专利名称：编码神经酰胺糖内切酶激活物的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码激活神经酰胺糖内切酶之多肽的DNA(神经酰胺糖内切酶适用于在糖链工程改造中对糖脂进行结构、功能及其它分析)，或编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA。本发明还涉及使用重组掺入具有插入之DNA的重组质粒、工业生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的方法。
神经酰胺糖内切酶(EC3.2.1.123)最初是从放线菌类的红球菌属菌株中分离的[The Journal of Biological Chemistry，Vol.261，PP.14278-14282(1986)]。它水解神经鞘糖脂中糖链和神经酰胺之间的糖苷键以释放完整形式的糖链和神经酰胺。已知红球菌属菌珠产生具有不同底物特异性的3种不同类型的神经酰胺糖内切酶(I，II，III)[The Journal of BiologicalChemistry.Vol.264.No.16 PP.9510-9519(1989)]。神经酰胺糖内切酶的其他已知类型包括来自水蛭的神经酰胺糖内切酶(神经酰胺聚糖酶)[Biochemical and Biophysical Researchcommunications，Vol.141，pp.346-352(1986)]。尽管这些酶在各种表面活化剂存在的条件下能有效地分散糖脂，但在缺乏表面活化剂时它们对糖脂的分解作用非常低。
另一方面，产生神经酰胺糖内切酶的红球菌属菌株产生两种蛋白质激活物(激活物I，激活物II)。它们激活具有分子特异性的神经酰胺糖内切酶，使神经酰胺糖内切酶即使在缺乏表面活性剂的条件下也能分解糖脂，同时伴随有神经酰胺糖内切酶的产生。激活物I激活神经酰胺糖内切酶I，而激活物II激活神经酰胺糖内切酶II。然而，一个已知的事实是激活物II激活神经酰胺糖内切酶II比神经酰胺糖内切酶I更有效，尽管它也激活神经酰胺糖内切酶I，且激活物II也能激活来自水蛭的神经酰胺糖内切酶(神经酰胺聚糖酶)[The Journal of Biological Chemistry。Vol.266.No.12，pp.7919-7926(1991)]。
另外，已显示分子量为69.2KDa的激活物II经用胰蛋白酶完全消化而分解为27.9K Da，同时保留其在完整状态下的活性(TheJournal of BioChemistry.Vol.110，PP.328-332(1991)]。在激活物II存在，神经酰胺糖内切酶II的最适PH向中性侧移动，从而即使在pH7.5时神经酰胺糖内切酶II也有可能分解糖脂。这些事实表明使用激活物II可以使神经酰胺糖内切酶II在生理条件(接近中性pH，缺乏表面活性剂)下在活细胞中发挥其作用，否则在该条件下该酶的作用则受到损害。换句话说，已证实使用激活物II便能够利用神经酰胺糖内切酶II来分析糖脂的细胞内功能。
然而应注意的是，神经酰胺糖内切酶II对活细胞的作用需要大量的高纯度神经酰胺糖内切酶II和神经酰胺糖内切酶激活物II。使用红球菌属生产菌株生产神经酰胺糖内切酶激活物II需要长时间培养和许多纯化步骤；获得大量高纯度的激活物II非常困难。因此，需要有一种以低成本和高纯度生产该酶的方法。
另外，由于尚不知道神经酰胺糖内切酶激活物II的氨基酸序列和基因结构，所以难以用基因工程技术生产神经酰胺糖内切酶激活物II。
因此，本发明的一个目的是提供编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA。本发明的另一目的是提供以基因工程技术生产神经酰胺糖内切酶激活物的方法。
为了实现上述目的，本发明人进行了深入的研究，努力分离出编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA，以阐明其碱基序列。结果，本发明人最终成功地分离了编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA并阐明了活性相关之基因结构的碱基序列。另外，他们成功地在导入了携带该DNA之质粒载体的生物体中表达了该DNA。基于这些事实完成了本发明。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的序列的分离的DNA。具体地说，该分离的DNA包含选自(a)至(d)组中的DNA序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的DNA序列，或其片段；(b)编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的氨基酸序列的DNA序列或其片段；(c)编码在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的氨基酸序列中缺失、加入、插入或取代一个或多个氨基酸所得之氨基酸序列的DNA序列，或其片段；(d)能够与上面(a)至(c)中的任何一个杂交的DNA序列。
在另一实施方案中，本发明涉及重组DNA，它包含本发明的分离的DNA，还涉及包含该重组DNA的载体和用该载体转化的原核或真核细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体的方法，该方法包含下列步骤(a)培养本发明的细胞；(b)从步骤(a)获得的培养物中回收具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体。
在另一实施方案中，本发明涉及具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体，它们是由本发明的方法生产或由本发明分离的DNA编码的。
在另一实施方案中，本发明涉及与本发明分离的DNA特异性地杂交的合成的寡核苷酸探针或引物。
在另一实施方案中，本发明涉及特异性地结合本发明之多肽的抗体或其片段。
本发明首先确定了与神经酰胺糖内切酶激活物活性有关的氨基酸序列和其碱基序列，从而提供了神经酰胺糖内切酶激活物的基因和以基因工程技术生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的工业上有优势的方法。
使用编码本发明神经酰胺糖内切酶激活物的DNA序列，有可能探测与本发明的序列不同但可能编码具有与本发明功能等同活性之多肽的DNA。另外，与编码本发明神经酰胺糖内切酶激活物的DNA序列相对应的氨基酸序列对于制备抗本发明的神经酰胺糖内切酶激活物的抗体也是有用的。
图1图解显示了编码神经酰胺糖内切酶激活物II的结构基因和ACTHI和ACTNH的探针序列。
图2是质粒pTAC2的构建图解。
图3是质粒pEAC001的构建图解。
图4是质粒pEAC101的构建图解。
图5是质粒pEAC002的构建图解。
图6是质粒pEAC201的构建图解。
本文提到的神经酰胺糖内切酶激活物是指在缺乏表面活性剂的条件下激活神经酰胺糖内切酶的蛋白质。
可按下述方法检测本文提到的神经酰胺糖内切酶激活物II活性该活性可按The Journal of Biological Chemistry.Vol.266，No.12，pp.7919-7926(1991)所述的方法，使用重组大肠杆菌细胞提取物测定。具体地说，在预先用0.85％NaCl调成等渗的40μl 20mmol乙酸钠缓冲液(pH5.5)中将40nmol脱唾液酸GM1、5μg牛血清白蛋白、0.3毫单位纯化的神经酰胺糖内切酶与适当量的粗提物(神经酰胺糖内切酶激活物蛋白质)混和以产生标准试验混合物。然后按The Journal of BiologicalChemictry.Vol.264，pp.9510-9519(1989)中所述的方法测定酶活性。37℃保温60分钟后，加入250μl碳酸氰溶液(pH11)以终止反应；按Park和Johnson[The Journal of BiologicalChemistry，Vol.181，pp.149-151(1949)]所述的方法估测还原活性。为进行对照实验，单独保温底物和粗提物(神经酰胺糖内切酶激活物蛋白质)或底物和神经酰胺糖内切酶。从上面的实际样品值中减去两个对照值之和。1单位神经酰胺糖内切酶激活物蛋白质定义为在上述标准实验条件下每分钟增加1μmol脱唾液酸GM1的水解所需的神经酰胺糖内切酶激活物II蛋白质量。
本说明书中所用的术语“具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽”不仅包括那些具有天然神经酰胺糖内切酶的氨基酸序列的多肽，而且还包括在能激活神经酰胺糖内切酶的前提下经过诸如氨基酸的缺失，取代，插入或加入等氨基酸序列修饰所得的其变异体。本文所用的术语“天然神经酰胺糖内切酶激活物”包括但不限于红球菌菌株产生的那些激活物。另外还包括来自其它微生物，如其它放线菌类，细菌，酵母，真菌，子囊菌类和担子菌类的激活物和那些来自植物，动物，昆虫和其它活体的激活物。
本文中所用的术语“功能等同变异体”定义如下由于在体内或纯化期间蛋白质本身的修饰等或由于编码蛋白质之基因的多态性及变异，天然存在之蛋白质可在其氨基的序列上发生氨基酸缺失，插入，增加，取代及其它变异。有一些在生理和生物活性上基本上等同于无变异蛋白质的这类多肽是人们熟知的事实。结构上不同于相应的蛋白质但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽称作功能等同变异体。
相同术语也适用于在一种蛋白质的氨基酸序列中人工导入这类变异而制成的多肽。尽管这样可获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体解释为功能等同变异体的前提是其生理活性基本上等同于原始无变异蛋白质的活性。
例如，常报道大肠杆菌中表达的蛋白质N端甲硫氨酸残基受甲硫氨酸氨基肽酶的作用而被去掉，但一些这样表达的蛋白质具有甲硫氨酸残基而其它的则没有。然而甲硫氨酸残基存在铀否在大多数情况下不影响蛋白质的活性。还已知在人白细胞介素2(IL-2)的氨基酸序列中用丝氨酸代替特定的半胱氨酸残基所得的多肽保留其IL-2活性[Science，224，1431(1984)]。
另外，在基因工程生产蛋白质中，所需的蛋白质常作为融合蛋白质表达。例如，将来自另一蛋白质的N端肽链加到所需蛋白质的N端以增加所需蛋白质的表达，或者经过向所需蛋白质的N或C端加入合适的肽链，表达该蛋白质并使用对所加肽链表现出亲和力的载体来帮助纯化所需的蛋白质。
另外，就测定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，已知每种氨基酸存在1到6个密码子。因此尽管依赖于氨基酸序列，但仍有许多编码一种氨基酸的基因。在自然界中，基因是不稳定的，常常发行核酸变异。基因的变异可能不影响所编码的氨基酸序列(沉默变异)；在这种情况下，可以说产生了编码相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使当分离了编码特定氨基酸序列的基因，伴随含有该基因之微生物的传代而产生编码相同氨基酸序列的多种基因的可能性是不可忽略的。
