专利名称：：生产糖原的方法
技术领域：
：本发明涉及生产高分子量的高度分支a-葡彩瞎尤其是糖原的方法。
背景技术：
：a-葡^t是a-D-葡萄糖的聚合物。自然界中存在多种形式的a-葡聚糖。a-葡聚糖中，典型的实例是糖原和淀粉。然而，糖原和淀粉在结构和物理性质上彼此明显不同。糖原是动物、真菌、酵母和细菌的主^ft存多糖。糖原是水溶性的并且形成乳白色溶液。已经^艮好地研究了动物体内糖原的分子结构。天然糖原是均聚葡聚糖(homogluc肌)，其中通过a-l，4-葡萄糖苷键线性键合的葡萄糖(葡萄糖)的糖链通过a-l，6-葡萄糖苷键分支化，并且所得分支进一步分支而形成网络结构。天然糖原由a-l，4-葡糖苷连接的链组成，所述链的平均聚合度为约10-约14，并且通过a-l，6-葡萄糖苷键结合。天然糖原的分子量描述的各不相同，估计为约105-108。天然糖原以分子量为约107(P-颗粒)的颗粒或由P-颗粒聚集形成的更大颗粒(a-颗粒)出现。据认为细菌中糖原的结构类似于动物中糖原的结构。某些植物(例如甜玉米)中存在与糖原结构类似的葡聚糖，它们被称为植物糖原(phytoglycogen)。淀粉是植物中的主要储存多糖，并且以水不溶性颗粒形式出现。这种颗粒含有两种不同的多糖。所述两种多糖是直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉由a-l，4键连接的基本线性的D-葡萄糖单元组成。支链淀粉是被认为具有簇结构的分支聚合物。每个蔟单元由a-l,4-连接的葡萄糖链组成，所述链的平均聚合度为约12-约24并且彼此通过a-l，6-葡萄糖苷键结合。所i^单元进一步由平均聚合度为约30-约100的较长a-l,4-连接的葡萄糖链组成。按照聚合度，整个支链淀粉的平均链长度为约18-约25。与糖原类似，支链淀粉是由a-l，4-葡萄糖苷键和a-l，6-葡萄糖苷键结合的葡聚糖，但是糖原的分支程度比支链淀粉更高。近来，已经证实糖原具有免疫刺激作用。因此，可以预期糖原用作免疫刺激剂、健康食品材料等。另外，可以预期糖原作为化妆品材料、食品材料(调味品材料)和其它工业材料的应用。糖原在多种工业领域中使用。糖原的应用包括例如微生物感染的治疗剂、湿润剂(例如有效改善皮肤保水的化妆品、防止嘴唇Wt的化妆品)、复合调味料(例如具有扇贝(眼)味道的复合调^MHO、抗肺瘤剂、形成发酵乳的加速剂、胶体颗粒聚集体、影响头发易梳性和光泽的改善头发表面摩擦阻力的物质、细胞活化剂(表皮细胞活化剂、成纤维细胞增殖剂等)、atp生成促进剂、皮肤衰老症状如皱紋的改善剂、皮肤粗糙的改善剂、荧光颗粒表面处理剂和环状四糖(CTS;cyclo{~>6)-a-D-glcp-(l—3)-a-D画glcp-(1—6)-a-D-glcp-(l—3)-a-D-glcp-(l—})合成的底物。糖原可以用于皮肤外用制剂中(例如化妆水、乳液、霜、精华素、生发剂、育发剂、面膜、唇骨、护唇霜、化妆粉底液、化妆粉底霜、粉底、眼影、腮红、香波、润丝、发用液剂、头发滋补剂、长效巻发剂、染发剂、处理(剂)、浴用剂、护手霜、护腿霜、护颈霜、爽身水等)、或眼用溶液等中。来源于贝类(贻贝)的糖原和来源于甜玉米的植物性糖原已经上市，但是很昂贵并且主要用作化妆品中的湿润剂。作为试剂，来源于多种贝类或动物肝脏的糖原也已经上市，但是相当昂贵并且m^工业应用，因此，期望大量提供廉价的糖原。分支酶(系统名1，4-a-D-葡^t:l，4-a-D-葡聚糖6-a-D-(l，4-a-D-葡,)-转移酶，EC2.4.1.18，在本说明书中也被称作BE)是一种酶，它切割a-l,4-葡萄糖苷键并且将所述键转移至另一个葡萄糖残基的6-位OH基而形成a-l，6-葡萄糖苷键。BE广泛分布在动物、植物、霉菌、酵母和细菌中，催化糖原或淀粉的分支键的合成。在二十世纪七十年代已经详细研究了来源于马铃薯的BE的催化作用，并且已经证实BE催化分子间分支反应(图1A)。在二十世纪九十年代晚期已经证实BE催化环化反应(图1B)。通过证实这种环化反应，理论上估计，BE也催化分子内分支反应(图1C)。这是因为，从微观角度考虑，切割a-l，4-葡萄糖苷键、将该键转移至另一个葡萄糖残基中6-位上OH基、和形成a-l，6-葡萄糖苷键，这3种反应可以说是相同的。BE^L认为是糖苷水解酶13家族(a-淀粉酶家族)的一个成员，并被认为其在单个活性中心通过与a-淀粉酶基本相同的机制催化切割a-l，4-葡萄糖苷键、将该键转移至另一个葡萄糖残基中6-位上OH基'已经知道，通过使BE与另一种酶a-葡IMt磷酸化酶一起作用于葡萄糖-l-磷酸和寡糖，或者通过使BE与糖原合成酶(或淀粉合成酶)一起作用于UDP-葡萄糖(或ADP-葡萄糖)，可以合成结构和性质与天然糖原类似的糖原。然而，a-葡聚糖磷酸化酶虽然是已经上市的试剂，但是相当昂贵.另外，4帥获得糖原合成酶和淀粉合成酶.葡萄糖-l4酸、UDP-葡萄糖和ADP-葡萄糖相当昂贵。因此，通过这种方法不能解决提供大量廉⑩原的问题。大分子如葡聚糖通常不是均匀的分子，而是各种大小分子的混合物，因此根据数均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)评估其分子量。Mn通过体系总质量除以体系中所含分子数来确定。也就是说，Mn是数目分数的平均值。另一方面，Mw是重量分数的平均值。如果是完全均匀的材料，Mw=Mn,但是大分子通常具有分子量分布，因此Mw>Mn。其遵循以下规律随着Mw/Mn超过1以及更高，则分子量的不均匀性也更高(也就是说，分子量分布更宽)。已知利用酶合成的直链淀粉(例如由AjinokiCo.,Ltd制造的酶促合成直链淀粉)具有窄的分子量分布(在非专利文献4中，Mw/Mn<1.2;在Fujii,K.efa/.(2003)祝ocato/戸'sflwrf5iV^raws/o簡flftVm，Vol.21，pp.167-172中，Mw/Mn=1.005-1.006)。另一方面，从自然^C取的直链淀粉具有相对较宽的分子量分布，Mw/Mn为约2-约5(描述于pp.347-429inCarbohydratesinfood,editedbyEliasson,A.-C.,MarcelDekker,Inc.,NewYork(1996);Hizukuri,S.，Starch:analyticalaspects中表15中的聚合度DP(数均DPn,重均DPw)。这些DP乘以162，得到各自的平均分子量)。Mn可以通过评估分子数来确定。也就是说，直链淀粉等的Mn可以通过测量还原末端的数目来确定.还原末端的数目可以例如通过非专利文献7中描述的改良Park-Johnson方法来确定。Mn还可以例如通过非专利文献8中描述的凝胶过滤色谙法(MALLS方法)来确定，所述皿过滤色镨法利用示差折光计结合多角度激光光散射检测器。Mw可以通过非专利文献8中描述的MALLS方法来确定。本说明书中，底物的分子量主要*#^据数均分子量(Mn)来评估，而产生的葡IMt的分子量主要根据重均分子量(Mw)来评估。这是因为，当产物经过图1B中显示的环化反应时，Mn不能通过评估还原末端数的方法来正确地评估，还因为当评估非常大的分子的分子量时，还原末端数目相对较低，因此很难准确测量Mn，另外，因为通过MALLS法评估Mn的方法是基于这一前提凝胶过滤的分级是完全的，因此当分级不完全时，准确评估Mn不可行。已经有实例允许BE作用于支链淀粉或淀粉而产生高分子量的(X-葡聚糖。并且有大量实例表明允许BE单独作用于a-葡IW(例如直链淀粉)。然而，没有实例表明允许BE作用于直链淀粉而产生分子量为约1,000,000或更高的高分子量a-葡聚糖。通过BE作用于支链淀粉得到的高分子量a-葡聚糖被认为在支链淀粉基本结构上具有更多分支，如非专利文献17中所示，并且可以说，没有合成糖原(具有球状结构)。例如，非专利文献1和2中描述了，来源于W^孢霉(A^iYW/wm)的BE可作用于支链淀粉或直链淀粉，从而将它们转化为由6-葡萄糖单元的单元链组成的高度分支的糖原样分子。然而，术语"糖原样"只表示分子被碘染色的程度与糖原类似。其中用作底物的直链淀粉的数均聚合度为15、22或130，表明Mn分别为约2430、约3600和约21000。具体而言，非专利文献2描述了，来源于^脉孢霉的BE可以作用于平均聚合度为15或22的短链直链淀粉，来源于植物的BE可以作用的直链淀粉的最小聚合度为30-40或更高。非专利文献2还描述了，已经提示来源于粗糙脉孢霉的BE作用于12个或更多戎基的葡萄糖链，从而进行六糖作为最小单元的转移反应。从非专利文献1的图1和2以及非专利文献2的图3和4中可以看出，当来源于WU3^孢霉的BE作用于支链淀粉和直链淀粉时，这些底物的分子量不改变。另外，非专利文献1的图4和5以及非专利文献2的图5和6显示，得到了比底物分子稍大和稍小的分子，没有观察到明显高分子量的产物。例如，非专利文献3描述了，当玉米BEI作用于平均链长度大于300的直链淀粉时，产物在凝胶过滤中的洗脱时间出现延迟，这种延迟是由于形状的改变，而不是由于分子量的改变。例如，非专利文献4描述了，随着反应时间的延长，BE(具体而言，Q酶)作用于直链淀粉得到的支链淀粉样分子的分子量降低.例如，非专利文献5描述了，当来源于马铃薯的BE(Q酶)作用于Mw为67600的直链淀粉时，可以得到Mw为33500的反应产物。例如，非专利文献6描述了，当来源于马铃薯的BE(Q酶)作用于Mn为200,000的直链淀粉时，可以得到Mw为22,000的葡IMt。例如，非专利文献7描述了，当来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(^1"7/^"efli^/^f7tf/^//MS)的BE作用于Mw为302,000的酶促合成直链淀粉时，发生环化作用而降低它们的分子量。注意到，已知用作底物的S^合成直链淀粉具有窄分子量分布。例如，根据非专利文献4的酶^^合成直链淀粉的Mw/Mn<1.2;才艮据Fujii，K."fl/.(2003)说Vcato/"/s"wd说Wra船/w附"ft卵，Vol.21,pp.167-172的S^合成直链淀粉的Mw/Mn=1.005-1.006。根据生产商AjinokiCo.,Ltd的手册，Wl合成直链淀粉的Mw/Mn<1.1。由此，用于这个文献的Sl^l合成直链淀粉的近似Mn为约252,000-302,000。因此，可以通过Mw除以1.1大概估计酶^l合成直链淀粉的Mn。例如，非专利文献8描述了，当来源于风产热菌(j《myfecfl^//c"s)的BE作用于a-葡聚糖时，可以得到环化的葡聚糖。这意味着，葡聚糖被降解为较低分子量的产物，如图1B所示。例如，非专利文献9描述了，当来源于蜡质芽孢杆菌(fifl"7/ms"mms)的BE作用于各种大小的酶促合成直链淀粉时，从所有酶促合成直链淀粉得到几乎相同大小的葡影瞎(图5.8)。另外，由这个文献的图5.9显而易见，没有检测到分子量大于约l，OOO,OOO的组分。另外，从这个文献的图5.13中的M模型可知，不能预期高度分支和高分子量a-葡彩瞎的形成。由图1显而易见，在BE的分子间分支反应中既产生了比原始分子大的又产生比原始分子小的分子(图1A);在环化反应中产生比原始分子小的分子(图IB);在分子内分支反应中(图1C)，^JL前后分子量没有变化。因为这些反应的机制是相同的，不能预期这3种反应以明显不同的频率发生。事实上，非专利文献9的图5.8的结W明，所有3种反应都是被催化的，只是根据底物分子量有些差异，导致了由任意大小的直链淀粉形成相同大小的葡聚糖。为了由直链淀粉得到分子量为1，000,000或更大的高分子量葡聚糖，(A)的分子间分支反应需要以压倒性优势更高的频率来催化，并且在所得的分子中，较大分子需要经过进一步继续聚合方向的反应。这不能从BE的常规催化机制中预期，并且没有获得有此提示的结果。专利文献2描述了生产聚合度为50-5000、具有内部分支环状结构部分和外部分支结构部分的葡聚糖的方法，所述方法包括使BE(具体而言，分支酶)作用于直链淀粉、部分降解的淀粉、脱支淀粉、用磷酸化,化合成的直链淀粉、麦芽寡糖等。在此方法中，底物被环化并且由BE形成较低分子量的分子，从而产生聚合度为50-5000并且最大聚合度为10,000的环状葡聚糖。在此方法中，通过将底物形成低分子量分子得到产物，因此使用高分子量分子作为底物。这从段落0066的描述中是显而易见的，其中描述可以优选使用聚合度约400或更高的直链淀粉。