人们希望这种酶能得到进一步的研究。如果发现可特异性地识别并切割三个核苷酸(如MazF)或三个以上核苷酸的序列的核糖核酸内切酶，这种核糖核酸内切酶将成为基因工程领域中非常有用的酶。专利文件1:WO2004/113498非专利文件l:J.Bacteriol.,182:561-572(2000)Science,301:1496-1499(2003)MolecularMicrobiol.，48:1389-1400(2003)Cell,122:131-140(2003)J.Mol.Biol.，332:809-819(2003)MolecularMicrobiol.，MolecularCell,12:丄Biol.Chem.，280:FEBSLetters,567:非专利文件2:非专利文件3:非专利文件4:非专利文件5:非专利文件6:非专利文件7:非专利文件8:非专利文件9:非专利文件10:非专利文件ll:51:1705-1717(2004)913-920(2003)3143-3150(2005)316-320(2004)JBiol.Chem.，279:20678-20684(2004)J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，1:295-302(1999)非专利文件12:GenomeBiology,4:R81(2003)非专利文件13:NucleicAcidsResearch,33:966-976(2005)非专利文件14:MethodsinEnzymology，341:2841(2001)
发明内容本发明解决的技术问题本发明人在上述现有技术的基础上完成了本发明。本发明的主要目的是找至lj一种新的序列特异性的核糖核酸内切酶，鉴别这种新的序列特异性核糖核酸内切酶的切害u序歹u特异性，并提供它在基因工程中的应用。解决问题的方法
技术领域：
：本发明人筛选了序列特异性核糖核酸内切酶，并且发现由耐放射微球菌中的DR0662基因和牛分枝杆菌BCG中的Mb2014c同系物的基因编码的多肽是新的序列特异性核糖核酸内切酶。此外，本发明人鉴定了这些酶的切割序列特异性。由此完成本发明。本发明涉及[1]一种具有序列特异性核糖核酸内切酶活性的多肽，其具有SEQIDNO:l或2所示的氨基酸序列或在J^氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氮基酸残基所得的氨基酸序列；[2]—种编码[l]的多肽的核酸；[3][2]中的核酸，它具有SEQIDNO:3或4的核苷鹏列；[4]一种核酸，它能与[2]或[3]的核酸在严格条件下杂交、并编码具有序列特异性核糖核酸内切酶活性的多肽；[5]—种含有[2]至[4]任意一种核酸的重组DNA;[6]—种由[5]的重组DNA转化的转化体；[7]—种制备[l]中的多肽的方法，该方法包括培养问的转化体，并从培养基中收集具有序列特异性RNA切割活性的多肽；[8]—种制备单链RNA卩絲产物的方法，该方法包括使[l]的多肽作用于单链RNA;禾口[9]一种P絲f单链RNA的方法，该方法包括使[l]的多肽作用于单链RNA。本发明的效果本发明发现了一种新的序列特异性核糖核酸内切酶，鉴别该新的序列特异性核糖核酸内切酶的切害U序歹鹏异性，供了其在基因工程中的应用。具体实施方式1.本发明的多肽本发明的多肽具有SEQIDNO:l或2所述的氨基酸序列或在所述氨基IOT列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列，并显示序列特异性核糖核酸内切酶活性。本发明的多肽具有的活性^t单链RNA特异的核糖核酸内切酶的活性。该活性能够水解单链核酸3'侧的的磷酸二酯键，该单链核酸中含有作为构成核酸的核糖核酸。由上述活性7K解的核酸具有3'端羟基和5端磷酸基；3'端磷酸基和5'端羟基；或具有2',3'-环磷酸基和羟基的5端。具有至少一个核糖核苷酸分子的核酸可用作本发明多肽的底物。其包括但不限于RNA、含有脱氧核糖核酸的RNA和含有核糖核苷酸的DNA。该底物可含有不同于正常核酸所含的核苷酸(例如，脱氧肌苷、脱氧尿苷或羟甲基脱氧尿苷)的核苷酸，只要这些核苷酸不抑制本发明多肽的活性即可。