而且，以各种基因工程技术的方法人工产生编码相同氨基酸序列的各种基因并不困难。
例如，当用于编码所需蛋白质的天然基因的密码子在用于以基因工程技术产生蛋白质的宿主中的可利用性较低时，所表达的蛋白质量有时不够。在这种情况下，经过人工将密码子转变成在该宿主中可利用性高的另一密码子而不改变所编码的氨基酸序列，即可增强所需蛋白质的表达。当然，人工产生编码特定氨基酸序列的各种基因也是可能的。因此，这种人工产生的不同多核苷酸也包括在本发明的范围内，只要它能编码本文公开的氨基酸序列即可。
另外，由至少一种改变(如所需蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基的缺失、加入、插入或取代)所得的多肽一般具有有功能上等同于所述蛋白质的活性；编码这类多肽的基因也包括在本发明的范围内，不管它是从天然来源分离还是人工产生的。
一般来说，功能等同变异体彼此间在编码它们的基因方面通常是同源的。因此，能与本发明的基因杂交和编码具有神经酰胺糖内切酶激活物II活性之多肽的核酸分子也包括在本发明的范围内。
下文详细描述与神经酰胺糖内切酶激活物II有关的本发明之DNA的分离和测序。
首先，获得关于纯化的神经酰胺糖内切酶激活物II之部分氨基酸序列的资料。具体地说，对例如按照The Journal ofBiochemistry.Vol.110，pp.328-332(1991)中描述的方法纯化的神经酰胺糖内切酶激活物II直接进行Edman降解[The Journalof Biological Chemistry，Vol.256，pp.7990-799)(1981)]，以使用常规方法测定氨基酸序列。或者，可经过特异性的蛋白水解酶的作用部分水解所说的激活物，分离所得的肽片段，纯化并进行氨基酸测定以测定其内部部分氨基酸序列。
根据如此获得的部分氨基酸序列资料，克隆神经酰胺糖内切酶激活物II基因。为达到这一目的可使用通常使用的PCR或杂交方法。
接着，根据部分氨基酸序列资料，设计合成的寡核苷酸用作Southern杂交探针。用包括MluI、SalI PstI和BamHI在内的适合的限制性酶完全消化红球菌菌种M-777的基因组DNA并进行琼脂糖凝胶电泳分离[Chapter 6，page 3 to 20 of theMolecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al.，cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)]，并以常规方法将分离的片段转印迹到尼龙膜上[Chapter9.page 34 of the Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1989)]。
可在通常使用的条件下进行杂交。例如，在含6xSSC(将8.77gNacl和4.41g柠檬酸钠溶于1升水中制成1xSSC)、0.5％SDS、5xDanhardt′s溶液和100μg/ml鲑精子DNA的预杂交溶液中在65℃下封闭尼龙膜，分别加入32P标记的合成寡核苷酸，然后在65℃下保温过夜。将尼龙膜在含0.1％SDS的2X SSC中55℃洗涤30分钟后，进行放射自显影以检测与合成寡核苷酸探针杂交的DNA片段。提取相应于所检测带的DNA片段并从凝胶中纯化后，以常用方法将DNA片段插入到质粒载体中。有用的质粒载体包括但不限于可以从市场上买到的pUC18、pUC19、pUC119和pTV118N(都是Takara Shuzo的产品)。
然后，将由此获得的重组质粒导入宿主中以转化该宿主。有用的宿主细胞包括细菌(例如大肠杆菌)和放线菌类的原核细胞和及酵母，动物，植物等的真核细胞。
当宿主是大肠杆菌时，它可以是野生型菌株或变异菌株，只要它能被转化并表达基因即可。这一质粒导入可用常用方法实现，如在Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nd.ed.，T.Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第250页中描述的方法。
接着，选择含有所需DNA片段的转化体。为达到这一目的，可利用质粒载体的特征。例如，对于pUC19，可以在含氨苄青霉素的平板上选择氨苄青霉素抗性菌落或在含氨苄青霉素，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的平板上选择氨苄青霉素抗性白色菌落，以选择其中导入了外来基因的菌落。
接着，从上述群体中挑选携带含所述DNA片段之载体的菌落。根据载体类型适当选用菌落杂交法[Chapter 1，pages 90-104The Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et a1.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，(1989)]或噬斑杂交法[Chaptor 2，Pages 108-117，theMolecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al.，Cold Spring Hanbor Laboratory Press，(1989)]来实现这一挑选也可使用PCR方法[Chapter 14，Page 15-19，The Molecular Colning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al，Cald Sping Harbor Laboratory Press，(1989)]。
一旦选出含有所需DNA片段的载体，即可用常规方法，如双脱氧链终止法[Chapter 13，page 3-10，TheMolecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd et.，T.Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)]来测定插入该载体中之所得DNA片段的碱基序列。将如此测定的碱基序列与神经酰胺糖内切酶激活物II的N端序列、部分氨基酸序列、分子量等进行比较以了解神经酰胺糖内切酶激活物II的基因结构和全部氨基酸序列。当获得的DNA片段不含全长度神经酰胺糖内切酶激活物II基因时，则可用其他限制性酶消化红球菌菌种M-777的基因组DNA，使用上面获得的部分DNA片段作为探针经杂交等方法从消化产物中获得缺失部分，然后连接缺失部分即可获得全长度神经酰胺糖内切酶激活物II基因。
将上面获得的全部或部分神经酰胺糖内切酶激活物II基因插入到合适的质粒载体中，然后转化到宿主细胞内。将如此获得的转化体在常用条件下培养以产生具有神经酰胺糖内切酶激活物II活性的多肽。
例如，当分别用大肠杆菌和pET236[由Novagen生产]作为宿主细胞和质粒载体时，将所说的转化体在含100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(0.1％胰蛋白胨，0.05％酵母提取物，0.1％NaCl，pH7.2)中37℃培养过夜；当600nm吸光率达到大约0.5时，加入IPTG，再一次在37℃下振荡培养过夜。培养完成后，回收细胞，经超声处理等破碎细胞并离心之。按下述常规方法纯化所得的上清液以产生高度纯化的神经酰胺糖内切酶激活物II。也可能以包含体的形式产生被表达的多肽。
可经测定神经酰胺糖内切酶激活物II活性来证实基因产物的表达。例如，当重组体是大肠杆菌时，使用重组大肠杆菌提取物作为酶溶液以Journal of Biological Chemistry，Vol.266，No12，PP.7919-7929(1991)中描述的方法测定活性。具体地说，由于神经酰胺糖内切酶II需要表面活性剂(如Triton X-100)以表达其活性，所以可测定在缺乏表面活性剂的条件下因加入粗提物所引起的神经酰胺糖内切酶II活性的增加，以估测神经酰胺糖内切酶激活物II的活性。
具体地说，将40nmol脱唾液酸-GM1(由IATRON产生)、5μg牛血清白蛋白、0.3毫单位纯化的神经酰胺糖内切酶II和合适量的粗提物(神经酰胺糖内切酶激活物II蛋白质)在40μl预先用0.85％NaCl调成等渗的20mmol乙酸钠缓冲液(pH5.5)中混合，以产生标准试验混合物。然后用Journal of Biological Chemistry，Vol.264，pp 9510-9519(1989)中描述的方法测定酶活性。37℃保温60分钟后，经加入250μl碳酸氰溶液(pH11)终止反应；按Park和Johnson[The Journal of Biological Chemistry，Vol.181，pp.149-151(1949)]所述的方法估测还原活性。为进行对照实验，分别保温底物和粗提物(神经酰胺糖内切酶激活物II蛋白质)或底物和神经酰胺糖内切酶。从上述实际样品值中减去两对照值的总和。一单位神经酰胺糖内切酶激活物II蛋白质定义为在上述标准实验条件下每分钟增加1μmol的脱唾液酸GM1的水解的所用的蛋白质量。
也可使用以纯化的神经酰胺糖内切酶激活物II免疫大鼠获得的抗血清来从免疫学上证实表达。
当记录到神经酰胺糖内切酶激活物II的所需表达时，选定神经酰胺糖内切酶激活物II表达的最适条件。
可用常规方法从转化体培养物中纯化神经酰胺糖内切酶激活物II。亦即，离心收集转化细胞，经超声处理或类似方法破碎细胞，然后经离心等产生无细胞提取物，并可用常规蛋白质纯化方法，如盐析和包括离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用及亲和层折在内的多种层析法纯化之。依据所使用的宿主-载体系统的不同，。表达产物可由转化体向细胞外分泌出来；在这种情况下，可从培养物上清中以上面所述相同的方式纯化产物。当宿主是大肠杆菌时，表达产物有时以不溶性包含体的形式生成。在这种情况下，可在培养后离心收集细胞，经超声处理或类似方法破碎细胞，然后进行离心等以分离含有包含体的不溶性部分。洗涤后，用常用的蛋白质溶剂，如尿素或盐酸胍裂解包含体，再用各种层析法，如离子交换，凝胶过滤、疏水相互作用和亲和层析纯化之，如有必要，此后可经透析或稀释进行重折叠处理以产生保留其活性的神经酰胺糖内切酶激活物II的制品。这种制品可用各种层析法纯化，以产生高纯度的神经酰胺糖内切酶激活物II制品。
使用本发明的神经酰胺糖内切酶激活物基因，可从不同于上述基因来源的DNA或cDNA以杂交方法获得编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之所需多肽或其功能等同变异体的基因。为以杂交法获得编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的所需基因，例如可使用下述方法。