聚合度为400的直链淀粉的分子量为约65,000，从该专利公开中不能显而易见地看出是否可以用低分子量直链淀粉作为底物获得高分子量a-葡聚糖。如上所述，目前为止认为，当BE作用于直链淀粉时，直链淀粉被转化为较低分子量的分子，或者即使某个分子的分子量可以增加，也很少有分子经历聚合而增加其分子量，并且产物的分子量几乎不改变。另外，据报道，通过BE作用于直链淀粉得到的a-葡彩瞎与糖原不同，其差异在于a-葡聚糖易于被支链淀粉酶(pullulanase)降解(非专利文献10和16)。还有文献描述，通过BE作用于直链淀粉得到"糖原"(例如，非专利文献18(WalkerWa/.，￡nr./5"c/ie附.(1971)Vol.20，pp.14-21))，但是在这个文献中，没有测量所得葡聚糖的分子量，也没有分析其可消化性。另夕卜，还有很多实例，其中为了检验酶的性质使BE作用于直链淀粉(例如，专利文献3和非专利文献11-12)。然而，这些实例中没有一个测量了>^应产物的分子量。已知BE(尤其是来源于植物的BE)几乎不作用于短链直链淀粉。例如，非专利文献13描述了，BE几乎不作用于聚合度为40或更低的直链淀粉(分子量为约6480)。这可能是因为BE需要底物直链淀粉具有某种较高级结构，但是不具有某种长度的直链淀粉不能有这种较高级结构(非专利文献14)。另夕卜，认为这种较高级结构与温度有关，当温度高时，直链淀粉没有这种较高级结构。来源于细菌的BE似乎作用于短的底物(非专利文献15)，但是已知它的作用很弱(非专利文献9，图4.5)。由前述，不能预期由直链淀粉作为底物通过BE合成分子量为l，OOO，OOO或更大的高度分支和高分子量的葡聚糖，更进一步，也不能预期支链淀粉酶和a-淀粉酶对高分子量葡聚糖的消化性较低。另外，由于对Mn为4800和9300的Sl^合成直链淀粉的较低活性(与使用S^1合成的具有Mn为270,000的直链淀粉作为底物时的最大活性相比，约7%-12%活性。非专利文献9中图4.5),使用Mn为8,000或更小(尤其Mn为4,000或更小)的直链淀粉作为底物的优势还没有想到。另外，在生产糖原的常规方法中，也存在问题，为获得高纯度糖原必须有非常高的消耗，因为除非产物被高度纯化，否则电解质和单糖的含量较高。例如，在通过将BE加至蔗糖磷酸化酶和a-葡^t磷酸化酶而生产糖原的方法中，需要向反应溶液中加入约10mM磷酸，并且得到的反应产物含有大量果糖和少量磷酸(蔗糖+磷酸+寡糖—a-葡^t+果糖+磷酸)。在GP与BE组合的方法中，产物含有较大量的电解质(葡萄糖-l-磷酸+寡糖—a-葡聚糖+磷酸)。这还应用于糖原合成酶(GS)与BE组合的方法(ADP-葡萄糖+—a-葡聚糖+ADP)。即使从天然产物中提取糖原，所述糖原也被多种物质如蛋白质、脂类和其它碳水化合物以及电解质污染，因此在获得高纯度的糖原中存在支出非常高的问题。专利文献l:日本特许7>开No.2000-316581专利文献2:日本专利No.3107358，权利要求1，段0066专利文献3:日本专利国家阶段PCT专利4S开No.2002-539822非专利文献1:Matsumoto"fl/"/5/oc/^附，Vol.107，118-122(19卯)(图2)非专利文献2:MatsumotoandMatsuda，"DenpunKagaku"(淀粉科学)，Vol.30，pp.212-222(1983)(图3和4)非专利文献3:BoyerW"/.，5fewc/^tow^34Nr.3，S.81-85(1982)(表1，图2和图3)非专利文献4:Kitamura,7V(v附ei7'cMatenVi/s^""cyc/o/^rfi'fl,Vol.10，pp.7915-7922(表2)非专矛J文献5:PraznikWfl/"CVjri^o/ij^rateWes^wr/i,227(1992)pp.171-182非专利文献6:GriffinandVictor,fi/ocAewn's^vVol.7,No.9，September1968非专矛J文献7:Takata，H.&fl/,，Cyclizationreactioncatalyzedbybranchingenzyme./fifl"enV/"1996.178:pp.1600-1606非专利文献8:Takata，H."fl/.，/4pp/.G7jc仍c/.,2003.50:pp.15-20非专利文献9:HirokiTakata博士论文(京都大学)1997(StudiesonEnzymesInvolvedinGlycogenMetabolismof丑鎖7/wsSpecies)3一专矛J文献10:CharlesBoyerandJackPreiss，丑/oc/^附Zs^j1977，Vol.16，No.16,pp.3693-3699非专矛J文献11:Shinohara，M.L.d/，J/;//fi^tecA/io/,2001.57(5-6):pp.653-9非专利文献12:Takata,H.&M/craA/o/"1994.60:pp.3096-3104非专利文献13:Borovsky，D.，Smith,E.E.andWhelan，W.J.(1976)/丑/tfc/^附.62，307-312非专利文献14:Borovsky，D,Smith,E.E.andWhelan，W.J.(1975)F五55^故.54,201-205非专利文献15:Okada"C，"DenpunKagaku"(淀粉科学)，Vol.30，pp.223-230(1983)非专利文献16:Kitahata,S.andOkada，S.(1988)inHandbookofamylaseandrelatedenzymes.Theirsources,isolationmethods,propertiesandapplications.(TheAmylaseResearchSocietyofJapaned)，pp.143-154，PergamonPress,Oxford非专利文献17:KawabataCn/.(2002)/.J/;//.G/j;c仍c/.Vol.49，No.3，273-279非专利文献18:Walker"a/.，/5/oc/^挑.(1971)Vol.20,pp.14-21
发明内容本发明要解决的问题本发明的目的是，为了解决前面提到的问题，提供高度分支和高分子量的a-葡聚糖尤其是糖原的生产方法。解决问题的手段为了解决前面提到的问题，本发明人继续集中地研究，结果最终发现了具有比率(分支酶活性)/(分子量降低活性)为500或更小的BE具有合成糖原的能力，由此完成了本发明。本发明的生产方法是生产糖原的方法，其包括使具有合成糖原能力的BE作用于底物来生产糖原的步骤，其中所述底物是a-葡聚糖，主要由a-l，4-葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更高，并且溶液中糖的数均分子量(Mn)在反应开始前大于180但是不超过150,000。在一个实施方案中，(分支酶的分支酶活性)/(分支酶的分子量降低活性)可以为500或更小。在一个实施方案中，BE可是是热稳定的分支酶。在一个实施方案中，BE可以来源于嗜热菌或中温性菌。在一个实施方案中，BE可以来源于选自产液菌属(j《"(/^)、红嗜热盐菌属(及/^/W/^f附IIS)、芽孢杆菌属(5<1"7/附)、嗜热聚球蓝细菌属(rAmiiosjiiecAoctfccMS)和埃希氏菌属(jE"scAw'cA/")的属的细菌。在一个实施方案中，BE可以来源于选自风产液菌(j《w《y^ae0//cus)、嗜火产液菌(^4拜yk;c/y;ra/;緒"s)、及/r0^/1c附11stf6fl附e"s/s、海洋红嗜热盐菌(及/^/W/^r附MS;nflnViMS)、嗜热脂肪芽孢杆菌(丑fl"7/wss^wY^/rmiio^/i//"*)、热速芽孢杆菌(5頻7/"scfl/rfove/似)、热链形芽孢杆菌(5"ci7/ms^rer腳cate""/"似s)、热溶芽孢杆菌(Jff鎖7/wsCfl/rf。/,'CS)、黄热芽孢杆菌(必fl"7/Msy7flvo幼ef挑MS)、酸热芽孢杆菌(^BflC/Z/llSfl"V/<Cfl/</flWS)、热坚芽孢杆菌(丑flCl7/m5)、史氏芽抱軒菌(5fl"7/wss附/由'i')、77re削o5jwc/r0coccwse/o"gfl似s和大肠埃希氏菌(^Esc/rm.cA/flco//)的细菌。在一个实施方案中，BE可以来源于选自风产液菌、及/^^幼^7mmsMfl柳e"s/s、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的细菌。在一个实施方案中，BE的最佳反应温度可以不低于45X:并且不超过卯"C。在一个实施方案中，所述底物可以是脱支淀粉、脱支糊精或酶促合成的直链淀粉。在一个实施方案中，开始反应前溶液中糖的Mn可以大于180并且小于4,000。在一个实施方案中，开始反应前溶液中糖的Mn可以为4,000或更大以及8，000或更小，可以调节BE用量和反应时间，使得BE用量和反应时间的乘积为25,000U.小时/g底物或更高。在一个实施方案中，开始反应前溶液中糖的Mn可以为8,000或更大以及100，000或更小，可以调节BE用量和反应时间，使得BE用量和反应时间的乘积为40,000U小时/g底物或更高。在一个实施方案中，开始反应前溶液中的糖的Mn可以为100,000或更大以及150,000或更小，调节BE用量和反应时间，4吏得BE用量和反应时间的乘积为150,000U■小时/g底物或更高。在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括使4-a-葡聚糖基转移酶作用于Mn大于180并小于1,500的a-葡聚糖从而产生底物的步骤。在一个实施方案中，所述Mn大于180并小于1，500的a-葡聚糖可以包含聚合度为4-7的麦芽寡糖。在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括使脱支酶作用于Mn为500或更大的低分支a-葡聚糖来生产底物的步骤。在一个实施方案中，本发明的方法既不使用a-葡聚糖磷酸化酶，也不使用糖原合成酶。在一个实施方案中，4-a-葡聚糖基转移酶可以与BE共存，本发明的作用根据本发明可以廉价地大量生产糖原。本发明方法的优点在于，不需要高度纯化即可以活动含有非常少量电解质和单糖的糖原。因此，具有可以低成本获得高纯度糖原的优点。图1:图l是示意性显示BE的各种作用的图。图1A是显示BE催化分子间分支反应的图。图IB是显示BE催化环化反应的图。图1C是显示BE催化分子内分支反应的图。图2:图2是显示由a-葡聚糖生产糖原的示意图。图3:图3是显示利用各种量的BE所得产物的Mw的图表。图4:图4是显示利用各种分子量的底物所得产物的Mw的图表。图5:图5是反应的示意图，其中用脱支酶降解淀粉来得到直链淀粉，并且使BE与所述直链淀粉反应来生产糖原。图6:图6是显示当使用异淀粉酶和各种量的BE来由淀粉生产a-葡聚糖时所得产物的Mw的图表。BE的量用U/g底物来表达。图7:图7的示意图显示由麦芽五糖通过4-a-葡IMt基转移酶生产直链淀粉，和由直链淀粉通过BE生产糖原。图8:图8是显示利用各种DP(聚合度)的底物(G5、G6或G7)所得产物的Mw的图表。图9:图9是显示在各种量的支链淀粉酶作用于通过本发明生产的糖原(空心三角、"目前生产的GLY)、试剂糖原(实心三角，"试剂GLY")、蜡质玉米淀粉(实心圆，"蜡质")或玉米淀粉(空心圆，"玉米淀粉")之后所得产物的Mw的图表。图10:图10是显示各种量的a-淀粉酶作用于通过本发明生产的糖原(空心三角、"目前生产的GLY)、试剂糖原(实心三角，"试剂GLY)、蜡质玉米淀粉(实心圆，"蜡质")或玉米淀粉(空心圆，"玉米淀粉")之后所得产物的Mw的图表。图11A:图IIA是具有合成糖原能力的BE的反应模型。图11B:图IIB是不具有合成糖原能力的BE的反应模型。图12:图12的示意图显示，在来源于风产液菌VF5的BE作用于蜡质玉米淀粉情况下，酶量与产物Mw的关系。纵轴显示产物的Mw，水平轴显示BE添加量。