本发明的多肽特异性地作用于单链核酸。它不能切割双链核酸，例如双链RNA或RNA-DNA杂合体。本发明的多肽具有以核苷,列特异性的方式切害赅酸的活性。下述内容不作为对本发明的限制。如果单链RNA分子含有序列5'-UUCCUUU-3'，那么具有氨基酸序列SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的多肽7jC解序列中第二个U残基和第三个C残基之间的磷酸二酯键。如果单链RNA^^"有序列5'-UCCUU-3'，那么具有氨基,列SEQIDNO:2的多肽7k解序列中第一个U残基和第二个C残基之间的磷酸二酯键。例如，可利用寡核糖核苷酸MRI031(SEQINNO:8)作为底物来确认所述多肽的活性是7K解所述寡核糖核苷酸中第7个和第8个核苷酸之间的磷酸二酯键的活性。在核糖体不存在时，本发明多肽具有核糖核酸内切酶活性。因此，这种活性是非核糖体依赖性的活性。例如，将单链RNA作为底物可测定本发明多肽的单链RNA-特异性核糖核酸内切酶的活性。更具体地，可通过使将要进行活性测定的多肽作用于单链RNA并确定是否发生RNA切割来进行测定，该单链RNA利用RNA聚合酶通过作为模板的DNA转录获得或通过化学合成获得。例如，可M电泳(琼脂糖凝胶、丙稀翻安凝胶等)来确认RNA的卩絲军。向作为底物的RNA附加的适当标记(例如力幼寸性同位素，荧光物质)将有助于在电泳后检测P絲军产物。本发明的多肽包括含在SEQIDNO:l或2的氨基酸序列的基础上缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列的多肽，只要该多肽显示能以序列特异性方式水解单链RNA的核糖核酸内切酶的活性即可。这样的突变体多肽的例子包括与SEQIDNO:1或2的多肽具有50%，高，优选70%或更高，更优选90%或更高同源性的多肽。这样的突变体多肽落入本发明的范围中，即使它识别和切割的序列是不同于氮基酸序列SEQIDNO:1或2所示的多肽识别和切割的序列。2.编码本发明多肽的核酸本发明提供了一种编码具有序列特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的核酸。这样的核酸包括但不限于编码具有序列特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的核酸，所述多肽由SEQEDNO:l或2所示的氨基酸序列或在所述氨基列中缺失、添加、插入或取代一个或多个，例如1-10个氨基酸残基所得的氨基列。在SEQEDNO:l或2的氨基,列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氮基酸残基所得的氨基,列的例子包括与SEQIDNO:l或2的多肽具有50%或更高，伏选70%或更高，更优选90%或更高同源性的氨基酸序列。此外，本发明的核酸包括编码具有序列特异性核糖核酸内切酶活性、育,在严格条件下与这种核酸杂交的多肽的核酸。所述的严格条件条件例如在J.S咖brook等人(eds.)，MolecularCloning:ALaboratoryManual第二版.，1989,ColdSpringHarborLaboratory中所描述的。更具体地，在如下的示例性条件下于65i:下，在含有0.5XSDS、5xDenhardt's溶液和0.01%变性的鮭鱼精DNA的6xSSC中与探针一起培养12至20小时。例如，在37。C下，用含有0.5%SDS的0.1xSSC洗涤以除去非特异性结合的探针后检测与探针杂交的核酸。例如，编码本发明的多肽的核酸可以m以下方式获得。其所编码的氨基酸序列与具有核糖核酸内切酶活性以识别特定核苷酸序列并切割mRNA(例如MazF或PemK)的毒素具有同源性的基因是编码具有序列特异性核糖核酸酶活性多肽的核酸的候选基因。例如，可在细菌基因组中找到这种候选基因。已经在耐方划寸微球菌中发现了PemK族的两种毒素。已经在结核分枝杆菌中发现了PemK族的七种毒素。相同的毒素还存在于牛分枝杆菌中。在所述的七种毒素中，牛分枝杆菌BCG至少具有Mb20I4c的同系物(J.Bacteriol，178:1274-1282(1996))。