首先，将从所需基因来源获得的染色体DNA或借助逆转录酶从mRNA制备的cDNA连接到质粒或噬菌体载体上，并导入宿主以便用常规方法产生文库。然后在平板上培养文库；将所得菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素或尼龙膜上并进行变性处理以便将DNA固定在膜上。在含有用32P或类似物标记之探针(所用的探针可以是编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中所示氨基酸序列的任何基因或其部分；例如，可使用SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中所示的基因或其部分)的溶液中保温该膜，以使膜上的DNA与探针之间形成杂交体。例如，使其上固定有DNA的膜在含6X SSC、1％十二烷基磺酸钠、100μg/ml鲑精子DNA和5X Denhardt′s溶液(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)的溶液中65℃与探针杂交20小时。杂交后，洗掉非特异性吸附部分，然后经放射自显影等方法鉴定与探针形成杂交体的克隆。重复这一程序直到只有单个克隆形成杂交体。如此获得的克隆带有插入其中的编码所需蛋白质的基因。
然后例如按下述方法测定获得的基因的碱基序列，以证实所得的基因是否与编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的所需基因相同。
当重组体是大肠杆菌时，经过在试管或类似容器中培养大肠杆菌，以常规方法提取质粒、用限制性酶消化提取的质粒、分离插入序列并将其亚克隆到M13噬菌体载体或类似载体中，并以双脱氧法测定碱基序列来实现对杂交获得的克隆的碱基测序。当重组体是噬菌体时，使用与上面所用者基本相同的程序测定碱基序列。从培养到碱基测序的基本实验技术可参见Molecular Cloning，A Laboratory Manual，T.Maniatis et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1982)。
为了证实获得的基因与编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的所需基因的相同性，将测定的碱基序列与本发明的神经酰胺糖内切酶激活物基因的碱基序列和序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的编序列相比较。
如果所得的基因不含编码具有神经酰胺内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的全部区域，可从所获得的基因制备合成的DNA引物，并经PCR扩增缺失区域或使用获得的基因片段作为探针筛选DNA文库或cDNA文库来测定与本发明的神经酰胺糖内切酶激活物基因杂交的，编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体全部区域的碱基序列。
具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体可经过如下的基因工程技术获得首先，用常规方法将获得的神经酰胺糖内切酶激活物基因或编码具有功能上同等活性之多肽的另一基因连接到能在合适的宿主细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母、动物细胞，昆虫细胞或植物细胞中表达该基因的表达载体中，然后导入宿主细胞以产生重组体。经过培养该重组体，可产生具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽。另外，可使用无糖链生物合成能力的细胞作为宿主，例如原核生物，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。或使用已失去其糖链生物合成能力的变异的酵母、动物、昆虫或植物细胞来表达无糖链的神经酰胺糖内切酶激活物多肽。
在某些表达系统中，所获得的神经酰胺糖内切酶激活物基因或编码神经酰胺糖内切酶激活物之功能等同变异体的基因包括编码细胞分泌的信号肽区域，导致所需的多肽在培养基中的细胞外分泌和积聚。在这种情况下，可从培养基中回收所需的多肽。当所需的多肽积聚在重组体中时，可破碎细胞以从培养的细胞中回收之。另外，当表达的多肽在重组体中以不溶物(包含体)的形式积累时，可回收该不溶物，然后在温和条件下(例如用尿素)溶解之，然后去掉变性剂以恢复其原始活性。可按上述方法测定神经酰胺糖内切酶激活物活性来证实表达。
可用常规层析技术从重组体中纯化具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽。例如，当所需多肽从重组体细胞外分泌时，可对培养物上清液进行层析，如疏水相互作用、离子交换、或凝胶过滤层析以获得表达的所需多肽。当所需多肽在重组体中积聚时，可破碎培养的细胞。如果所需多肽以溶解形式存在，可对上清液进行层析(如疏水相互作用、离子交换或凝胶过滤层析)以获得所需的被表达的多肽。当表达产物作为不溶性物质积聚时，可破碎细胞，然后回收沉淀物并用变性剂(如尿素)溶解之。然后去掉变性剂，并按上述方法使之重新折叠并进行层析处理以得到具有所需活性的多肽。
本发明提供了神经酰胺糖内切酶激活物的一级结构及其基因结构。本发明实现的对基因结构的阐明允许以基因工程技术生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽。本方法使用基因工程技术可以低花费生产高纯度的具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽制品。
实施例下述实施例是为了解释本发明而不是以任何方式限制本发明。实施例1.神经酰胺糖内切酶激活物II结构基因的克隆(1)基因组DNA的提取和纯化将红球菌种M-777(一种神经酰胺糖内切酶激活物II生产菌)接种到30ml含1.5％真菌胨(由0XOID生产)、0.2％NaCl和0.1％酵母提取物的培养基(pH7.0)中并在28℃下振动培养3天。将培养物转移到900ml相同培养基中并在28℃下振动培养3天。培养完成后，离心培养液，收集细胞并悬浮于4.5ml缓冲液(50mM Tris-HCl，50mMEDTA，pH8.0)中，然后冷冻并融解。向该细胞悬液中加入2.5ml含4mg/ml溶菌酶的缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM EDTA，pH8.0)，然后于30℃下培养16小时。向该混合物中加入10ml提取缓冲液(50mM Tris-HCl，1％SDS，0.4mg/ml蛋白酶K，pH7.5)，并在50℃下保温16小时，然后加入10ml另一提取缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5％SDS，0.2mg/ml蛋白酶K，pH7.5)，并保温8小时。将保温混合物冷却到室温后，加入等体积的预先用TE缓冲液(10mM Trir-HCl，1mM EDTA，pH8.0)饱和的酚/氯仿溶液，轻微旋转振荡16小时，然后在3.500rpm下离心30分钟，接着回收上清液。将该溶液在缓冲液(10mM Tmis-HCl，5mM EDTA，pH8.0)中4℃透析以产生基因组DNA溶液。(2)神经酰胺糖内切酶激活物II的部分氨基酸测序首先按The Journal of Biochemistry，Vol.110，pp.328-332(1991)中描述的方法纯化神经酰胺糖内切酶激活物II的27.9KDa胰酶消化产物。然后用Edman降解法测定纯化之27.9KDa神经酰胺糖内切酶激活物II胰酶消化产物的N端序列。结果测定了N端氨基酸序列(SEQ ID NO5)并命名为ACTN。
然后按下述方法测定其内部氨基酸序列向含4μl吡啶，1μl 4-乙烯基吡啶，1μl三丁基膦和5μl蒸馏水的试管中插入一个装纯化样品的较小的样品试管；将外面的试管真空密封。然后在100℃下加热5分钟使样品中的半脱氨酸残基在气相条件下吡啶乙基化。
将1nmol由此得到的S-吡啶乙基化的样品溶于50μl含4M尿素的20mM Tris缓冲液(pH9.0)中；加入8pmol赖氨酰内肽酶(由Pierce生产)，接着在37℃下消化16小时。然后以含0.065％三氟乙酸(TFA)的蒸馏水到含0.05％TFA的乙腈的密度梯度，使用SMART系统(由Pharmacia生产)通过μRPC C2/C18 SC2.1/10柱(由Pharmacia生产)反相层析纯化该肽片段。使用477型气相肽测序仪(由Applied Biosystems生产)以Edman降解法分析如此纯化的肽片段。结果测定了内部氨基酸序列(SEQ ID NO6)并命名为ACTI。(3)含神经酰胺糖内切酶激活物II基因之DNA片段的克隆将25μg在实施例1(1)中制备的基因组DNA用各100U限制性酶BamHI，PstI和SalI(均由Takara Shuzo生产)在37℃下消化6小时；再加入100U的各酶后，继续反应16小时。对相当于5μg DNA量的反应混合物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，然后以Southern印迹法(Idenshi Kenkyuhou II，pp.218-221，published by TokyoDagaku Dojin)将DNA转移到尼龙膜(Hybond-N+，由Amersham生产)上。该滤膜以一式两份提供。
使用的杂交探针是根据实施例1(2)测定之N端氨基酸序列ACTN(SEQ ID NO5)和内部氨基酸序列ACTI(SEQ ID NO6)设计和合成的寡核苷酸ACTNH(SEQ ID NO7)及ACTIH(SEQ ID NO8)。这些寡核苷酸序列是根据对编码红球菌属各种蛋白质之已知碱基序列测定结果，在宿主中有可利用性高的密码子设计的。
使用MEGARABELTM(由Takara Shuzo生产)，用32P标记这些合成的寡核苷酸各10pmol。
将上面制备的每对滤膜在含6XSSC(1XSSC是将8.77g NaCl和4.41g柠檬酸钠溶于1升水中的水溶液)、0.5％SDS、100μg/ml鲱鱼精子DNA和5X Danharlt′S(含牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)的溶液中65℃预杂交3小时，然后以0.5pmol/ml的浓度加入各标记的探针，并在55℃下杂交过夜。然后将各滤膜在6XSSC中室温下洗涤10分钟，在2XSSC和0.1％SDS中室温洗涤10分钟，并在0.2XSSC和0.1％SDS中55℃洗涤30分钟，随后去掉多余的水；将每片滤膜暴露于影象板(由Fuji Photo Film生产)上3小时，并使用BAS2000影象分析仪(由Fuji Photo Film生产)检测影象。