序列表自由文本SEQIDNO:1:编码来自风产液菌VF5的野生型BE的磁J^序列；SEQIDNO:2:来自风产液菌VF5的野生型BE的^J^酸序列；SEQIDNO:3:编码来自及Aofl^/iei7MwsWfl附ews/sJCM9785的野生型BE的>5^&序列；SEQIDNO:4:来自WA<w/W/i7msWcf附e"s/sJCM9785的野生型BESEQIDNO:5:编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的SEQIDNO:6:来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的^J^齡列；SEQIDNO:7:编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BE的^J^序列；SEQIDNO:8:来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BESEQIDNO:9:编码来自热速芽孢杆菌IF015315的野生型BE的碱基序列；SEQIDNO:10:来自热速芽孢杆菌IF015315的野生型BE的氨基酸序列；SEQIDNO:11:编码来自热链形芽孢杆菌的野生型BE的磁J^序列；SEQIDNO:12:来自热链形芽孢杆菌的野生型BE的M酸序列；SEQIDNO:13:编码来自热溶芽孢杆菌IF015313的野生型BE的碱基序列；SEQIDNO:14:来自热溶芽孢杆菌IF015313的野生型BE的氨基酸序列；SEQIDNO:15:编码来自77^i7<w_v/^c/iococa/se/wigfl似sBP-1的野生型BE的>^序列；SEQIDNO:16:来自77^i7<M^"ecAoctfccMSetowga似sBP-1的野生型BE的^J^^列；SEQIDNO:17:编码来自；tM埃希氏菌W3110的野生型BE的^J^序列；SEQIDNO:18:来自大肠埃希氏菌W3110的野生型BE的JL^^列；SEQIDNO:19:编码来自7JC生栖热菌(T7iei7wwsfl《"fldcws)的TaqMalQ的>5^&序列；SEQIDNO:20:来自水生栖热菌的TaqMalQ的^J^酸序列；SEQIDNO:21:引物ECBEN-NCO的序列；SEQIDNO:22:引物ECBEC-HIN的序列；SEQIDNO:23:引物ROBEN-ECO的序列；和SEQIDNO:24:引物ROBEC-PST的序列。最佳实施方式在下文中将详细描述本发明。本发明的方法是生产高度分支和高分子量a-葡聚糖(即糖原)的方法，其包括使具有合成糖原能力的BE在溶液中作用于底物来生产糖原的步骤，其中所述底物是主要由a-l，4-葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更高的a-葡聚糖，并且溶液中糖的数均分子量(Mil)在反应开始前大于约180但是不超过约150,000。在本说明书中，"糖原"指一种糖类，其包含只通过a-l，4-葡萄糖苷键和a-l，6-葡萄糖苦键连接的D-葡萄糖作为组成单元，分子量为l,OOO，OOODa或更高，并且当与50U/g底物量的支链淀粉酶在评估实施例1的M下反应时，通过MALLS方法确定得到Mw为500,000Da或更高的产物；当与300U/g底物量的a-淀粉酶在评估实施例2的条件下反应时，通过MALLS方法确定得到Mw为500,000Da或更高的产物。当某种糖与50U/g底物量的支链淀粉酶在评估实施例1的条件下反应得到Mw为500,000Da或更高的产物时，所i^^皮称为"对支链淀粉酶降解有抗性"。当某种糖与300U/g底物量的a-淀粉酶在评估实施例2的条件下反应得到Mw为500,000Da或更高的产物时，所i^t被称为"对a-淀粉酶降解有抗性"。其中，关于a-淀粉酶的活性，lUa-淀粉酶活性是指，当酶与淀粉在pH6.9在20°C下M时在3分钟内从淀##放1mg麦芽糖所用的酶量。关于支链淀粉酶的活性，1U支链淀粉酶活性是指，当酶与最终浓度为l。/。的支链淀粉在pH5.0、40。C下反应时，在反应早期阶段l分钟内产生相应于1nmol葡萄糖的还原力所需的酶量。(1.分支酶)"具有合成糖原能力的分支酶"是指在BE中具有合成糖原能力的BE。通过本领域已知的方法可以确定某种BE是否具有合成糖原的能力。也就是说，某种BE是否具有合成糖原的能力可以例如如下确定通过使BE作用于直链淀粉，然后检查是否在溶液中产生了分子量为l，OOO，OOODa或更高的高分子量a-葡彩瞎，以及通过确定产生的高分子量a-葡^t是否对支链淀粉酶降解和a-淀粉酶降解有抗性。溶液中是否存在高分子量a-葡聚糖可以通过使用示差折光计结合多角度激光光散射检测器作为检测器的HPLC皿过滤分析方法来确定，如非专利文献8中描述。根据评估实施例1中的方法可以确定对支链淀粉酶降解的抗性。根据评估实施例2中的方法可以确定对a-淀粉酶降解的抗性。根据本发明人的研究，在BE中，(分支酶活性)/(分子量降低活性)为500或更小的BE具有合成糖原的能力，而在BE中，(分支酶活性)/(分子量降低活性)大于500的BE不具有合成糖原的能力。分支酶活性是降低直链淀粉-硤复合物在660nm处吸光率的活性，并且是基于BE切割a-l，4-葡萄糖苷键并将所述键转移至另一个葡萄糖戎基上6-位OHJ^而形成a-l，6-葡萄糖苷键来减少直链淀粉的直链部分的能力.测量BE的分支酶活性的方法在本领^A已知的，并且例如在非专利文献8中描述。例如按照下面的方法测量BE的分支酶活性首先，将50nL酶溶液加入50nL底物溶液(0.12%(w/v)直链淀树III型，由SigmaChemical制造))中开始>^应。反应在BE的最佳反应温度下进行。BE作用IO分钟之后，加入lmL0.4mM盐酸溶液来终止反应。此后，加入lmL碟溶液，并且充分混合，随后测量反应混合物在660nm的吸光率。作为对照溶液，同时制备在加入酶溶液之前加入0.4mM盐酸溶液的溶液。通过将200nL50mM磷酸钾緩沖液(pH7.5)加入1001.2%(w/v)III型直链淀粉溶液(溶解在二曱基亚砜中)中，随后加入700nL蒸馏水并且充分混合所得混合物来制^^底物溶液。将緩冲液的pH调至所用BE的最佳^JLpH。通过混合0.5mL1N盐酸溶液与0.125mL储备液(2.6wt%12，26wt%KI水溶液)混合并且用蒸馏7JC调节混合物的体积至65mL来制备碘溶液。根据下列等式确定酶溶液的BE活性BE活性(单位(U)/mL)=U(对照溶液在660nm的吸光率)-(样品溶液在660nm的吸光率)/((对照溶液在660nm的吸光率)}x100/10x20本说明书中，BE活性主要用作对BE活性的量度。因此，简单的"活性"是指"BE活性"，简单的"单位"或"U"是指BE活性测量的"单位"或"U"。分子量降低活性是本发明人定义的活性.分子量降低活性也被称为支链淀粉分子量降低活性。在本说明书中，1U分子量降低活性被定义为，当酶在与BE活性的测量温度和pH相同的温度和pH下(优选酶的最佳反应温度和最佳pH)反应16小时时将1g底物(蜡质玉米淀粉)的Mw降至400kDa所需酶的量。例如按照下列方式测量分子量降〗氐活性.首先，将100^蒸镏水加入50mg蜡质玉米淀粉(WCS，由SanwaCornstarchCo"Ltd.制造)并且充分搅拌.随后，加入900^1二甲基亚砜，在沸水浴中搅拌20分钟。向其中加入8.91111蒸馏水，在沸水浴中另外搅拌10分钟。向这种溶液中加入100nl1MTris-HCl(pH7.5)或1M裤酸緩冲液(pH7.5)，搅拌并且用作底物溶液。将緩冲液的pH调至测量BE活性的pH。将底物溶液分成体积为800jiL/管。也就是说，每管含4mgWCS。1^，以合适量X^L/管加入适当稀释的BE溶液以及按(200-X)^L/管的量加入稀释剂来开始反应。将反应温度调至测量BE活性的温度。稀释剂是含0.05%TritonX-100的10mM磷酸钾緩冲液(将pH调至测量BE活性的pH)。当^时间达到16小时时，通it^P入1NHC1将M溶液的pH降至3-4，并且在100。C加热^Jl溶液10分钟来终止反应。对于BE的热稳定性非常低的情况，可以仅仅通过在100。C加热反应溶液10分钟来终止反应。M终止之后，通过0.45卞m过滤器过滤反应溶液，测量反应溶液中所含产物的Mw。调节BE的量，使得Mw落在2500kDa-200kDa范围内。Mw的测量通过下面"所产生葡聚糖的重均分子量(Mw)的测量方法"中描述的进行。将计算的Mw(kDa)的对数标注在纵轴(y-轴)上，而将使用的酶量(HL)标注在7jC平轴(x-轴)上，使用MicrosoftCorporation生产的软件MS-Excel绘制幂i^4以曲线(powerapproximationcurve)。也就是i兌，用方程y=cxb(c和b分别是常数)绘制近似曲线。通过将y=400(kDa)代入所得方程，计算将底物WCS(4mg)的Mw降至400kDa所需的酶量VIOiL)。通过将酶的量VIOiL)转换为每1g底物的酶量，计算1U分子量降低活性所需的酶量V2(mL)(=(VImL/1000)x(1000mg/4mg)(mL))。酶溶液的分子量降低活性El是单位分子量降低活性的倒数(E1=1/V2)(U/mL)。(BE活性)/(分子量降低活性)的上限为约500,更优选地为约400,又更优选为约300,进一步更优选为约200，最优选为约100。(BE活性)/(分子量降低活性)没有具体的下限。下限可以为约l或更大，约5或更大，或者约10或更大。(BE活性)/(分子量降低活性)为约500或更低的BE具有合成糖原能力的机制不是显而易见的。这种机制可能基于下面描述的原理，但是并不受这种原理的限制为了通过BE合成高分子量的a-葡聚糖，图1中显示的分子间分支反应必须以比环化反应和分子内分支反应更高的频率发生。利用低分子量直链淀粉作为底物实现高频率的分子间分支反应。不仅高频率的分子间分支反应，而且连续和优先使用分支分子作为底物也是必需的。所述分支分子，在维持它们的大的结构单元的同时，必须接受BE的作用。这参考反应模型(图11A)进行描述。首先，将2分子的直链淀粉转化为具有一个a-l,6-键的分子。随后，用所得分子作为底物产生具有两个a-l，6雀的分子。另外，通过优先使用所述分支分子作为底物，产生了少量大分子a-葡聚糖分子和大量低分子的分子。另一方面，对于不优先使用分支分子作为底物的BE,或者即使使用分支分子，当以破坏大结构单元的方式使用分支分子时，产生大量分支分子并且;f艮少产生进一步的大分子(图IIB)。当整个反应体系中a-l,6-键的百分比为约10-12%时，BE的反应在任一情况下都不再进行。在此描述BE的支链淀粉分子量降低作用。如日本专利No.3107358所示，通过使BE作用于支链淀粉的簇结构并且使之环化来引起这种反应。在这种情况下，BE作用于分支分子，从而环化所述簇结构连接中的单元链，同时维持大结构单元。因此，认为具有相对高的支链淀粉分子量降低活性的BE拥有优先使用分支分子并且用其作为反应底物、同时维持大结构单元的特性。另夕卜，根据本发明人的研究，所有目前已知的热稳定BE具有合成糖原的能力。另一方面，在最佳反应温度较低的中温BE中，存在不具有合成糖原能力的BE。具有合成糖原能力的BE优选地是热稳定BE。热稳定BE是指当在各种反应温度下进行BE活性测量时，最佳反应温度为45C或更高的BE。具有合成糖原能力的BE的最佳反应温度为约45"C或更高，和约901C或更低。在本说明书中，"最佳M温度"是指当只改变温度进行前面提到的BE活性测量时，BE活性最高的温度。最佳反应温度优选为约45C或更高，更优选为约50X:或更高，又更优选为约551C或更高，尤其优选为约60"或更高，最优选为约65"C或更高。尽管最佳反应温度没有上限，所述最佳反应温度优选为约卯"C或更低，更优选为约851C或更低，又更优选为约80t:或更低，尤其优选为约75TC或更低。具有合成糖原能力的BE更优选为来源于嗜热菌或中温性菌的BE。在本说明书中，"嗜热菌"是最佳生长温度为约501C或更高并且在约40"C或更低的温度下几乎不生长的微生物。嗜热菌分为中度嗜热菌和极度嗜热菌。"中度嗜热菌"是指最佳生长温度为约50"C-约701C的微生物。"极度嗜热菌"是指最佳生长温度为约701C或更高的微生物。极度嗜热菌中，最佳生长温度为约8ox:或更高的微生物称为"嗜高温菌"。相反，"中温性菌"是指最佳生长温度为常温环境的微生物，尤其是最佳生长温度为约20匸-约4ox:的微生物。产生具有合成糖原能力的BE的嗜热菌优选属于产液菌属、红嗜热盐菌属、芽孢杆菌属或嗜热聚球蓝细菌属。