例如，可M根据核苷,列信息设计的引物禾佣PCR从细菌基因组中分离出f魏基因。如果已知全部的核苷,列，那么可以使用DNA合成^^合成候选基因的全序列。可利用经插入了候选基因的表达载体转化的适当的宿主(例如大肠杆菌)由候选基因表达蛋白。由于能糊军宿主RNA的序歹鹏异性核糖核酸酶的表达可使宿主致死，必须在诱导前严格地抑制候选基因的表达。例如，4OT表达系统，诸如采用T7聚合酶启动子的pET系统(Novagen)或冷休克表达控制系统的pCold系统(TakaraBio)。为了从候选基因中方便地纯化表达产物，4，在表达产物上附加一个有助于纯化的肽(例如组氨酸标记)。出于这个目的，可使用含有编码这种肽的区域的作为表达载体。可以根据i^方法测定核糖核酸内切酶活性，其中将单链RNA用作底物。利用以被切割RNA作为模板、与所述RNA互补的引物和逆转录酶通过引物延伸可鉴定切割位点。由于延长反应在引物延伸的切割位点结束，因此可M电泳来确定延伸链的链长以鉴定切割位点。此外，还可通过具有任意序列的化学合成的寡核糖核苷酸与候选基因的表达产物作用，并禾拥变性丙烯酰胺凝胶电泳法等方法来确定是否存在切割来严格地鉴定核苷酸序列的特异性。3.制备本发明多肽的方法例如，通过(1)从产生本发明多肽的微生物培养物中纯化或(2)从含有编码本发明多肽的核酸的转化体的培养物中纯化本发明的多肽。制备本发明多肽的微生物的例子包括但不限于微球菌属和分枝杆菌属的细菌。例如，可从耐方妇寸微球菌或牛分枝杆菌，优选耐方划寸微球菌Rl或牛分枝杆菌BCG获得本发明的多肽。该微生物可以在适合微生物生长的环境下培养。可釆用蛋白纯化的常规方法，诸如细胞破碎、沉淀分级分离(例如硫酸铵沉淀)、各种色谱法(例如离子交换色谱法、亲合色谱法、疏水色谱法、分子筛色谱法)或其组合来纯化细胞或培养基中制得的感兴趣的多肽。还可从含有编码本发明多肽的核酸的重组DNA转化获得的转化体中获得本发明的多肽。ttiMk，可将合适的启动子连接在编码重组DNA中编码多肽的核酸的上游。由于本发明的多肽可以对宿主产生致死作用，因此，的是启动子或含有启动子的表达系统严格控制编码本发明多肽的核酸发生转录。这种系统例如pET系统或pCold系统。重组DNA可以转入宿主细胞中。可选择地，它可以转移并插入到合适的载体(例如质粒载体、噬菌体载体或病毒载体)中。重组DNA可整合入宿主染色体中。对于被转化的宿主没有特别的限制。例如，可以使用在重组DNA领域经常使用的宿主(例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、丝状真菌、植物、动物、植物培养细胞、动物培养细胞)。可利用上述的纯化方法来纯化由这种转化体制得的本发明的多肽。如果编码本发明多肽的核酸编码一种附加了有利该多肽纯化的肽多肽，那么纯化会被极大地促迸。依据常规步骤利用与附加的肽(例如，标记组氮酸的金属螯合型树脂、谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽固定树脂)相对应的纯化方法可获得高纯度的多肽。4.使用本发明的多肽卩絲军单链RNA可M使用本发明的多肽卩絲率单链RNA来制备RNA卩絲军产物。由于本发明的多肽能以核苷酸序列特异性的方式切割RNA，因此获得的RNA糊产物的平均链长取决于多肽识别的核苷辦列的出现频率。因而，本发明提供了一种具有确定链长分布的RNAP絲产物。此外，还可能利用序列特异性来切除RNA中的特殊区域。此外，使用本发明的多肽可选择性地卩賴军单f连RNA。在本发明的一个实施方案中，可通过利用本发明的多肽P絲早蛋白合成系统(例如，无细胞翻译系统或转化体)中的mRNA来抑制蛋白合成。这时，如果编码人工制备的、不含有本发明多肽可识别的核苷酸序列的目的蛋白的mRNA存在于此系统中，贝识有可以躲过卩絲军的mRNA和目的蛋白能在该系统中生成。这个实施例尤其适用于高纯度蛋白的制备。实施例以下实施例更详细地举例说明了本发明，但并不解释为是对其范围作出柳蹄ij。在此处描述的过程中，基本过程是按照在J.Sambrook等人(eds.)