结果，与寡核苷酸ACTNH杂交的带出现在相当于BamHI消化产物之大约10kbp，PstI消化物之大约2.3kbp、SalI消化物之大约450bp的位置。另外，与寡核苷酸ACTIH杂交的带出现相当于BamHI消化物之大约10kbp，PstI消化物之大约2.3kbp和SalI消化物之大约1kbp的位置。在随后的实验中使用PstI消化产物，因为它易于处理。
对20μg用限制性酶PstI消化的基因组DNA进行0.7％琼脂糖凝胶电泳；切下与出现于上述杂交中的带相对应的部分并使用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo生产)提取和纯化之；将所得的DNA片段插入pUC19(由Takara Shuzo)生产)的PstI位点中。
用该质粒转化大肠杆菌JM109，然后在5个直径为8.5cm的圆培养皿上培养，直到每个培养皿形成200到1000个菌落。从这些平皿上选择300个菌落并转移到放在平板培养基上的尼龙膜(Hybond-N+，由Amersham生产)上。37℃培养3小时后，将尼龙膜在浸入含0.5M NaOH和1.5M NaCl之溶液的滤纸上放置5分钟(变性)，并在浸入含0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaCl之溶液的滤纸上放置5分钟(中和)，接着用2XSSC漂洗。使用该尼龙膜和作为探针的寡核苷酸ACTNH(SEQ ID NO7)，在上述相同条件下进行杂交；获得3个阳性菌落。
这些大肠杆菌JM109转化体分别被命名为P23、P54和P62。对这些转化体进行碱溶菌以制备其携带所得克隆的质粒DNA，它们分别被命名为pACTP23，pACTP54和pACTP62。经用几种限制性酶消化和凝胶电泳分析这些质粒，结果发现这些质粒具有相同的插入序列。基于这一发现，将pACTP54用于下面的实验。
用限制性酶SalI消化pACTP54得到大约1kbp的片段、大约450bp的片段，大约300bp的片段和大约150bp的片段，它们分别被命名为S1，S2，S3和S4。对这此片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后从凝胶中提取和纯化之，并亚克隆到pUC19(由Takara Shuzo生产)的SalI位点中；所得的质粒分别被命名为pACTS1，pACTS2，pACTS3和pACTS4。用合适的限制性酶(SmaI，BalI，NaeI等)进一步消化这些质粒并使用DNA连接试剂盒(由TaKara Shuzo生产)进行自身连接以获得各种缺失变异体。以双脱氧法从其末端测定这些缺失变异体和pACTP54的碱基序列。
结果显示，编码N端氨基酸序列ACTN的序列，即与ACTNH(用作探针的寡核苷酸)杂交的序列存在于pACTS2上，编码内部氨基酸序列ACTI的序列，即与ACTIH(用作探针的寡核苷酸)杂交的序列存在于pACTS1上，并显示4个SalI片段在pACTP54上以S3，S2，S1和S4的顺序排列(图1)。
这些碱基序列翻译成氨基酸序列证明神经酰胺糖内切酶激活物II氨基酸序列上游存在信号样序列，从而得以推导起始密码子。在该阅读框下游未发现终止密码子；发现这些序列编码纯化之27.9KDa神经酰胺糖内切酶激活物II胰酶消化产物的N端开始的417个氨基酸残基(SEQ ID NO9)。这417个残基的氨基酸序列相等于分子量为42KDa。编码这417个残基氨基酸序列的碱基序列示于序列表的SEQ ID NO10中。因此证明pACTP54含有编码神经酰胶糖内切酶激活物II之N端部分的序列，它包括神经酰胺糖内切酶激活物II的27.9KDa部分，即其活性所需的最小基本单位。(4)克隆含有编码神经酰胺糖内切酶激活物IIN端区域之基因的DNA片段为了覆盖神经酰胺糖内切酶激活物II基因的全长，按实施例1(3)所述相同方式，以Southern杂交法筛选编码靠近c端区域(PACTP54缺乏的区域)的DNA片段。使用的探针是用SmaI/PstI消化pACTP54获得的大约0.4kbp片段，它含有在实施例(3)获得的序列中最靠近C端的DNA序列。具体地说，用限制性酶SmaI和PstI(两者都由Takara Shuzo生产)消化pACTP54并进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下所得的大约0.4kbp DNA片段。
使用SpinBindTMSeries II(由Takara Shuzo生产)提取和纯化该DNA片段；使用BcaBESTTM标记试剂盒(由Takara Shuzo生产)以32P标记所得的纯化之DNA片段。50μg实施例1(1)中制备的基因组DNA用各180U限制性酶MluI，SacII，ApaI和Eco52I(都由Takara Shuzo生产)在37℃下消化6小时。从这一反应混合物中以相当于10μg DNA的量按实施例1(3)所述相同方式制备滤膜。每1个滤膜在含6XSSC(1XSSC是8.77g NaCl和4.41g柠檬酸钠溶于1升水中的水溶液)、0.5％SDS、100μg/ml鲱鱼精子DNA和5XDenharlt′s(含浓度各为0.1％的牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll)的溶液中68℃下预杂交3小时，随后各以0.1pmol/ml的浓度加入标记的探针，并在68℃下杂交过夜。
然后将每片滤膜在6XSSC中室温下洗涤10分钟，在2XSSC和0.1％SDS中室温下洗涤10分钟，并在0.2XSSC和0.1％SDS中70℃下洗涤30分钟。去掉多余的水；将每片滤膜暴露于影象板(由FujiPhotoFilm生产)10分钟并使用BAS2000影象分析仪(由FujiPhoto Film生产)检测影象。
结果，与探针杂交的带出现在相当于MluI消化产物之大约4Kbp，SacII消化产物之大约1.3kbp，ApaI消化产物之大约1kbp，Eco52I消化产物之大约0.6kbp的位置。从其大小判断，认定Eco52I消化产物未能完全覆盖靠近pACTPA54缺失的C端区域。鉴于这一发现，将限制性酶MluI，SacII和ApaI消化产物用于下面的实验。
对20μg用限制性酶MluI，SacII或ApaI消化的基因组DNA进行0.7％琼脂糖凝胶电泳；切下与上述杂交中检测的带相对应的部分并使用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo生产)进行提取和纯化；将所得的MluI片段插入pUC 19M[通过将磷酸化的MluI接头(由TakaraShuzo生产)插入并连接到用限制性酶HincII(由Takara Shuzo生产)消化的pUC19(由Takara Shuzo生产)上为pUC19提供一个MluI位点而制得的质粒]的MluI位点；将SacII片段插入pBluescriptIISK(-)(由Stratagene生产)的SacII位点；并将ApaI片段插入pBluescript IISK(-)的ApaI位点。
用这些质粒转化大肠杆菌HB101，其后在加有含100μg/ml氨苄青霉素之L-琼脂培养基的直径为8.5cm的10个圆培养皿中培养过夜，直到每个培养皿形成200到500个菌落。从这些培养皿中选出1,000个菌落并转移到置于有相同培养基之平板上的尼龙膜(Hybond-N+，由Amersham生产)上。37℃培养10小时后，将尼龙膜在浸于含0.5MNaOH和1.5M NaCl之溶液的滤纸上放置5分钟(变性)并在浸于含0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaCl之溶液中的滤纸上放置5分钟(中和)，然后用2XSSC漂洗。使用该尼龙膜和以上述相同的方式用SmaI/pstI消化pACTP54制得的约0.4kbp DNA片段，在上述条件下进行杂交。从含ApaI片段的菌落中获得了2个阳性信号，但从含MluI或SaclI片段的菌落中获得阳性信号。
以碱溶菌法从两个阳性菌落中制备质粒DNA，分别命名为pBAp42和pBAp69。用某些限制性酶(ApaI，PstI，Sal I.Eco52I，BamHI，KpnI，SacI，Eco109I，NaeI，XhoI，SacII，MluI，EcoRI，和HindIII)消化这些DNA并进行凝胶电泳分析。结果，发现pBAp42和pBAp69具有相同的插入片段。鉴于这一发现，将pBAp42用于下面的实验。
以双脱氧法从其末端测定这些亚克隆和pBAp42的碱基序列，随后使用根据测定的碱基序列合成的合成DNA引物进行氨基酸测序。结果，发现其序列与用SmaI/PstI消化pACTP54获得的约0.4Kbp片段相同。
另外，在跨越pACTP54插入片段中之PstI片段和pBAp42插入片段中之ApaI片段之间的区域内发现一个1,740bp的开架阅读框(ORF)，并在实施例1(3)中测定了其序列。发现该ORF从起始密码子ATG开始并在终止密码子TGA处终止；在翻译的氨基酸序列中发现一个对应于实施例1(2)获得之氨基酸序列ACTN和ACTI的氨基酸序列。
根据上面结果，确定了神经酰胺糖内切酶激活物II基因的全部碱基序列和一级结构。结果在图1中给出，其中显示了pACTP54和pBAp42插入片段的限制性酶切图及这些插入片段和神经酰胺糖内切酶激活物II基因的位置。
神经酰胺糖内切酶激活物II之ORF的碱基序列示于序列表的SEQ ID NO2。神经酰胺糖内切激活物II的全部氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO1中。实施例2.用于表达神经酰胺糖内切酶激活物II之质粒的构建从实施例1获得的pACTP54和pBAp42分离神经酰胺糖内切酶II结构基因(其中结构基因片段单独存在)，将该基因连接到适于其在大肠杆菌中表达的质粒上并将其导入大肠杆菌细胞中来构建在大肠杆菌中表达神经酰胺糖内切酶激活物II的质粒。(1)表达神经酰胺糖内切酶激活物II之N端区域活性多肽的质粒的构建用限制性酶SacII消化实施例1中制得的pACTP54并进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo生产)提取和纯化大约670bp的片段。使用DNA钝端化试剂盒(由Takara Shuzo生产)将其末端修成平头后，用限制性酶MluI进一步消化该片段并进行琼脂糖凝胶电泳，然后提取并纯化一个约450bp的DNA片段以产生SacII-MluI片段。
再用限制性酶EcoRI和MluI消化pACTP54并进行琼脂糖凝胶电脉，经提取和纯化以产生一个约820bp MluI-EcoRI片段。