产生具有合成糖原能力的BE的中温性菌优选属于埃希氏菌属。具有合成糖原能力的BE更优选来源于选自下组的细菌风产液菌、嗜火产液菌、及/^^幼w附msMfl附e"s/s、海洋红嗜热盐菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、酸热芽孢杆菌、热坚芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、77rma$j;iigcA0c<cciisc/o"gfl似s和大肠埃希氏菌，进一步更优选来源于选自下组的细菌风产液菌、及/^^幼w附msM"附e附/s、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌和大肠埃希氏菌。请注意，近来经常将芽孢杆菌属的嗜热菌描述为G^^"7/"s菌属的细菌。例如，嗜热脂肪芽孢杆菌细菌是与G6fl"7/"s他flra幼e環o/;緒"s相同的细菌。在本说明书中，酶"来源于"某种生物的事实不仅意味着直接由该生物分离所述酶，而且表示以任意形式利用所述生物来产生所述酶。例如，对于从已经导入编码所述酶的基因的大肠埃希氏菌中分离该酶，其中所述酶来源于一种生物，在此情况下所述酶"来源于"所述生物。SEQIDNO:1显示了编码来自风产液菌VF5的野生型BE的磁J^序列，SEQIDNO:2显示了其M酸序列。在本说明书中，"野生型"BE不仅包括从原始生产BE的细菌所分离的BE,而且包括通迚基因重组得到的、与野生型BE具有相同^酸序列的BE。非专利文献8和vanderMaarel，M.J.E.C.ef/.，^/ocflfa/ysisflwrf5《V^ni/is/tff7MflftV/j，2003,Vol.21，pp.199-207中描述了克隆编码来自风产液菌VF5的野生型BE的磁J^序列的方法。来源于风产液菌的BE具有核^好的产生糖原的性质，特别是从多种Mn的底物。SEQIDNO:3显示了编码来自W/w&说"w"sW"附ews/sJCM9785的野生型BE的磁J^序列，SEQIDNO:4显示了其M酸序列。非专利文献11和专利文献3中描述了克隆编码来自Wa附e朋/sJCM9785的野生型BE的>5^^序列的方法。SEQIDNO:5显示了编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的磁J^序列，SEQIDNO:6显示了其^J^酸序列。非专利文献9和12中描述了克隆编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的野生型BE的碱基序列的方法。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的BE具有极好的生产糖原的性质，特别是从低分子量底物。请注意，在芽孢杆菌属和埃希氏菌属的细菌中，除了ATG之外，也使用TTG和GTG作为起始密码,因此，SEQIDNO:5中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成甲M酸。当利用含SEQIDNO:序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，l位的T通常被A代替。SEQIDNO:7显示了编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BE的磁J^序列，SEQIDNO:8显示了其^J^酸序列。Kid，J.A.K.W.Wa/"Mo/.Ge".1991，230:pp.136-144和EP0418945B1中描述了克隆编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌1503-4R变种4的野生型BE的>5*<^序列的方法，SEQIDNO:7中1-3位的TTG起到起始密码子的作在其它生物中表达BE时，l位的T通常被A代替.SEQIDNO:9显示了编码来自热速芽孢杆菌IF015315的野生型BE的磁J^序列，SEQIDNO:10显示了其^J^酸序列。SEQIDNO:9中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成曱琉氤酸。当利用含SEQIDNO:9磁J^序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，1位的T通常被A代替。SEQIDNO:11显示了编码来自热链形芽孢杆菌的野生型BE的碱基序列，SEQIDNO:12显示了其^J^酸序列。SEQIDNO:11中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成甲减歲酸。当利用含SEQIDNO:11M序列的核酸分子在其它生物中表达BE时，1位的T通常被A代替。SEQIDNO:13显示了编码来自热溶芽孢杆菌IF015313的野生型BE的>^>序列，SEQIDNO:14显示了其^J^^列。SEQIDNO:13中1-3位的TTG起到起始密码子的作用并且被翻译成曱减裊酸。当利用含SEQIDNO:13的>^序列的核酸分子在其它生物中表达8￡时，1位的T通常被A代替。SEQIDNO:15显示了编码来自T/re簡仍戸ec/roc0cc"s^mgfl似sBP-1的野生型BE的M序列，SEQIDNO:16显示了其M酸序列。SEQIDNO:17显示了编码来自大肠埃希氏菌W3110的野生型BE的磁基序列，SEQIDNO:18显示了其M酸序列。当利用含SEQIDNO:7^^序列的核酸分子这些野生型BE的减基序列和^J^酸序列是举例说明性的，并且知道可以天然发生与这些序列有微小变化的序列的变体(所谓等位基因变体)。除了含有这些示例性序列的BE之外，这些天然发生的变体和通过人工突变野生型BE产生的变体可以用于本发明的方法中，只要它们具有合成糖原的能力。例如，小册子WO2000/058445和专利文献3描述了来源于及/^fifW/^i7ii附oAflweiisi's的BE变体。BE变体优选具有与^j^前BE相同或高于它的活性。例如在某种实施方案中，用于本发明的BE的M酸序列可以与选自下组的"ll^酸序列(即参考M酸序列)相一致(即100%—致性)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16和SEQIDNO:18;或者在另一个实施方案中，与参考^J^酸序列相比，这种M酸序列可以改变某些数目的氨基酸。这种改变可以选自缺失、替换(包括保守和非保守替换)或插入至少1个(优选1个或几个)氨基酸。这种改变可以发生在参考^^酸序列的氛基端或氣基端，或者可以发生在不同于这些末端的任意位置。氨基酸残基的改变可以是单个残基散布，或者几个残基可以连续。本领域的技术人员可以轻松地选择具有期望特性的BE。作为替代，编码目标BE的基因可以直接化学合成。这种化学合成的方法在本领域是熟知的。可以使用本领域熟知的方法进行对BE的修饰，例如通过进行定点突变，用诱变剂的突变(用诱变剂如亚硝酸盐处理对象基因，或用紫外线处理)或易错PCR。从容易获得目标突变体的角度来看优选使用定点突变，因为当使用定点突变时可以将目标修饰在目标位点导入。作为替代，可以直接合成含有目标序列的核酸分子。这种化学合成方法在本领J^bi熟知的。定点突变技术例如在NucleicAcidsResearch,Vol.10，pp.6487-6500(1982)中描述。对于前述修饰的设计，可以考虑氨基酸的疏水性指数。疏7jCiJ^酸指数对赋予蛋白质相互作用生物功能的意义在本领域是普遍被认知的(Kyte,JandDoolittle,R.F.J.所o/.157(1):105-132,1982)。^J^酸的疏水性质有助于所产生蛋白质的二级结构，并且随后定义蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)之间的相互作用。基于氨基酸的疏水性和其电荷性质分配氨基酸的疏水性指数。它们是异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);曱硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(~0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9)和精氨酸(4.5)。本领域熟知的是，用含有相似疏水性指数的另一种M酸替换某种氨基酸，从而可以产生仍然具有基4^目似生物功能的蛋白质(例如酶活性基本相同的蛋白质).这些M酸替换中，疏水性指数优选在±2以内，更优选在土l以内，又更优选在±0.5以内。本领域内应该理解，这种基于疏水性的M酸替^A高效的。如USPNo.4,554,101中描述的，下面的亲水性指数分配给絲酸絲精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0士l);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(~0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。应该理解，氨基酸可以用具有相似亲水性指数的另一种M酸替换，并且仍可以提供生物等价物。在这些M酸替换中，亲水性指数优选在±2以内，更优选在士l以内，又更优选在士0.5以内。本发明中，"保守替换"是指在M酸替换中、在原始M酸和待替换Jl&酸之间亲水性指数或/和疏水性指数相似的替换，如上所述。保守替换的实例对本领域的技术人员是熟知的，并且包括但不限于以下各组中的替换，例如精氨酸和赖氨酸；g和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬St^;以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。用于本发明方法中的BE可以从产生BE的天然存在微生物中分离。野生型BE可以例如从风产液菌VF5、嗜热脂肪芽孢杆菌或类似细菌中分离。为了举例说明从嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14分离BE的过程，首先，将嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14接种到适当的培养基中(例如L肉汤(1%胰蛋白胨(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.，USA),0.5%Bacto画酵母提取物(Difco),0.5%NaCl，pH7.3)，在约50匸國约60"C过夜振荡培养.随后，将这种培养物离心来收集微生物细胞。将得到的细胞沉淀物悬浮在20mMTris-HCl緩冲液(pH7.0)中，随后通itj适声破碎得到无细胞提取物。在约60°C的水浴中加热所述无细胞^:取物约30分钟。加热之后，用离心机(Beckmann制造的AVANTIJ-25I)离心所述无细胞提取物来除去不溶解的蛋白质，并由此得到上清液。所得上清液通过预先平衡的阴离子交换树脂Q-S印harose，使BE被吸附到树脂上。用含100mM氯化钠的緩冲液洗涤树脂来除去杂质.随后，用含400mM氯化钠的緩冲液洗脱BE,得到来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的BE酶溶液.当需要进一步纯化时，如果需要可以通过组合以下分级分离来获得含来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的BE的溶液SephacrylS-加0HR(Pharmacia制造)等的凝胶过滤色镨、或者Phenyl-TOYOPEARL650M(TosohCorporation制造)等的疏水色语。来源于其它微生物物种的BE的纯化也可以通过同样的方式进行。作为替代，用于本发明方法的BE可以如下获得将含有编码BE碱基序列的核酸分子导入适当的宿主细胞中来表达BE，并且从所述宿主细胞或其培养液中纯化所表达的BE。用胰蛋白酶处理这样得到的纯化BE,通过HPLC分离所得胰蛋白酶处理的片段，使用肽序列分析仪确定任意分离肽片段的N端氨基酸序列。