，MolecularCloning:ALaboratoryManual第三版，2001，ColdSpringHarborLaboratory中所描述的进行实施的。实施例1:从耐方妇寸微球菌RJ中分离DR0662、从牛分枝杆菌BCG中分离Mb2014c同系物以及构建表达质粒可从NCBI数据库中获得来自耐方，微球菌Rl的DR0662基因和来自牛分枝杆菌BCG的Mb2014c同系物基因编码的多肽的氨基酸序列及其核苷酸序列(登记号NP—294385禾HNC—001263，禾卩NP—855664禾卩NCJX)2945)。根据DR0662核苷酸序列的相关信息合成引物DR0662-F(SEQIDNO.5)和引物DR0062-R(SEQIDNO:6)用于扩增编码整个多肽的DNA区域的PCR反应。可从ATCC(ATCCNo.13939D)获得耐放射微球菌Rl基因组DNA。使用PyrobestDNA聚合H(TakaraBio)以及50ng来自耐放射微球菌Rl的基因组DNA和引物DR0662-F和DR0662-R进行PCR，获得368-bp扩增的DNA片段。用限制内切酶Ndd和Xhol7拙科广增片段，并进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收347-bpDNA片段。对于来自牛分枝杆菌BCG的Mb2014c同系物来说，可化学合成SEQEDNO:7的365-bpdsDNA并用Ndel和Xhol消化，获得344-bp限制内切酶水解的DNA片段。将347-bpDNA片段或344-bpDNA片段连接至用限制内切酶Ndel和XhoI消化的载体pET21a(Novagen)，获得重组质粒。这些重组质粒可用来转化大肠杆菌JM109。如上所述获得的转化体克隆可制得质粒并确认核苷,列。然后，将该质粒命名为表达载体pET-DR0662和pET-Mb2014cHlgoSEQIDNO:3和1分别示出编码插入到所获得的表达载体pET-DR0662中的、来自耐方妇寸微球菌Rl的DR0662的多肽的核苷鹏列和所述多肽的氨基酸序列。SEQIDNOS:4和2分别示出编码插入到表达载体pET-Mb2014cMg中的、来自牛分枝杆菌BCG的Mb2014c同系物多肽的核苷酸序列和所述多肽的氨基酸序列。在使用表达载体pET-DR0662和pET-Mb2014cMg表达的各多肽中，SEQIDNO:1或2的氨基序列的多肽的C末端上附加了由包括六个组氮酸残基的八个氨基酸残基组成的组氨酸标记。实施例2:来自耐方妇寸微球菌Rl的DR0662多肽和来自牛分枝杆菌的Mb2014c同系物多肽的制备实施例1用获得的表达载体pET-DR0662或pET-Mb2014cMg转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)，获得用于表达的大肠杆菌、pET-DR0662/BL21(DE3)和pET-Mb2014cHg/BL21(DE3)。于37。C下在含有100u^ml氨苄青霉素的5mlLB培养基中培养pET-DR0662/BL21pE3)或pET-Mb2014cHlg/BL21pEB)。当OD600nm达到0.6时，加入IPTG(TakaraBio)使其终浓度为lmM来诱导多肽的表达。诱导开始后两小时停止培养，离心收集细胞。将细胞混悬于300W溶菌缓冲液中(50mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪唑，pH8.0)，通过超声波破碎仪(Handysonic,Tomy)使之麟。加入20)olNi-NTA琼月離(Qiagen)，通过离心法收集上层清液，并且将混合物在4。C放置30併中。用100u1的洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4、300mMNaCl、20mM咪唑，pH8.0)洗沉淀两次。洗涤后，将沉淀混悬于20ul洗脱缓冲液中(50mMNaH2PO4、300mMNaCl、250mM咪唑，pH8.0)。il31离心法收集上清液。相同的洗脱过程重复两次以上。获得含有DR0662多肽或Mb2014c同系物的多肽的样品各60"1。部分样品进行SDS-PAGE，以确认该样品含有预期大小的多肽。