使用DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo生产)将这两个片段插入pTV119N(由Takara Shuzo生产)的HincII-EcoRI位点。所得的质粒(命名为pTAC1)用限制性酶XbaI消化，然后将其末端修成平头，并插入一个终止接头(SEQ ID NO11)。将所得质粒命名为pTAC2(图2)。
由于该pTAC2在编码神经酰胺糖内切酶激活物II的基因上游含有包括lac Za衍生肽的编码13个氨基酸残基的序列，所以可望使用SD序列和lacZ的起始密码子，诱导以与LacZa之融合复合物的形式表达神经酰胺糖内切酶激活物II。将该pTAC2导入大肠杆菌JM109菌株；使用碱溶菌法从所得的重组体制备质粒DNA后，鉴定插入序列的碱基序列。将掺入了pTAC2的大肠杆菌JM109称作大肠杆菌JM109/pTAC2。
用限制性酶HindIII和BamHI消化pTAC1，然后将其末端修成平头并进行琼脂糖凝胶电泳，并提取和纯化大约1.3kbp的DNA片段。在pET23b(由Novagen生产)的HincII位点和修成平头的NotI位点之间插入该纯化的片段。这一质粒被命名为pEAC001(图3)。
由于这一pEAC001在编码神经酰胺糖内切酶激活物II之基因上游含有T7·TaqTM序列(编码噬菌体T7基因10蛋白质的前11个残基的氨基酸序列，由Novagen生产)和编码来自神经酰胺糖内切酶激活物II基因下游克隆位点14个氨基酸残基的序列，连同His·TaqTM序列(编码6个组氨酸残基序列，由Novagen生产)，所以可预期连同以成熟神经酰胺糖内切酶激活物II之N端417残基与上述蛋白质的融合复合物的形式诱导表达神经酰胺糖内切酶激活物II。将该质粒导入大肠杆菌JM109菌株，用碱溶菌法从所得的重组体制备质粒DNA，然后鉴定该插入序列的碱基序列。将证明已正确构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。掺入pEAC001的大肠杆菌BL21(DE3)称为大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001。
用限制性酶BamHI和SphI消化pEAC001，然后将其末端修成平头并使之自身连接。所得的质粒被命名为pEAC101。
预期该质粒可诱导地表达作为融合复合物的神经酰胺内切酶激活物II，所说的复合物具有比pEACOOI短9个衍生于克隆位点的序列中编码的氨基酸序列的融合蛋白质部分。将该质粒导入大肠杆菌JM109菌株中；用碱溶菌法从所得的重组体制备质粒DNA，然后鉴定插入序列的碱基序列。将证实已正确构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。掺入了pEAC101的大肠杆菌BL21(DE3)被称为大肠杆菌BL21(DE31/pEAC101[以保藏号FERM BP-5531保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agent of Industrial Science and Technology；该菌株首先以大肠杆菌BL2(DE3)/pEAC101的名称进行了保藏(登记证明)，但在1995年6月15日发行的微生物保藏证书中将该错误的命名更正如上]。
用限制性酶XhoI消化pEAC001，将其末端修成平头，用SmaI消化并自身连接以产生缺失编码143残基的序列和保留编码pEAC001成熟神经酰胺糖内切酶激活物II之274个N端残基序列的质粒。所得的质粒被命名为pEAC002(图5)。将这一质粒导入大肠杆菌JM109菌株；以碱溶菌法制备质粒DNA，然后鉴定插入序列的碱基序列。将已证明正确构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。掺入了pEAC002的大肠杆菌BL21(DE3)被称为大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC002。(2)用于表达无信号序列之神经酰胺糖内切酶激活物II多肽的质粒的构建用限制性酶ApaI消化pBAp42并进行琼脂糖凝胶电泳，然后从凝胶中提取和纯化以产生大约1,000bp的BAp42-ApaI片段。用限制性酶XhoI消化实施例2获得的pEAC101，接着使用DNA修平头试剂盒(由Takara Shuzo生产)将其末端修成平头；向该片段中插入并连接一磷酸化的ApaI接头(由Takara Shuzo生产)以提供含有ApaI位点的pEAC101。用限制性酶ApaI消化该质粒并用来自大肠杆菌的碱性磷酸酶脱磷酸化，然后连接BAp42-ApaI片段以产生pEAC201(图6)。
将该质粒导入大肠杆菌JM109菌株；以碱溶菌法从所得的重组体制备质粒DNA，然后鉴定插入片段的碱基序列。将已证明正确构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。含有pEAC201的大肠杆菌BL21(DE3)被定名为大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201。实施例3.重组神经酰胺糖内切酶激活物II在大肠杆菌中的表达(1)具有神经酰胺糖内切酶激活物II活性之多肽在大肠杆菌中的表达将实施例2获得的大肠杆菌JM109/pTAC2、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC002和大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201分别接种到5ml含100μl/ml氨苄青霉素的L培养基中并在37℃下振荡培养过夜；进一步将0.2％的培养液接种到5ml相同培养基中。在培养期间当浓度(660nm吸光率)达到大约0.5时，加入IPIG至终浓度为1mM，然后振荡培养16小时。完成培养后，离心培养液，收集细胞，悬浮于0.5ml 20mMTris-HCl缓冲液(pH7.9)中，经超声处理破碎细胞，离心分成两个部分作为上清液的大肠杆菌细胞提取物和沉淀。对提取物和沉淀进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色。
结果，对于大肠杆菌JM109/pTAC2检测不到神经酰胺糖内切酶激活物II，另一方面，在大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101和大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201的提取物和沉淀中，以及大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC002的沉淀中则检测到由神经酰胺糖内切酶激活物II形成的带；由此证实了神经酰胺糖内切酶激活物II的表达。大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001在可溶性部分中产生高浓度的神经酰胺糖内切酶激活物II。另外，大肠杆菌BL2(DE3)/pEAC201表达产物提供的带的位置几乎与红球菌菌种M-777产生之天然神经酰胺糖内切酶激活物II的带位置相同。
接着，按Journal of Biochemistry，Vol.110.pp.328-332(1991)中描述的方法用胰蛋白酶消化大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101和大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201的细胞提取物。对各消化产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转印迹到PVDF膜上。使用以27.9KDa的来自红球菌菌种M-777的纯化之神经酰胺糖内切酶激活物II的胰蛋白酶消化产物免疫大鼠获得的抗血清对该膜进行特异性免疫染色。结果，检测到由神经酰胺糖内切酶激活物的胰酶消化产物形成的大约28KDa的带。
这一事实表明，由大肠杆菌BL21(DE3)p/EAC001、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101和大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201产生的神经酰胺糖内切酶激活物II作为天然和非天然空间结构的混合物出现在其可溶性部分中。(2)可溶性表达产物的纯化将大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101接种到5ml含100μg/ml氨苄青霉素的L培养基中，37℃振荡培养16小时；进一步将0.6ml培养液接种到300ml相同的培养基中，并在37℃下振荡培养。当培养液浓度(660nm吸光率)达到大约0.5时，加入IPTG至终浓度为1mM，然后在37℃下振荡培养过夜。
完成培养后，经离心收集细胞，悬浮于10ml 20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)中，经超声处理破碎细胞，从沉淀中离心分离上清液。向上清液中加入10ml含10mM咪唑和1M NaCl的40mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)以产生样品溶液。
对该样品溶液进行亲和层析以纯化可溶部分的表达产物。具体地说，将预先固相化的Ni2+的His·Bind金属螯合树脂(由Novagen生产)柱用含5mM咪唑和0.5M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)平衡。向该柱上加入样品溶液后，用含60mM咪唑和0.5MNaCl的20mm Tris-HCl缓冲液(pH7.9)洗该柱，然后用含1M咪唑和0.5M NaCl的20mm Tris-HCl缓冲液(pH7.9)洗脱，以得到10ml纯化的可溶性表达产物。(3)重组27.9KDa神经酰胺糖内切酶激活物II的重新折叠和生产在搅拌条件下将10毫升实施例3(2)中获得的大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101的纯化的可溶性表达产物逐滴加入990ml 20mMTris-HCl缓冲液(pH7.9)中；将所得的稀释液在5℃下搅拌4天以实现重新折叠。
将该溶液加至His·Bind金属螯合树脂柱上，按上述相同方式洗涤和洗脱以实现浓缩。使用Hi-Trap脱盐柱(由Pharmacia生产)，用含2mm CaCl2的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)取代用于该洗脱的缓冲液。用2mg胰蛋白酶37℃消化4小时后，加入另外2mg胰蛋白酶，接着在37℃下消化16小时以实现向27.9KDa神经酰胺糖内切酶激活物II的转变。使该消化产物通过预先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)平衡的阴离子交换树脂Q套筒(由Bio-Rad生产)并进一步通过亲和柱ProtrapTM(由Takara Shuzo生产)以去掉胰蛋白酶，经超滤后获得45μl浓缩物。