随后，使用基于所鉴定氨基酸序列而制备的合成寡核苷酸探针，筛选适当的基因组文库或cDNA文库，从而可以得到包含编码野生型BE的碱基序列的核酸分子(也称为基因)。制备寡核苷酸探针和DNA文库、以及通过核酸杂交筛选它们的基本策略对本领域的技术人员是熟知的。例如,见Sambrook&Mo/ecw/flrC7纖Vig:爿Z^6omtofjMfl朋fl/(1989);C7om7ig，VolumesIandII(editedbyD.N.Glover,1985);6V/g朋t/c/融Vfe5^"^s/s(editedbyM.J.Gait，1984);andiVMc/"'c场6"VZ/加ftVm(editedbyB.D.Hames&S.J.Higgins，1984)。作为替代，基于与某种BE基因磁基序列的同源性，对该BE基因所编码BE的磁基序列是已知的，可以利用包含至少一部分这种>8*1^序列的核酸探针通过杂交来进行筛选，从而获得含有另一种BE基因的核酸分子。这种方法在本领J^A已知的。作为替代，制备对应于多种BEM酸序列中保守区域的简并引物，进行PCR,可以获得所述BE的磁《^序列。这种方法在本领^U1已知的。筛选基因组文库时，可以使用本领域技术人员熟知的方法亚克隆所得的核酸分子。例如，通过混合含有目标基因的X噬菌体、适当的^埃希氏菌和适当的辅助噬菌体，可以容易地得到含有目标基因的质粒。此后，通过使用^^有所述质粒的溶液转化适当的大肠埃希氏菌，可以亚克隆目标基因。通过培养所得转化体，可以得到质粒DNA,例如通it^性SDS方法，并且可以确定目标基因的M序列。确定^5il^序列的方法是本领域的技术人员熟知的。另夕卜，使用基于DNA片段的^序列合成的引物，利用聚合S^式反应(PCR)，利用例如风产液菌、及/^^^mw附M"附e"^、嗜热脂肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌等的基因组DNA作为模板，可以直接扩增BE基因。作为替代，还可以基于已知^序列化学合成BE基因(编码H^酸序列例如SEQIDNO:2，4，6，8，10，12，14，16或18的>!^序列(例如，SEQIDNO:1，3,5,7,9,11,13，15或17的>5^序列))。编码用于本发明方法中BE的M酸序列的M序列，与编码上述参考M酸序列的核苷酸序列(即参考核苷酸序列)相比，可以改变某些数目的核苷酸。这种改变可以选自缺失至少一个核苷酸、用至少一个核苷酸替换，包括转换和颠换、或者插入至少一个核苷酸。这种改变可以在参考核苷酸序列的5'端或3'端发生，或者可以在其它位置发生。碱基的改变可以是单个g散布或者可以几个M连续。核苦酸改变可以在编码序列中产生无义、错义或移码突变，因此，可以进行由这种改变M序列所编码BE的改变。当两种M酸序列彼此直接比较时，这些M酸序列优选在这些M酸序列之间是一致的，典型地至少约2oy。的M酸，优选至少约30%，更优选至少约40%，又更优选至少约50%,尤其优选至少约60%，约70%，约80%,约90%，约95%,约96%，约97%，约98%或约99%。在本说明书中，使用GENETYX-WINVer.4.0(GeneticsCo"Ltd.)的最大匹配来计算序列的一致性百分比。这个程序比对待分析的序列数据、和待比较的序列数据，使得序列间匹配的^J^酸对最多，同时考虑替换和缺失，从而得到匹配、错配和间隙各自的评分，计算总和，输出最小总和的比对，并计算一致性(参考Takashi，K.，andGotoh,O.1984.SequenceRelationshipsamongVarious4.5SRNASpeciesJ.Biochem.92:1173-1177)。在本说明书中，使用GENETYX-WINVer.4.0的最大匹配在匹配--1;错配=1;间隙=1;*N+=2的糾下来计算序列的一致性百分比。作为野生型酶或核酸分子，如本说明书中具体描述的(例如，SEQIDNOS:1,2等)，可以4吏用具有与所述BE的^J^酸序列或编码所述BEM酸序列的4序列不一致、但是同源的序列的酶或核酸分子。这种与野生型酶或核酸分子同源的酶或核酸分子，当在GENETYX-WINVer.4.0的最大匹配中在上述条件下比较时，对于核酸，包括但不限于包含与比较对象序列有至少30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95。/。或约99"M)—致性的磁J^序列的核酸分子；对于酶，包括但不限于具有与比较对象序列有至少约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约卯％、约95%或约99%—致性的#^酸序列的酶。与由选自序列表中所列出SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17的磁J^序列组成的核酸分子在严谨条件下杂交的核酸分子所编码的BE可以用于本发明的方法中，只要所述BE具有合成糖原的能力。本发明的方法还可以使用由包含修饰>5^^序列的核酸分子编码的BE，只要所述BE具有合成糖原的能力，其中所述修饰>^序列通过,与由选自序列表中所列出SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17的^J^序列组成的核酸分子在严谨条件下杂交的核酸分子而得到。本领域的技术人员可以很容易地选择期望的BE基因。如本文所用的，术语"严谨条件"是指在此条件下序列与特异性序列杂交、但不与非特异性序列杂交的条件。本领域技术人员熟知合适严谨^Hf的选择，并且在例如MolecularCloning(Sambrook^etal"supra)中描述.具体来说，所述条件例如意味着，可以使用这种条件来鉴定多核苷酸，在所述条件下，利用已经固定了来源于菌落或噬斑的滤膜在溶液中在65°C进行杂交，其中所述溶液包含50%曱^、5xSSC(750mMNaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt，s溶液(0.2%BSA，0.2%Ficoll400和0.2%聚乙烯吡咯烷酮)、10%硫酸葡絲和20ng/ml变性剪切的鲑精DNA，并在65。C用0.1-2倍浓度(l倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠和15mM杵檬酸钠)的SSC(氯化钠-柠檬酸钠)溶液的条件下清洗滤膜。用来生产本发明方法所用BE的核酸分子可以是相对于包含编码野生型BE碱基序列的核酸分子被保守性修饰的核酸分子。"相对于包含编码野生型BE碱基序列的核酸分子被保守修饰的核酸分子"是指包含编码与野生型BE氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的碱基序列的核酸分子。"与野生型BE所编码氨基酸序列基本相同的氨基酸序列"是指具有与野生型BE酶活性基本相同的酶活性的氨基酸序列。由于遗传密码的筒并性，很多功能等同的碱基序列编码指定的氨基酸序列。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在用GCA密码子表示丙氨酸的所有位置，所述密码子可以变为GCC、GCG或GCU,而不改变所编码的丙氨酸。类似地，对于可以由多个密码子编码的氨基酸，在由密码子表示氨基酸的所有位置，所述密码子可以变为任意另一种编码所述氨基酸的密码子，而不改变所编码的具体氨基酸。碱基序列的这种变异是"沉默突变"，是一种保守性修饰突变。本发明说明书中编码多肽的所有碱基序列还包括所述核酸的所有可能的沉默突变。沉默突变包括所编码氨基酸不改变的"沉默替换"和核酸最初不编码氨基酸的情况(例如，内含子部分的突变、其它未翻译区的突变等)。当某种核酸编码氨基酸时，沉默突变与沉默替换的意义相同。在本说明书中，"沉默替换"是指在碱的碱基序列.基于遗传密码中的简并性现象，在存在多个碱基序列编码特定氨基酸(例如甘氨酸等)的情况下，这种沉默替换是可能的。因此，具有由沉默替换产生的碱基序列所编码氨基酸序列的多肽与原始多肽具有相同的氨基酸序列。本领域中，应该理解，为了生成功能等同的分子，可以修饰核酸中的各个密码子(除了通常编码曱硫氨酸的唯一密码子AUG和通常编码色氨酸的唯一密码子TGG之外)。因此，编码多肽的核酸的每种沉默突变隐含地包括在每个描述的序列中。优选地，可以进行这种修饰，使得避免替换半胱氨酸，其是严重影响多肽构象的氨基酸。用于本发明中编码BE的碱基序列可以改变为符合生物中的密码子偏好，所述生物中导入所述序列用于表达。密码子偏好反映了在所述生物中高表达的基因中的偏好。例如，打算在大肠埃希氏菌中表达时，可以根据公开的密码子偏好表使序列对在大肠埃希氏菌中表达最优化(例如，Sharp,etal.，NucleicAcidsResearch16，No.l7，p.8207(1988》。使用包含上述修饰的碱基序列的核酸分子可以制备表达载体。本领域技术人员熟知那些利用特定核酸序列制备表达载体的方法。当本发明说明书中提到核酸分子时，"载体"是指可以将目标碱基序列转移至目标细胞中的核酸分子。这种载体的实例包括可以在目标细胞中自主复制、或者可以整合入目标细胞染色体的载体，并且在适于转录修饰碱基序列的位置具有启动子。在本说明书中，所述载体可以是质粒。如本文所用，"表达载体"是指可以在目标细胞中表达修饰碱基序列(即编码修饰BE的碱基序列)的载体。除了修饰碱基序列之外，表达载体还包含多种调控元件如调节其表达的启动子，如果需要，还包含在目标细胞中复制和选择重组体(例如复制起始(ori)，选择标记如药物抗性基因)必需的因子。在表达载体中，修饰碱基序列是可操作连接的，以便转录和翻译，调控元件包括启动子、终止子和增强子。另外，打算向细胞外分泌表达的酶时，编码分泌信号肽的碱基序列以正确的阅读框位于修饰碱基序列的上游。本领域技术人员熟知用于导入特定生物(例如细菌)的两种类型表达载体、和用于表达栽体中的调控元件和其他因子的类型，可以根据目标细胞而改变。如本文中所用，"终止子"是位于蛋白质编码区域下游的序列，并且参与终止通过将碱基序列转录为mRNA的转录，以及polyA序列。已知终止子通过参与mRNA的稳定性来影响基因的表达水平。如本文中所用，"启动子"是指DNA上确定基因转录起始位点并且还直接调控转录频率的区域，它是RNA聚合酶结合的碱基序列，从而启动转录。由于启动子的区域在很多情况下通常是假想蛋白质编码区域的第一外显子上游约2kbp或更小的区域，当使用DNA分析软件预测基因组碱基序列中的蛋白质编码区域时，可以推断启动子区域。推断的启动子区域随着每个结构基因而变化，并且通常是在结构基因的上游，但不限于此，并且可以在结构基因的下游。优选地，推断启动子区域是第一个编码顺序翻译起始点上游约2kbp或更小的区域。如本文中所用，"增强子"可以用来增强目标基因的表达效率。这种增强子在本领域是熟知的。可以使用多个增强子，或只使用一个增强子，或者根本不使用。如本文中所用，"可操作连接"是指期望碱基序列置于转录和翻译调控序列(如启动子、增强子等)或影响表达(即操作)的翻译调控序列之下。为了使启动子与基因可操作连接，通常将启动子安排在基因的立即上游，但是不需要将启动子与所述基因邻接。为了使修饰核酸序列可操作连接至前面提到的调控元件，在一些情况下应该加工目标BE基因。实例包括启动子和编码区之间距离过长、并且预期转录效率降低的情况，核糖体结合位点和翻译起始密码子之间距离不适当的情况等。加工手段的实例包括用限制酶消化、用核酸外切酶如Bal31和ExoIII消化、或者利用单链DNA如M13或PCR引入定点突变。随后，将如上所述制备的表达载体导入细胞，从而表达BE。如本文中使用的，酶的"表达"是指编码所述酶的碱基序列在体内或体外的转录或和翻译，以及所编码酶的生产。导入表达载体的细胞(也称为宿主)包括原核生物和真核生物。考虑各种条件如易于表达BE、易于培养、生长速率和安全性，可以很容易地选择导入表达载体的细胞。例如，当BE用于合成糖原时，由于优选BE不含淀粉酶污染，优选使用不产生淀粉酶或只生产低水平淀粉酶的细胞。这种细胞的实例包括细菌和真菌。更优选细胞的实例包括中温性微生物(例如大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌(5""7/"s#&//i's))。细胞可以是微生物细胞，或者可以是植物或动物细胞。