样品中DR0662蛋白和Mb2014c同系物蛋白的浓度分别地是大约25u1和大约6.25ng/n1。实施例3:用寡核糖核苷酸作为底物来鉴定DR0662多肽和Mb2014c同系物多肽的核苷酸序列特异性合成寡核糖核苷酸并进行切割测定，来研究实施例2获得的DR0662多肽和Mb2014c同系物多肽的核糖核酸酶活性的核苷酸序列特异性。合成SEQIDNO:8-14中的七禾中寡核糖核苷酸作为底物。用10岸上述的一种寡核糖核苷酸、2.5ng/ul实施例2获得的DR0662多肽或Mb2014c同系物多肽和10mM的Tns-HCl(pH7.5)组成的5u1反应混合物于37。C培养30分钟。反应产物进用20%变性丙烯醐安凝胶(20%丙烯醐安、7M尿素、0.5xTBE缓冲液)电泳。在用SYBRGREENII(TakaraBio)染色后，用荧光影像分析仪FMBIOIIMultiview(TakaraBio)分析荧光影像。各个寡核糖核苷酸的切割方式如表1所示。切割方式如下所示+++:完全切割；++:部分切割；+:非常少的切割；并且—完全不被P絲军。此外，根据^Th寡核糖核苷酸中是否存在切割或其切割度，M比较切割位点周围的核苷酸序列来评估序列特异性。结果如表2这些结果示出DR0662多肽优先识别序列5'-UU/CCUUU-3'(/代表切割位点)以切割RNA。此外，还显示Mb2014c同系物多肽优先识别序列5'-U/CCUU-3'以切割RNA。已有报道称MazF切割5'-N/ACA-3'(N代表任意的核糖核苷酸)(非专利文献7和8)。这表明DR0662多肽和Mb2014c同系物多肽是分别具有不同于MazF具有的核苷酸序列特异性的核糖核酸内切酶。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>识别和切割RNA中的特定序列，因此它可用于分析RNA分子；制备RNA片段；M切割细胞内RNA来控制细胞(例如抑制蛋白合成)等。序列列表SEQIDNO:5;扩增编码DR0662蛋白的DNA片段的PCR引物DR0662-F。SEQIDNO:6;扩增编码DR0662蛋白的DNA片段的PCR引物DR0662-R。SEQIDNO:7;编码Mb2014c同系物蛋白的合成DNA。SEQIDNO:8;寡核糖核苷酸MRI031。SEQIDNO:9;寡核糖核苷酸MRI019。SEQIDNO:10;寡核糖核苷酸MRI021。SEQEDNO:11;寡核糖核苷酸MRI023。SEQIDNO:12;寡核糖核苷酸MRI024。SEQIDNO:13;寡核糖核苷酸MRI025。SEQIDNO:14;寡核糖核苷酸MRI026。权利要求1.一种具有序列特异性核糖核酸内切酶活性的多肽，其具有SEQIDNO1或2所示的氨基酸序列或在上述氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。2.—种编码权利要求1的多肽的核酸。3.根据权利要求2的核酸，它具有SEQIDNO:3或4的核苷酸序列。4.一种核酸，其能与权利要求2或3的核酸在严格条件下杂交，并且编码具有序列特异性核糖核酸内切酶活性的多肽。5.—种含有权利要求2-4任一项的核酸的重组DNA。6.—种由权禾腰求5的重组DNA转化的转化体。7.—种制备权利要求1的多肽的方法，该方法包括培养权利要求6的转化体并从培养基中收集具有序列特异性RNA切割活性的多肽。8.—种制备单链RNA卩絲产物的方法，该方法包括使权利要求l的多肽作用于单链RNA。9.一种,早单链RNA的方法，该方法包括使权利要求l的多肽作用于单链RNA。全文摘要具有新的核糖核酸内切酶活性的多肽；编码该多肽的核酸；具有该核酸的重组DNA；由重组DNA转化的转化体；制备多肽的方法，包括培养转化体和从培养基中收集所述多肽的步骤；一种制备单链RNA水解液的方法，包括使所述多肽与单链RNA发生反应的步骤；以及水解单链RNA的方法。文档编号C12N15/09GK101228273SQ20068002723公开日2008年7月23日申请日期2006年7月4日优先权日2005年7月26日发明者加藤郁之进,岛田雅光,浅田起代藏,高山正范申请人:宝生物工程株式会社