经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析揭示了相当于分子量约28,000的单一带。使用BCATM蛋白质检测试剂(由Pierce生产)进行定量测定，表明蛋白质含量为11μg/μl(转变为牛血清白蛋白)。
按Journal of Biochemistry.Vol.110，pp.328-332(1991)中描述的方法测定神经酰胺糖内切酶II激活活性；结果证实了神经酰胺糖内切酶II激活活性。换句话说，证实了大约1.7mg重组的27.9KDa神经酰胺糖内切酶激活物II是从1升含有本发明之基因的大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101的培养液中获得的。该27.9KDa的神经酰胺糖内切酶激活物II的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO3中，其碱基序列在序列表的SEQ ID NO4中给出。
对本领域技术人员而言，对本发明上述实施方案的其它修改显然包括在下文权利要求书限定的范围内。
序列表(1)一般资料(iii)序列表11(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度580氨基酸(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)拓朴学(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Ser Ser Lys Leu Tyr Arg Tyr Leu Ala Pro Val Ala Val Gly1 5 10 15Ala Thr Val Val Ala Gly Ala Gly Val Leu Gly Val Gly Ala Ala20 25 30Ser Ala Ala Thr Thr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Cys Gln Ala35 40 45Thr Pro Ser Ser Ser Leu Ala Gly Gly Pro Gln Thr Gln Val Gln50 55 60Ala Ala Ser Val Thr Val Asp Ale Pro Glu Thr Val Ala Pro Gly65 70 75Glu Glu Phe Val Val Thr Ile Ser Pro Pro Pro Ile Ser Vel Pro80 85 90Asn Asp Leu Gly Ser Gly Ala Ser Leu Ser Asn Ile Ser Arg Leu95 100 105Lys Ile Asp Val Ala Met Pro Glu Asn Ala Gln Phe Ile Gly Ala110 115 120Glu Val Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ala Pro125 130 135Asn Val Ile Val Val Asn Glu Ser Gly Ser Pro Asp Ala Asn Gly140 145 150Ser Ile Ile Arg Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Ile Gly Asn Gly155 160 165Pro Lys Ser Ser Lys Ser Ser Glu Gly Gly Ile Lys Ala Asn Ala170 175 180Sar Gly Sar Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Gln Val Lys Ala Thr185 190 195Leu Lys Ala Gly Ala Ala Gly Glu Ile Ser Met Lys Leu Arg Thr200 205 210Ala Gly Asn Ala Gly Gln Phe Gly Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr215 220 225Phe Leu Pro Arg Ala Ser Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Trp Ala230 235 240Pro Thr Gln Cys Ser Pro Arg Asp Thr Ala Ala Gly Pro Leu Asn245 250 255Ala Gly Ala Gly Pro Leu Ala Thr Ile Gln Ile Leu Arg Gln Ala260 265 270Val Ala Thr Val Ser Tyr Leu Asp Gly Pro Ser Ala Val Thr Asn275 280 285Gly Gly Glu Phe Thr Leu Asn Ala Thr Val Val Pro Thr Pro Asp290 295 300Ser Gly Gln Val Gln Phe Thr Arg Asp Gly Glu Asp Val Gly Ala305 310 315Pro Val Asp Leu Val Asn Gly Lys Ala Ser Leu Thr Gln Ser Leu320 325 330Asp Thr Asp Gly Asp Tyr Ala Tyr Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ala335 340 345Glu Phe Phe Asn Pro Ser Ser Ala Ala Lys Thr Val Thr Val Thr350 355 360Ser Gln Asp Ile Gln Thr Thr Thr Ser Val Thr Gly Pro Asp His365 370 375Asp Ala Tyr Arg Asp Gln Pro Val Asn Leu Thr Ala Lys Val Glu380 385 390Pro Gly Val Ser Gly Gly Thr Val Ala Phe Glu Val Asp Gly Thr395 400 405Pro Val Gly Thr Ala Asp Val Met Asp Asp Gly Ala Ala Val Leu410 415 420Pro His Thr Phe Thr Thr Asn Gly Thr His Arg Val Ile Ala Arg425 430 435Tyr Ser Gly Ala Glu Gly Ile Ser Pro Ser Val Ser Leu Gln Tyr440 445 450Pro Val Ser Val Thr Glu Ala Pro Ala Ala Asp Val Ala Thr Thr455 460 465Ile Thr Val Asp Pro Ile Ala Ser Thr Ala Lys Gly Ser Pro Val470 475 480Thr Leu Thr Ala Arg Leu Asp Pro Ala Asp Ala Arg Gly Thr Val485 490 495Gln Phe Lys Leu Gly Asp Val Leu Leu Gly Gly Pro Val Arg Val500 505 510Asp Ala Asn Gly Val Ala Thr Leu Thr Thr Phe Phe Gln Asn Pro515 520 525Gly Glu Phe Val Val Thr Ala Gln Phe Thr Ala Asp Ala Gly Phe530 535 540Ile Asp Ser Ala Ala Ser Pro Val Asn Leu Thr Val Thr Gly Asp545 550 555Pro Asp Thr Ile Pro Asn Pro Glu Gly Gly Gly Ser Leu Ala Gly560 565 570Leu Ser Gly Leu Phe Gly Ser Leu Gly Gly575 580(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度1740碱基对(B)类型核酸(C)链数双链(D)拓朴学线型(ii)分子类型基因组DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2ATGAGTTCCA AGCTGTACCG CTACCTCGCG CCGGTCGCCG TGGGCGCGAC GGTGGTCGCC60GGTGCCGGAG TTCTGGGTGT GGGGGCCGCT TCCGCGGCGA CGACGATCAC GCCGTTCAAC 120AACGCATGTC AGGCGACGCC GTCGTCGAGC CTGGCCGGTG GGCCACAGAC TCAGGTGCAG 180GCGGCGTCGG TGACGGTCGA CGCACCGGAG ACCGTCGCTC CCGGTGAGGA GTTCGTGGTG 240ACGATCTCGC CGCCGCCGAT CTCGGTGCCC AACGATCTGG GTTCCGGCGC GAGCCTGTCG 300AACATCTCGC GGCTCAAGAT CGACGTCGCG ATGCCGGAGA ACGCGCAGTT CATCGGCGCC 360GAGGTGGTGG CCGGAACGTC AGCGGGCATC ACGGGTGTCG CGCCCAACGT CATCGTCGTC 420AACGAGAGTG GTAGTCCGGA CGCGAACGGC TCGATCATCC GGCTGTCCGG AAACAACGAG 480ACGATCGGCA ACGGACCGAA GTCCTCGAAG AGTTCCGAGG GCGGTATCAA GGCGAACGCG 540TCGGGCAGCA CCACGTCCTT CCAGTTGCCG CAGGTCAAGG CCACCCTCAA GGCGGGCGCG 600GCCGGCGAGA TCTCGATGAA GCTGCGCACC GCAGGAAACG CCGGGCAGTT CGGCAACGAC 660GCGAACTTCC TCACGTTCCT GCCCCGCGCC AGCGCACCGA TCGTCGGCAC GGTCTGGGCC 720CCCACCCAGT GCTCGCCGCG TGACACCGCG GCCGGCCCGC TCAACGCGGG