根据所使用的细胞，本发明的酶可以是经过翻译后加工的酶。在本发明的方法中，将表达载体导入细胞的技术可以是任意本领域已知的技术。这种技术的实例包括例如转化、转导和转染。这种导入核酸分子的技术在本领域是熟知的，并且是常规技术，并且例如描述于AusubelF.A.，etal.ed.(1988),CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,NewYorKNY;SambrookJ,etal.(1987)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,和别册实验医学《遗传子导入和发现解析实验法》羊土社，1997(BessatsuJikken-igaku"Idenshidounyu&Hatsugenkaisekijikkenhou",Yodosha，1997)。(2.底物)在本发明中，使用聚合度为4或更高的、主要由a-l，4-葡萄糖苷键连接的a-葡聚糖作为底物。在本说明书中，"a-葡聚瞎"是指包含D-葡萄糖作为结构单元、并1且具有至少2个或更多由a-l，4-葡萄糖苷键连接的葡萄糖瓶基的糖。a-葡聚糖可以是直链、支链或环状分子.直链a-葡彩瞎与a-l，4-葡聚糖的意义相同。直链a-葡彩瞎中，葡萄糖^^仅用a-l，4-葡萄糖苦键连接。包含一个或多个a-l,6-葡萄糖苷键的a-葡l^是支链a-葡聚糖。a-葡聚糖优选包含某种程度的直链节段.更优选没有分支的直链a-葡聚糖。在本说明书中，"主要用a-l，4-葡萄糖苷键连接"意味着，葡萄糖残基主要用a-l，4-葡萄糖苷键连接。术语"主要"意味着，a-l，4-葡萄糖苷键占葡萄糖^^之间键的50%或更多。除了a-l，4-葡萄糖苷键^卜，葡萄糖残基之间的键可以是任意键，通常是a-l，6-葡萄糖苷键.在一些情况下优选使用含有少量分支(即a-l，6-葡萄糖苷键的数量)的a-葡聚糖作为底物。在这种情况下，每个分子中分支数目典型地为约0-约100，优选为约0-约50，更优选为约0-约25，约O-约IO,约0-约5,进一步优选为约0。a-l，6-葡萄糖苷键可以在a-葡聚糖内随机分布，或者可以均匀分布。优选在a-葡聚糖内形成5个或更多个葡萄糖残基的直链部分的分布。用作本发明的底物的a-葡聚糖的聚合度为4(分子量666)或更大。作为底物的a-葡聚糖可以是均匀分子量的纯物质或含有各种分子量的分子的混合物。除了底物之外，可以将含不作为底物的葡萄糖的混合物加入溶液。工业上，通常使用含有各种分子量的分子的混合物用作原糖。反应开始前溶液中糖的Mn大于约180，优选地约181或更大，更优选约182或更大，又更优选约183或更大，甚至更优选约184或更大，进一步更优选约185或更大。反应开始前溶液中糖的数均分子量可以例如是约l卯或更大，约195或更大，约200或更大，约250或更大，约300或更大，约350或更大，约400或更大，约450或更大，约500或更大，约550或更大，约600或更大，约650或更大，约700或更大，约750或更大，约800或更大，约850或更大，约卯0或更大，约950或更大，约1,000或更大，约1,500或更大，约2,000或更大或者约2,500或更大。葡萄糖(分子量180)或聚合度为3或更小的a-葡彩瞎不能作为BE的底物，但是聚合度为4或更大的a-葡彩瞎可以作为BE的底物。将大量葡萄糖加入少量底物中(例如，聚合度为4的那些)，混合物的Mn接近180。即使反应开始前溶液中糖类的Mn接近180,当存在聚合度为4或更大的a-葡聚糖时即能发生反应。因此，即使反应开始前溶液中糖的Mn接近180，只要溶液中包含聚合度为4或更大的a-葡彩瞎，所述溶液可以在反应中使用。本发明中用作底物的a-葡聚糖的分子量没有上限。反应开始前溶液中糖的Mn为约150,000或更小，优选约120,000或更小，更优选约IOO，OOO或更小，又更优选约80,000或更小，进一步更优选约50,000或更小，甚至更优选约20,000或更小，甚至更优选小于约8，000，最优选小于约4,000。具体而言，当^^M氐分子量a-葡聚糖的溶液用作底物时，其中反应开始前溶液中糖的Mn为约1,500或更大并且小于约4,000,其优势在于，可以非常容易地得到Mw为l，OOO,OOO或更大的高度分支的a-葡聚糖，其高度可溶于水，并JL^"支链淀粉酶和a-淀粉酶有高抗性。在本发明中用作底物的a-葡聚糖可以仅由D-葡萄糖组成，或者可以是经过一定程度修饰的衍生物，其中BE的反应速率不降至20%或更低。a-葡聚糖优选不被修饰。在本发明中用作底物的a-葡聚糖可以是天然直链淀粉，优选脱支淀粉，脱支糊精或SI^合成的直链淀粉。在一些情况下，天然直链淀粉含有一些分支结构。在脱支反应不充分的一些情况下，脱支淀粉和脱支糊精也含有一些分支结构。脱支淀粉可以是通过本领域已知的用异淀粉酶或支链淀粉酶降解淀粉得到的产物。用于得到脱支淀粉的淀粉的实例包括地下Underground)淀粉例如马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉和野葛淀粉；地上(above-ground)淀粉例如玉米淀粉(蜡质玉米淀粉、高直链玉米淀粉等)、小麦淀粉、大米淀粉(例如，蜡质大米淀粉、非蜡质大米淀粉)，西米淀粉和豆子淀粉。脱支淀粉廉价、容易获得，因此尤其优选。还优选使用高直链玉米淀粉的a-l，6-葡萄糖苦键切割产物。(3.其它酶)(i,4-a-葡絲基转移酶)本发明的生产方法可以进一步包括这种步骤使4-a-葡聚糖基转移酶在溶液中作用于聚合物度为2或更高的a-葡IMt，其中反应开始前溶液中糖的Mn大于180并且小于1,500，从而生产所述底物。本发明的生产方法中，4-a-葡IMt基转移酶可以与BE共存。可用于本发明的4-a-葡IMt基转移酶是将葡萄糖基或由两个或多个葡萄糖组成的单元从供体分子的非还原端转移至受体分子的非还原端。因此，这种酶反应导致最初提供的麦芽寡糖的聚合度不均匀。当供体分子和受体分子相同时，引起分子内转移，结果是得到具有环状结构的产物。基于它们的一级结构将4-a-葡^t基转移酶分为下面的6种类型类型I、II、III、IV、V和其它(Takaha，T.andSmith,S.M.Biotechnol.Genet.Eng.Rev.Vol.16，pp.257-280(1999))。类型I称为环糊精葡IMt基转移酶(在下文中称为CGTase，CGT酶)(EC2.4.1.19)。类型II也称为歧化酶、D-酶、淀粉麦芽糖酶等(EC2.4.1.25)(在下文中称为MalQ)。类型III是糖原脱支酶，也就是同时具有4-01-葡|^基转移酶活性和淀粉-1,6-葡萄糖苷酶活性的酶(EC3.2.1.33+EC2.4.1.25)。来源于嗜高温细菌的4-a-葡IMt基转移酶被分类为类型IV和V。一些没有得到一级结构信息、但是报道了4-a-葡m^基转移酶活性的酶分类为"其它"。4-a-葡聚糖基转详多酶活'性可以基于Terada"a/.(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,Vol.65，pp.910-915(1999))来确定。根据4-a-葡聚糖基转移酶的特性，可以调节测量的反应温度、反应pH等。4-a-葡絲基转移酶存在于微生物和植物中。产生4-a-葡絲基转移酶的微生物的实例包括风产液菌、肺炎链球菌(5^印to""Ms/me/m<m/fle)、贝氏梭菌(C7tf血VZ/m附6m妙'cm附)、耐放射异常球菌(D"VfococcMsra力Wwm"s)、流感嗜血菌CHa側o/7緒MSZ/iyw^zfle)、结核分枝軒菌(Afya^"cten'M挑ft^mi/os/s)、T^f附oc0cc"s份ra/Zs、海栖热袍菌(7^fTMtfto^！附anW歸)、那不勒斯栖热袍菌(77ie簡0togflwea"//towfl)、鹨鵠热衣原体(C似tf附j^fl/w//toc/)、火球菌属(iVw^ccwssp.)、嗜热网球菌(ZWc一g/柳MS幼e環o/7M"附)、布氏疏螺旋体(5oireZ/fl6"fg^w/m〕、集胞蓝细菌物种(5ywec/i仍j^/ssp.)、大肠埃希氏菌(五.酿酒酵母(iyflccAara附ycescwev/s/fle)、7JC生栖热菌、嗜热栖热菌(7"Amn"s幼w附印/h7附)等。产生4-a-葡^t基转移酶的植物的实例包括块茎和块根植物例如马铃薯、甘薯、山药和木薯；谷类例如玉米、大米和小麦以及豆类例如豌豆和大豆。产生4-a-葡l^基转移酶的生物不限于这些。4-a-葡IMt基转移酶可以商业获得或者可以通过本领域已知的方法从这些生物中制备，或者可以使用这些生物的脱支酶基因用基因重组方法制备。可以使用任意本领域已知的4-a-葡IMt基转移酶.CGT酶(EC2.4.1.19)也是一种4-a-葡fMt基转移酶，并且可以用在本发明的生产方法中.可以用在本发明中的CGT酶是能够催化麦芽寡糖的糖基转移反应(歧化反应)的酶。CGT酶是一种酶，其识别供体分子的非还原端6-8个葡萄糖的链并且影响转移M使得这个部分环化，从而形成聚合度为6-8的环糊精和无环的极限糊精。作为CGT酶，可以使用熟知的来源于微生物的CGT酶或者市售的CGT酶.优选地，可以使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的商品CGT酶((林)林原生物化学研究所，冈山)、来源于浸麻芽孢杆菌(5fl"7/附附flcmms)的CGT酵(商品名Contizyme，AmanoPharmaceuticalCo.,Ltd"3经(^3)或者来源于嗜碱芽孢忏菌种04汰《^/^//|5""7/附sp.)A2-5a的CGT酶。更优选地，可以使用来源于嗜碱芽孢杆菌种A2-5a的CGT酶。嗜碱芽孢杆菌种A2-5a是日本特许公开No.7-107972公开的在碱性范围具有高活性的生产CGT酶的菌抹，并且申请人已经在日本产业技术研究院、日本国家生物科学与人类科技研究所以保藏号No.FERMP-13864保藏。产生CGT酶的生物不限于这些。CGT酶可以是市售产品，或者可以通过本领域已知的方法从这些生物制备，或者可以使用这些生物的CGT酶基因用基因重组方法制备。可以使用任意本领域已知的CGT酶。在本发明的生产方法中，优选使用CGT酶以外的4-a-葡IPt基转移酶。当CGT酶以外的4-a-葡聚糖基转移酶与BE共存时，与CGT酶与BE共存的情况相比，糖原的产率显著改善。4-a-葡聚糖基转移鲦阮选与BE—起加入。然而，4-a-葡聚糖基转移酶可以在加入BE之前或之后加入，只要不对所产生糖原的分子量和产率有不利影响。当4-a-葡^l基转移酶与BE共存时，与单独4吏用BE的情况相比，糖原的产率显著改善.(ii.Mn大于180并且小于1,500的a-葡IMt)当Mn大于180并且小于1,500的a-葡^t是单一物质时，所述a-葡彩瞎的实例包括聚合度为2-9的麦芽斜奮。所述a」葡IMt优选聚合度为3-8的麦芽^t，更优选聚合度为3-7的麦芽勤备，又更优选聚合度为4-6的麦芽*#，尤其优选聚合度为4-5的麦芽M,最优选聚合度为4的麦芽絲。当Mn大于180并且小于1,500的a-葡IMt是混合物时，所述混合物的实例包括包含聚合度为4-12的麦芽M的混合物。除了聚合度为4-12的麦芽*#之外，Mn大于180并且小于1,500的a-葡IMt可以包含低分子量糖例如葡萄糖。Mn大于180并且小于1,500的a-葡^t优选包含聚合度为4-7的麦芽^#，并且更优选是聚合度为4-7的麦芽M。聚合度为4-7的麦芽寡糖还可以分别称为麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖。(iii.脱支酶)本发明的生产方法还可以包括^Jt支酶作用于Mn为500或更高的低分支a-葡聚糖的步骤，从而生产底物。脱支酶是可以切割a-l,6-葡萄糖苷键的酶。脱支酶分为两种，异淀粉酶(￡€3.2.1.68)和(1-糊精-内-1,6-01-葡糖苦酶(也称为支链淀粉酶)(EC3.2.1.41)，所述异淀粉酶良好地作用于支链淀粉和糖原，所述a-糊精内-1,6-a-葡糖苦酶良好地作用于支链淀粉(pullulan)。本发明的方法中既可以使用异淀粉酶也可以使用支链淀粉酶。脱支酶可以用于从廉价材料例如淀粉来生产主要由a-l，4-葡萄糖苷键连接的、聚合度为4或更高的a-葡^t。