AGCCGGTCCG 780CTGGCCACGA TCCAGATCCT GCGGCAGGCG GTCGCCACCG TCAGCTACCT GGACGGTCCG 840AGCGCGGTGA CCAACGGCGG CGAGTTCACG CTCAACGCCA CGGTCGTGCC CACCCCGGAC 900AGCGGTCAGG TCCAGTTCAC CCGGGACGGT GAGGACGTCG GCGCGCCGGT CGATCTGGTG 960AACGGCAAGG CGTCGCTGAC GCAGTCGCTC GACACCGACG GCGACTACGC CTACGAGGCG 1020AAGTTCCTGG GCGCGGAGTT CTTCAATCCG TCGTCCGCCG CGAAGACGGT CACGGTGACC 1080TCGCAGGACA TCCAGACCAC CACGTCGGTC ACCGGACCTG ACCACGACGC CTACCGCGAC 1140CAGCCGGTGA ACCTCACCGC GAAGGTCGAG CCGGGCGTCT CGGGCGGCAC GGTGGCTTTC 1200GAGGTCGACG GAACCCCGGT CGGCACCGCC GATGTGATGG ATGACGGCGC GGCGGTGCTC 1260CCGCACACCT TCACCACCAA CGGCACGCAC CGCGTGATCG CCCGCTACTC GGGTGCCGAG 1320GGGATCTCCC CGTCGGTCTC GCTGCAGTAC CCGGTCAGCG TCACCGAGGC GCCGGCCGCC 1380GACGTGGCCA CCACGATCAC GGTCGATCCG ATCGCGTCGA CTGCCAAGGG CTCGCCGGTG 1440ACCCTCACCG CGCGTCTCGA TCCGGCCGAC GCCCGGGGCA CGGTGCAGTT CAAGCTCGGC 1500GACGTCCTGC TCGGCGGACC GGTGCGGGTG GATGCGAACG GTGTCGCGAC ACTGACGACG 1560TTCTTCCAGA ACCCCGGCGA GTTCGTCGTC ACGGCCCAGT TCACCGCCGA CGCCGGTTTC 1620ATCGACTCGG CAGCGAGCCC GGTTAACCTC ACGGTGACCG GTGATCCGGA CACCATTCCG 1680AATCCGGAGG GCGGCGGAAG CCTCGCAGGC CTTTCGGGAC TGTTCGGTAG CTTGGGCGGC 1740(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特征(A)长度237氨基酸(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)拓朴学线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Ser Ala Thr Thr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Cys Gln Ala Thr1 5 10 15Pro Ser Ser Ser Leu Ala Gly Gly Pro Gln Thr Gln Val Gln Ala20 25 30Ala Ser Val Thr Val Asp Ala Pro Glu Thr Val Ala Pro Gly Glu35 40 45Glu Phe Val Val Thr Ile Ser Pro Pro Pro Ile Ser Val Pro Asn50 55 60Asp Leu Gly Ser Gly Ala Ser Leu Ser Asn Ile Ser Arg Leu Lys65 70 75Ile Asp Val Ala Met Pro Glu Asn Ala Gln Phe Ile Gly Ala Glu80 85 90Val Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ala Pro Asn95 100 105Val Ile Val Val Asn Glu Ser Gly Ser Pro Asp Ala Asn Gly Ser110 115 120Ile Ile Arg Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Ile Gly Asn Gly Pro125 130 135Lys Ser Ser Lys Ser Ser Glu Gly Gly Ile Lys Ala Asn Ala Ser140 145 150Gly Ser Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Gln Val Lys Ala Thr Leu155 160 165Lys Ala Gly Ala Ala Gly Glu Ile Ser Met Lys Leu Arg Thr Ala170 175 180Gly Asn Ala Gly Gln Phe Gly Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr Phe185 190 195Leu Pro Arg Ala Ser Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Trp Ala Pro200 205 210Thr Gln Cys Ser Pro Arg Asp Thr Ala Ala Gly Pro Leu Asn Ala215 220 225Gly Ala Gly Pro Leu Ala Thr Ile Gln Ile Leu Arg230 235(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特征(A)长度711碱基对(B)类型核酸(C)链数双链(D)拓朴学线型(ii)分子类型基因组DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4TCGGCGACGA CGATCACGCC GTTCAACAAC GCATGTCAGG CGACGCCGTC GTCGAGCCTG 60GCCGGTGGGC CACAGACTCA GGTGCAGGCG GCGTCGGTGA CGGTCGACGC ACCGGAGACC120GTCGCTCCCG GTGAGGAGTT CGTGGTGACG ATCTCGCCGC CGCCGATCTC GGTGCCCAAC180GATCTGGGTT CCGGCGCGAG CCTGTCGAAC ATCTCGCGGC TCAAGATCGA CGTCGCGATG240CCGGAGAACG CGCAGTTCAT CGGCGCCGAG GTGGTGGCCG GAACGTCAGC GGGCATCACG300GGTGTCGCGC CCAACGTCAT CGTCGTCAAC GAGAGTGGTA GTCCGGACGC GAACGGCTCG360ATCATCCGGC TGTCCGGAAA CAACGAGACG ATCGGCAACG GACCGAAGTC CTCGAAGAGT420TCCGAGGGCG GTATCAAGGC GAACGCGTCG GGCAGCACCA CGTCCTTCCA GTTGCCGCAG480GTCAAGGCCA CCCTCAAGGC GGGCGCGGCC GGCGAGATCT CGATGAAGCT GCGCACCGCA540GGAAACGCCG GGCAGTTCGG CAACGACGCG AACTTCCTCA CGTTCCTGCC CCGCGCCAGC600GCACCGATCG TCGGCACGGT CTGGGCCCCC ACCCAGTGCT CGCCGCGTGA CACCGCGGCC660GGCCCGCTCA ACGCGGGAGC CGGTCCGCTG GCCACGATCC AGATCCTGCG G 711(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)拓朴学线型(ii)分子类型肽(v)片段类型N端片段(xi)序列描述SEQ ID NO5Ala Hhr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Xaa Gln1 5 10Ala Thr Pro Ser Ser Xaa Leu Ala Gly Gly Pro Gln15 20Thr25(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)拓朴学线型
(ii)分子类型肽(v)片段类型内部片段(xi)序列描述SEQ ID NO6Leu Arg Thr Ala Gly Asn Ala Gly Gln Phe Gly1 5Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr Phe Leu Pro Arg15 20Ala Ser(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓朴学线型(ii)分子类型其他核酸(合成DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCACCACCA TCACSCCSTT CAACAACGCV CCSCAGGCSA CCCC 44(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特征(A)长度56个碱基对(B)类型核酸