脱支酶活性可以基于Yokobayashi"/(说Vc/h附.Jcto，vol.212，pp.458-469(1970))来确定。根据脱支酶的特性，可以调节测量的反应温度、反应pH等。脱支酶存在于微生物、原核生物和植物中。产生脱支酶的微生物的实例包括酿酒酵母和衣藻属(CMfl挑j^fo附卵flssp.)。产生脱支酶的原核生物的实例包括短芽孢杆菌(5fl"7/m6mv/s)、酸性普鲁蓝芽饱杆菌(5fl"'"msa"V/fl>/w//m(vft'cms)、浸麻芽抱扦菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、环状芽孢杆菌(Ai"7/wscz>cm/"ws)、7jc生栖热菌、肺炎克雷伯氏菌(i/e6s/e/to/meif附0m'ae)、嗜温高温放线菌(rAerai做"/wo考ces说a(pfl^i7"s)、产乙醇热厌氧杆菌(rto腳fl"fl卿6actere幼fl朋ft'c"s)、介支淀粉假单胞菌(i^"flto附tf"fls鹏卢^ifera挑仍fl)、气味黄軒菌(/7flvoAflcter/"附0&m似附)、黄杆菌种(尸fl/vo^ctew'M附sp.)、逸纤维菌种(Q7top/iflgasp.)、^^埃希氏菌、嗜酸热疏化叶菌(5W(/i/o6iisaciV/ocflWflWifs)、Sw(/b/o6附toAwdfl//、疏碌矿疏化叶菌(S"(^/oA"sso(^i似f/c"s)、/rflAwims/s1,产生脱支酶的植物的实例包括马铃薯、甘薯、玉米、大米、小麦、大麦、燕麦和甜菜。产生脱支酶的生物不限于这些。脱支酶可以是市售的或者可以通过本领域已知的方法从这些生物制备，或者可以使用这些生物的脱支酶基因用基因重组方法制备。可以使用任意本领域已知的脱支酶。脱支酶优选在加入BE之前加入反应溶液。(iv.Mn为500或更大的低分支a-葡^t)Mn为500或更大的低分支a-葡IMt可以是天然a-葡聚糖。在本说明书中，"低分支"是指分支的频率低。低分支a-葡聚糖可以不含分支。在低分支a-葡聚糖中，假定a-l，6-葡萄糖苷键为1,a-l，4-葡萄糖苷键的数目相对于a-l,6-葡萄糖苦键的数目的比率优选为约10-约10000,更优选为10-约5000,进一步优选约15-约1000,进一步优选约20-约600。Mn为约500或更大的低分支a-葡聚糖的实例包括淀粉、直链淀粉、支链淀粉和它们的衍生物，或者它们的部分降解产物。淀粉的实例包括地下淀粉例如马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉和野葛淀粉和地上淀粉例如玉米淀粉(蜡质玉米淀粉、高直链玉米淀粉等)、小麦淀粉、大米淀粉(例如，蜡质大米淀粉、非蜡质大米淀粉)，西米淀粉和豆子淀粉。直链淀粉的实例包括从这些淀粉分离的直链淀粉。支链淀粉包括从这些淀粉分离的支链淀粉。Mn为500或更大的低分支a-葡聚糖在本领域是已知的并且易于得到。(4.生产糖原的方法)在本发明的生产方法中，例如，使用具有合成糖原能力的BE、底物(即，主要由a-l,4-葡萄糖苷键连接的、聚合度为4或更高的a-葡聚糖)、緩沖剂和溶解它们的溶剂作为主要材料。所有这些材料通常在反应开始时加入，但是在这些材料中，可以在反应期间另外加入任意材料。如上所述，在本发明的生产方法中，必要时可以使用Mn大于180并且小于1,500的a-葡聚糖和4-a-葡聚糖基转移酶。在本发明的生产方法中，还可以使用Mn为500或更大的低分支a-葡聚糖和脱支酶。本领域的技术人员很容易理解，可以通过适当选择本发明的生产方法中使用的底物量、酶量、反应时间等来得到具有期望分子量的a-葡絲，相对于反应开始时溶液中的a-葡聚糖，反应开始时溶液中含有的BE量典型地为约100U/g底物或更高，优选约500U/g底物或更高，更优选约l，000U/g底物或更高。相对于反应开始时溶液中的a-葡聚糖，反应开始时溶液中含有的BE量典型地为约500,000U/g底物或更低，优选约100,000U/g底物或更4氐，更优选约80,000U/g底物或更低。如果使用的BE量过多，在反应期间变性的酶可能m^易聚集。如果使用的BE量过少，可能降低a-葡彩瞎的产率。使用的BE量与BE作用于底物(即a-葡聚糖)的时间有关。这是因为，如果使用的BE量少时，！^应时间增加而^JL进行；如果《吏用的BE量大时，即佳反应时间较短反应仍可以进行。因此，酶量与反应时间的乘积对反应产物的生产有显著影响。在本发明的方法中，优选调节BE用量和>^应时间，4吏得BE用量和反应时间的乘积为约150,000U.小时/g底物或更高。在本说明书中，"U.小时/g底物"是指每g底物所用的酶量(U/g底物)和反应时间(小时)的乘积。BE用量和反应时间的乘积更优选为约160,000U.小时/g底物或更高，甚至更优选为约170,000U.小时/g底物或更高，甚至更优选为约180,000U.小时/g底物或更高，甚至更优选为约200,000U.小时/g底物或更高，甚至更优选为约250,000U.小时/g底物或更高，甚至更优选为约300,000U.小时/g底物或更高，和甚至更优选为约350,000U.小时/g底物或更高。即使BE以如下的量和时间作用于底物，仍然可以得到优选的结果约400,000U.小时/g底物或更高，约500,000U.小时/g底物或更高，约600,000U.小时/g底物或更高，约700,000U.小时/g底物或更高，或者约800,000U.小时/g底物或更高。BE可以以很大量或者很长时间作用于底物，从而生产糖原。对于BE作用量和时间的乘积没有具体上限，但是太大量BE作用很长时间会使生产成本太高。BE作用量和时间的乘积例如可以为约10，000，000U.小时/g底物或更低，约8,000,000U.小时/g底物或更4氐，约50，000，000U.小时/g底物或更低，约10,000,000U.小时/g底物或更低，约8，000，000U.小时/g底物或更低，约5,000,000U.小时/g底物或更低，约l,OOO，OOOU.小时/g底物或更低等。酶量和反应时间的乘积的优选范围根据反应开始前溶液中糖的Mn而变化。一般来说，反应开始前溶液中糖的Mn较低时，即使酶量和^^应时间的乘积在任意范围内仍可以得到高分子量产物，并且所得产物的溶解度高。反应开始前溶液中糖的Mil越高，获得高溶解度和高分子量产物所需要的酶量和反应时间的乘积越高.反应开始前溶液中糖的Mn低于约4,000时，本发明的方法中不特别限制BE用量和反应时间的乘积。例如，当该乘积为约25,000U.小时/g底物或更高时，可以得到高分子量产物。该乘积优选为约35,000U.小时/g底物或更高，更优选为约100,000U.小时/g底物或更高，最优选为约150,000U.小时/g底物或更高。反应开始前溶液中糖的Mn为约4,000或更高并且小于约8,000时，BE用量和反应时间的乘积优选为约25,000U.小时/g底物或更高，更优选为约50,000U.小时/g底物或更高，最优选为约100,000U'小时/g底物或更高。反应开始前溶液中糖的Mn为约8,000或更高并且小于约100,000时，BE用量和;l应时间的乘积优选为约40,000U.小时/g底物或更高，更优选为约100,000U.小时/g底物或更高，最优选为约150,000U.小时/g底物或更高。反应开始前溶液中糖的Mn为约100,000或更高并且小于约150,000时，BE用量和反应时间的乘积优选为约150,000U.小时/g底物或更高，更优选为约200,000U.小时/g底物或更高，最优选为约300,000U-小时/g底物或更高。用于本发明的方法中的溶剂可以是任意溶剂，只要所述溶剂不破坏BE的酶活性。只要产生糖原的反应可以进行，所用溶剂不必要完全溶解根据本发明的方法中使用的材料。例如，用固体载体负载酶时，所述酶不必要溶解在溶剂中。另外，不必要所有的反应材料如a-葡聚糖被溶解，部分材料溶解^fcA够了，只凌H^^应可以进行即可.代表性的溶剂是水。溶剂可以是细胞裂解物中的水，在制备上述BE时其伴随BE。在包含具有合成糖原能力的BE和底物(即主要由a-l，4-葡萄糖苷键连接的、并且Mn大于180但不超过150,000的a-葡IM奮)的溶液中可以含有任意其它物质，只要其不妨碍BE和a-葡IMt磷酸化酶之间的相互作用。这种物质的实例包括緩冲剂、产生BE的微生物(例如细菌、真菌)的成分、盐、和培养基成分。这些待使用的材料的量是已知的，本领域的技术人员可以适当地选择。在根据本发明的生产方法中，首先制备反应溶液。例如可以通过将具有合成糖原能力的BE和底物(即主要由a-l，4-葡萄糖香键连接的、并且Mn大于180但不超过150,000的a-葡聚糖)加入适当的溶剂中来制备反应溶液。作为替代，反应溶液可以通过混合分别包含BE和底物(即主要由a-l,4-葡萄糖普键连接的、并且Mn大于180但不超过150,000的a-葡聚糖)的溶液来制备。如果必要，可以向这种反应溶液中加入任意用于调节pH的緩冲剂，只要其不抑制酶反应。可以适当的选择反应溶液的pH，只要所用的BE可以在所述pH下表现出活性。反应溶液的pH优选地接近所用BE的最佳pH。反应溶液的pH典型地为约2或更高，优选为约3或更高，又更优选为约4或更高，尤其优选为约5或更高，进一步更优选为约6或更高，最优选为约7或更高。反应溶液的pH典型地为约13或更低，优选地为12或更低，更优选地为ll或更低，又更优选地为10或更低，尤其优选地为9或更低，最优选地为8或更低。在一个实施方案中，反应溶液的pH典型地在3士所用BE最佳pH的范围内，优选在2±最佳pH范围内，更优选在1±最佳pH范围内，最优选在0.5±最佳pH范围内。如果需要，可以向这种反应溶液中加入4-a-葡聚糖基转移酶和脱支酶。基于反应开始时溶液中的a-葡彩瞎，反应开始时溶液中所含4-a-葡IMt基转移酶的量典型地为约O.lU/g底物或更高，优选为约0.5U/g底物或更高，更优选为约lU/g底物或更高。反应开始时溶液中所含4-a-葡IMt基转移酶的量没有特定的上限，典型地为约50,000U/g底物或更低，优选为约10,000U/g底物或更低，更优选为约8,000U/g底物或更低，这U于^^应开始时溶液中的a-葡彩瞎。如果所用4-a-葡IMt基转移酶的量过高，反应期间变性的酶可以很容易聚集。如果所用4-a-葡聚糖基转移酶的量过小，可能降低a-葡聚糖的产率。反应开始时溶液中所含脱支酶的量典型地为约10U/g底物或更高，优选为约50U/g底物或更高，更优选为约100U/g底物或更高，这是基于反应开始时溶液中的a-葡聚糖。反应开始时溶液中所含脱支酶的量没有特定的上限，典型地为约500,000U/g底物或更低，优选不高于约100，000U/g底物或更低，更优选为约80,000U/g底物或更低，这是基于反应开始时溶液中的a-葡聚糖。如果使用的脱支酶量过高，反应期间变性的酶可以很容易聚集。如果使用的脱支酶量过小，可能降低a-葡聚糖的产率。如果需要，随后通过本领域已知的方法将反应溶液加热来开始反应。反应温度可以是任意温度，只要能得到本发明的效果。反应开始时反应溶液中BE活性为最佳^^应条件下所确定活性的约50/。-约100%时，反应温度可以典型地为约20°C或更高和约100。C或更低。优选这个>^应步骤中的溶液温度使得在预定反应时间之后该活性保留反应开始前溶液中所含BE活性的约50%或更高，更优选约80%或更高。这个反应温度优选为约30。C或更高，更优选约40。C或更高，又更优选约50°C或更高，甚至更优选约55°C或更高，尤其优选约60°C或更高，最优选65°C或更高。这个反应温度为约90°C或更低，优选约85°C或更低，更优选约80°C或更低，甚至更优选约75。C或更低，尤其优选约70°C或更低，最优选约65°C或更低。可以考虑反应温度、反应产生的a-葡聚糖的分子量和酶的剩余活性来选^^应时间。反应时间典型地是约1小时或更高，更优选约2小时或更高，又更优选约4小时或更高，最优选约6小时或更高。反应时间没有特定的上限，优选为约100小时或更低，更优选为约72小时或更低，又更优选约36小时或更低，最优选约24小时或更低。在本发明的生产方法中，优选既不使用a-葡^t磷酸化酶也不使用糖原合成酶。以此方式生产如瞎原的溶液。通过本发明方法生产的糖原的Mw优选为约1，000，000(Da)或更高，更优选约2,000,000(Da)或更高，又更优选约5,000,000(Da)或更高，最优选约IO，OOO，OOO(Da)或更高。