(C)链数单链(D)拓朴学线型(ii)分子类型其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO8ACCGCCGGCA ACGCVGGYCA GTTCGGYAAC GAYGCVAACT TCCTSACCTT CCTSCC56(2)SEQ ID NO9资料(i)序列特征(A)长度417个碱基酸(B)类型氨基酸(C)链数单链(D)拓朴学线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Thr Thr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Cys Gln Ala Thr Pro1 5 10 15Ser Ser Ser Leu Ala Gly Gly Pro Gln Thr Gln Val Gln Ala Ala20 25 30Ser Val Thr Val Asp Ala Pro Glu Thr Val Ala Pro Gly Glu Glu35 40 45Phe Val Val Thr Ile Ser Pro Pro Pro Ile Ser Val Pro Asn Asp50 55 60Leu Gly Ser Gly Ala Ser Leu Ser Asn Ile Ser Arg Leu Lys Ile65 70 75Asp Val Ala Met Pro Glu Asn Ala Gln Phe Ile Gly Ala Glu Val80 85 90Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ala Pro Asn Val95 100 105Ile Val Val Asn Glu Ser Gly Ser Pro Asp Ala Asn Gly Ser Ile110 115 120Ile Arg Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Ile Gly Asn Gly Pro Lys125 130 135Ser Ser Lys Ser Ser Glu Gly Gly Ile Lys Ala Asn Ala Ser Gly140 145 150Ser Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Gln Val Lys Ala Thr Leu Lys155 160 165Ala Gly Ala Ala Gly Glu Ile Ser Met Lys Leu Arg Thr Ala Gly170 175 180Asn Ala Gly Gln Phe Gly Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr Phe Leu185 190 195Pro Arg Ala Ser Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Trp Ala Pro Thr200 205 210Gln Cys Ser Pro Arg Asp Thr Ala Ala Gly Pro Leu Asn Ala Gly215 220 225Ala Gly Pro Leu Ala Thr Ile Gln Ile Leu Arg Gln Ala Val Ala230 235 240Thr Val Ser Tyr Leu Asp Gly Pro Ser Ala Val Thr Asn Gly Gly245 250 255Glu Phe Thr Leu Asn Ala Thr Val Val Pro Thr Pro Asp Ser Gly260 265 270Gln Val Gln Phe Thr Arg Asp Gly Glu Asp Val Gly Ala Pro Val275 280 285Asp Leu Val Asn Gly Lys Ala Ser Leu Thr Gln Ser Leu Asp Thr290 295 300Asp Gly Asp Tyr Ala Tyr Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ala Glu Phe305 310 315Phe Asn Pro Ser Ser Ala Ala Lys Thr Val Thr Val Thr Ser Gln320 325 330Asp Ile Gln Thr Thr Thr Ser Val Thr Gly Pro Asp His Asp Ala335 340 345Tyr Arg Asp Gln Pro Val Asn Leu Thr Ala Lys Val Glu Pro Gly350 355 360Val Ser Gly Gly Thr Val Ala Phe Glu Val Asp Gly Thr Pro Val365 370 375Gly Thr Ala Asp Val Met Asp Asp Gly Ala Ala Val Leu Pro His380 385 390Thr Phe Thr Thr Asn Gly Thr His Arg Val IIe Ala Arg Tyr Ser395 400 405Gly Ala Glu Gly Ile Ser Pro Ser Val Ser Leu Gln410 415(2)SEQ ID NO10资料(i)序列特征(A)长度1251个碱基对(B)类型核酸(C)链数双链(D)拓朴学线型(ii)分子类型基因组DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GCGACGACGA TCACGCCGTT CAACAACGCA TGTCAGGCGA CGCCGTCGTC GAGCCTGGCC60GGTGGGCCAC AGACTCAGGT GCAGGCGGcG TCGGTGACGG TCGACGCACC GGAGACCGTC 120GCTCCCGGTG AGGAGTTCGT GGTGACGATC TCGCCGCCGC CGATCTCGGT GCCCAACGAT 180CTGGGTTCCG GCGCGAGCCT GTCGAACATC TCGCGGCTCA AGATCGACGT CGCGATGCCG 240GAGAACGCGC AGTTCATCGG CGCCGAGGTG GTGGCCGGAA CGTCAGCGGG CATCACGGGT 300GTCGCGCCCA ACGTCATCGT CGTCAACGAG AGTGGTAGTC CGGACGCGAA CGGCTCGATC 360ATCCGGCTGT CCGGAAACAA CGAGACGATC GGCAACGGAC CGAAGTCCTC GAAGAGTTCC 420GAGGGCGGTA TCAAGGCGAA CGCGTCGGGC AGCACCACGT CCTTCCAGTT GCCGCAGGTC 480AAGGCCACCC TCAAGGCGGG CGCGGCCGGC GAGATCTCGA TGAAGCTGCG CACCGCAGGA 540AACGCCGGGC AGTTCGGCAA CGACGCGAAC TTCCTCACGT TCCTGCCCCG CGCCAGCGCA 600CCGATCGTCG GCACGGTCTG GGCCCCCACC CAGTGCTCGC CGCGTGACAC CGCGGCCGGC 660CCGCTCAACG CGGGAGCCGG TCCGCTGGCC ACGATCCAGA TCCTGCGGCA GGCGGTCGCC 720ACCGTCAGCT ACCTGGACGG TCCGAGCGCG GTGACCAACG GCGGCGAGTT CACGCTCAAC 780GCCACGGTCG TGCCCACCCC GGACAGCGGT CAGGTCCAGT TCACCCGGGA CGGTGAGGAC 840GTCGGCGCGC CGGTCGATCT GGTGAACGGC AAGGCGTCGC TGACGCAGTC GCTCGACACC 900GACGGCGACT ACGCCTACGA GGCGAAGTTC CTGGGCGCGG AGTTCTTCAA TCCGTCGTCC 960GCCGCGAAGA CGGTCACGGT GACCTCGCAG GACATCCAGA CCACCACGTC GGTCACCGGA 1020CCTGACCACG ACGCCTACCG CGACCAGCCG GTGAACCTCA CCGCGAAGGT CGAGCCGGGC 1080GTCTCGGGCG GCACGGTGGC TTTCGAGGTC GACGGAACCC CGGTCGGCAC CGCCGATGTG 1140ATGGATGACG GCGCGGCGGT GCTCCCGCAC ACCTTCACCA CCAACGGCAC GCACCGCGTG 1200ATCGCCCGCT ACTCGGGTGC CGAGGGGATC TCCCCGTCGG TCTCGCTGCA G 1251(2)SEQ ID NO11资料(i)序列特征(A)长度14个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓朴学线型(ii)分子类型其他核酸(合成DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO1权利要求
1.分离的DNA，其包含编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体的序列。
2.根据权利要求1的分离的DNA，其中分离的DNA包含选自(a)到(d)组成的组中的DNA序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的DNA序列或其片段；(b)编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO3之氨基酸序列的DNA序列或其片段；(c)编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示氨基酸序列中缺失、加入、插入或取代1个或多个氨基酸所得到之氨基酸的DNA序列或其片段；(d)能够与上面(a)到(c)中任意一个杂交的DNA序列。
3.根据权利要求1或2的分离的DNA，其中的多肽来自红球菌属菌株。
4.根据权利要求3的分离的DNA，其中的多肽来自红球菌菌种M-777。
5.重组DNA，其包含权利要求中1到4中任意一项的分离的DNA。
6.包含权利要求5的重组DNA的载体。
7.根据权利要求6的载体，其中的重组DNA可操作地连接到启动子上。
8.用权利要求6或7的载体转化的原核或真核细胞。
9.生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的方法，其包括下列步骤(a)培养权利要求8的细胞；(b)从步骤(a)获得的培养物中回收具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体。
10.由权利要求9的方法生产的或由权利要求1到4中任意一项的分离的DNA编码的具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等变异体。
11.与权利要求1到4中任意一项的分离的DNA特异性杂交的合成的寡核苷酸探针引物。
12.与权利要求10的多肽特异性地结合的抗体或其片段。
全文摘要
带有编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的序列的分离的DNA，和以基因重组技术生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的方法。
文档编号C12N15/31GK1145952SQ9611106
公开日1997年3月26日 申请日期1996年6月29日 优先权日1995年6月29日
发明者黑目洋子, 伊豆博幸, 泉可也, 佐野睦, 加藤郁之进, 伊东信 申请人:宝酒造株式会社