通过本发明生产方法生产的糖原的Mw没有特定上限，例如可以合成Mw高达约50,000,000(Da)、高达约IOO，OOO，OOO(Da)或高达约l,OOO，OOO,OOO(Da)的糖原以实现极好的产率。可以通过本领域已知的方法确i人得到的糖原的Mw。例如可以通过下列方法测量糖原的Mw。首先，将合成的a-葡聚糖完全溶解在1N氢氧化钠中，并且用适量盐酸中和，1^含有约1吗_约300收a-葡聚糖的溶液进行一起利用示示折光计和多角度激光光散射检测器的凝胶过滤色镨法来确定平均分子量。具体而言，使用柱ShodexOH-PackSB806MHQ(内径8mm，长度300mm,由ShowaDenkoK.K.制造)和保护柱ShodexOH-PackSB-G(内径6mm，长度50mm，由ShowaDenkoK.K.制造)，将多角度激光光散射检测器(DAWN-DSP,由WyattTechnology制造)和示差折光计(ShodexRI-71,由ShowaDenkoK.K.制造)按照这个顺序连接并且用作检测器。将柱保持在40。C,使用0.1M硝酸钠溶液作为洗脱剂，流速为1mL/分钟。分子量为约10,000或更高的a-葡^JI在11分钟内从HPLC系统内洗脱，其中调节管道，使得Shodex制造的支链淀粉P-50(包含在GFC(水基GPC)的标准样品STANDARDP-82内)的峰在9.3分钟时洗脱出。具体而言，选择从洗脱开始至11分钟时的所有峰，使得包含示差折光计和多角度激光光散射检测器检出的峰作为数据，并且使用数据分析软件(商品名STRA，由WyattTechnology制造)收集数据，并用该软件分析确定Mw。这种方法在下文中称为MALLS方法。在这种分析方法中，不收集上述信号之后的信号，因此排除了分子量为约IO，OOO或更低的葡聚瞎。因此本发明中，根据MALLS方法确定的Mw不;l^溶液中所有葡聚糖的Mw,而是分子量为约10,000或更高的葡聚糖的Mw。另外，当HPLC柱和检测器之间管路的长度、内径等改变时，分子量为约10,000或更高的葡聚糖的洗脱时间可能改变。在这种情况下，本领域的技术人员可以适当地选择g时间，使4Lit于通过根据本发明方法的MALLS方法利用上述支链淀粉P-50来确定Mw。通过本发明方法生产的糖原与天然糖原类似，具有几乎不被支链淀粉和a-淀粉酶降解的特性。因此，通过本发明的方法生产的糖原可以与天然糖原相同的方式使用。通过本发明的方法生产的糖原具有高溶解度的特性。根据本领域已知的方法可以确定所述溶解度。例如，将预定量的a-葡彩瞎加入水中，搅拌预定的时间并且用过滤器过滤，得到滤出液，确定溶解在滤出液中的a-葡聚糖的量来计算加入的a-葡聚糖量与滤出液中溶解的a-葡聚糖量的比率，从而可以确定溶解度。也就是说，溶解度(％)={(滤出液中a-葡聚糖的量)/(过滤前溶液中a-葡彩瞎的量Wx100。所产生的a-葡聚糖被干燥，在20。C时加入蒸馏水中至2mg/mL，在室温搅拌30秒，并且通过0.45-nm的过滤器过滤，在此M下其溶解度优选为约20。/。或更高，更优选约30%或更高，又更优选约40%或更高，进一步更优选约50%或更高。(糖原的用途)通过本发明方法生产的糖原与常规的糖原类似，可以在例如免疫刺激剂、健康食品材料、化妆品材料、食品材料(调味料)和其它工业材料的应用中使用。实施例在下面的实施例中，使用生产实施例1、2、4、5、7和8中生产的各种BE作为BE。使用来源于介支淀#^单胞菌的异淀粉酶(由林原生物化学研究所制造)作为脱支酶。基于YokobayashiW(及》cA/附.丑,o/^".爿c似，vol.212,pp.458-469(1970))确定脱支酶的活性。使用来源于水生栖热菌的MalQ(TaqMalQ)作为4-a-葡聚糖基转移酶。基于TeradaCfl/.(/4/7/;///a/irf^EyiviVYm挑e"to/M/cra脇togy，vol.65,pp.910-915(1999))确定4-a-葡^t基转移酶的酶活性。(生产实施例1:重组生产来源于风产液菌VF5的BE)(A)制备风产液菌VF5BE基因化学合成编码SEQIDNO:2的^J^醋列的基因(SEQIDNO:1)。将SD序列加在所逸基因的翻M始密码子的上游，并MSD序列上游提供BamHI位点。在翻译终止密码子下游提供EcoRI位点。用BamHI和EcoRI切割这个合成基因来制备基因片段，f^利用T4-DNA连接酶将其连接入事先用BamHI和EcoRI切割的pUC19(由宝酒造林式会社制造)，得到质粒pAQBEl。(B)风产液菌BE基因在大肠埃希氏菌中的表达用这种质粒转化大肠埃希氏菌TG-l,将转化体稀释并且在含氨千青霉素的LB琼脂培养基(100照/ml氨千青霉素，1%Difco制造的胰蛋白胨，0.5%Difco制造的酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%琼脂，pH7.3)上铺平板，以便得到独立的菌落，随后在37。C过夜培养。在这种含氨节青霉素的LB琼脂培养基上增殖的大肠埃希氏菌具有所导入的质粒。可以用这种方式制it^达BE的;U^埃希氏菌。在0.2升含终浓度为100照/ml氨节青霉素的L培养基(1%胰蛋白胨(Difco)，0.5%酵母提取物(Difco)，1%NaCl,pH7.5)中在37°C培养用重组质粒pAQBEl转化的大肠埃希氏菌TG^l菌林，直到中对数生长期(约3小时)，随后加入最终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。在37。C继续培养21小时，然后通过离心收集细胞。将这样得到的细胞用50ml緩冲液A(10mM磷酸钠緩沖液(pH7.5))清洗，1^^t在20ml緩冲液A中，通过超声破碎细胞。将无细胞提取物在70°C加热30分钟使来源于大肠埃希氏菌的蛋白质变性，并用作BE酶溶液。这种BE酶溶液、与通过上it+目同方式处理无pAQBEl大肠埃希氏菌得到的液体经过SDS-聚丙烯跣胺剿欧电泳，比较它们的模式。结果是,证实了转化的大肠埃希氏菌T(M菌林表达BE基因，并且产生由该基因编码的蛋白质。(生产实施例2:重组生产来源于嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14的BE)通过非专利文献12中显示的方法由这个文献中所显示的携带质粒pUBE821的大肠埃希氏菌TCM菌林来重组生产来源于嗜热脂肪芽^f菌TRBE14的BE。(生产实施例3:重组生产来源于水生栖热菌的MalQ(在下文中称为TaqMalQ))通过TeradaCfl/.fl"rf￡>iv/ra"we/ito/M/cn6/o/o^v,vol.65,pp.910-915(1999))中显示的方法由这个文献中显示的携带质粒pFGQ8的;^埃希氏菌MC1061菌林来重组生产TaqMalQ。(生产实施例4:重组生产来源于大肠埃希氏菌的BE并测试其生产糖原的能力)用大肠埃希氏菌W3110菌林的染色体DNA作为模板，使用下列引物扩增大肠埃希氏菌BE基因。参考Hilden,I.""/.(2000)Er/及Vc/ie挑267,2150-2155)设计引物，以便扩增全长;^埃希氏菌BE结构基因。下面的表1A示出了设计的引物序列。(表1A)<formula>complextableseeoriginaldocumentpage46</formula>使用宝生物公司制造的DNA聚合酶PyroBest根据推荐的方案进行PCR。将扩增片段插入pGEM-TEasy(由Promega制造)的TA克隆位点，所得质粒命名为pEBEl。用限制酶NcoI和HindIII处理pEBEl得到片段。将所得片段连接入事先用相同酶(NcoI和HindIII)处理的pTrc99A，在含有这种连接产物的溶液中转化大肠埃希氏菌TG-1。从转化的大肠埃希氏菌TG-1中分离质粒，所得质粒命名为pEBE2-l。将携带pEBE2-l的大肠埃希氏菌TG-1在含有50吗/mL氨千青霉素的培养基中37。C振荡培养，在晚对数期加入终浓度为0.1mM的IPTG,将转化体在37°C过夜培养.通过离心收集细胞，将所得细胞沉淀物悬浮在10mM磷酸钾緩冲液*117.5)中，通过超声破碎得到液体。离心这种液体，得到上清液，将上清液用作粗制酶液体。制备用Q-SepharoseFastFlow(Amersham-Pharmacia)填充的柱，用20mMTris-HCl(pH7)平衡树脂。将所il^L制酶液体施加到柱上，以便将粗制酶液体吸附到树脂上，随后用含0.1MNaCl的相同緩冲液，即含0.1MNaCl的20mMTris-HCl(pH7)洗涤树脂。用含0.2MNaCl的相同緩沖液(即含0.2MNaCl的20mMTris-HCl(pH7))洗脱BE活性。将硫酸铵加入具有BE活性的洗脱液中至最终浓度(UM，然后将其以下面的方式经过疏水色谱法来纯化BE酶。首先，制备用Phenyl-Toyopearl650M(TosohCorporation)填充的柱，并且用含0.3M硫酸铵的20mMTris-HCl(pH7)平衡。将酶吸附到这种树脂上，随后用20mMTris-HCl(pH7)洗涤树脂。蒸镭水流过柱子来回收所述酶。以这种方式得到纯化的酶。(测试合成糖原能力)将直链淀粉A(Mn2900，由NacalaiTesque制造)或直链淀粉AS10(Mw10,000(Mn9100)，由AjinokiCo.,Ltd.制造)溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在30°C反应24小时AJl溶液的组成来源于大肠埃希氏菌的BE，40,000U/g底物；底物浓度，0.5wt%;磷酸钾浓度，20mM;pH7.5。通过MALLS方法检验^JL溶液中合成葡聚糖的平均分子量和它的产率。下面的表1B示出结果。<table>complextableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>结果是，发现来源于大肠埃希氏菌的BE具有合成Mw为1000kDa或更高的糖原的能力。(生产实施例5:重组生产来源于及/^rfW/ier附"sWfl柳柳s/s的BE)从BioResourceCenter(RIKEN，独立行政法人，日本)得到及A0d0说w附11softfl/wews/sJCM9785.这种菌^M^MarineBroth2216(由Difco制造)中70。C液体培养，并且从培养细胞中提取染色体DNA.利用上述染色体DNA作为模板和下列引物扩增及/^^幼w/wwsMflwe/m'sBE基因。参考非专利文献ll中公布的>5^序列信息设计这些引物，以便扩增全长及/wrfW/^r挑附Wfl挑e朋isBE结构基因。下面的表1C示出设计的引物序列。<table>complextableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>使用ToyoboCo.,Ltd.制造的DNA聚合酶KOD-Phis，在包含下列组成的反应溶液中在下列条件下进行PCR:<table>complextableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>条件在94。C加热2分钟，随后在94°C加热15秒、55。C加热13秒、68。C加热2.5分钟进行30个循环。用限制酶EcoRI和Pstl处理得到的DNA片段，1^连接入事先用相同酶(EcoRI和Pstl)处理的pTrc99A,在含有连接产物的溶液中转化大肠埃希氏菌TG-1。从转化的大肠埃希氏菌TG-1中分离质粒，得到的质粒命名为pRBEl。将携带pRBEl的;U^埃希氏菌TG-1在含有50吗/mL氨千青霉素的培养基中37。C振荡培养，在晚对数期加入最终浓度为0.1mM的IPTG，将转化体在37°C过夜培养。通过离心收集细胞，将得到的细胞沉淀物悬浮在20mMTris-HCl緩冲液(pH7)中，通it^声破碎得到液体。离心这种液体，得到上清液，随后在70。C将上清液加热30分钟并且离心来回收上清液，得到的上清液用作粗制酶液体。制备用Q-SepharoseFastFlow(Amersham-Pharmacia)填充的柱，用20mMTris-HCl(pH7)平衡树脂。将所ii^制酶液体施加到柱上，以便将粗制酶液体吸附到树脂上，随后用含0.1MNaCl的相同緩冲液洗涤树脂。用含0,5MNaCl的相同緩冲液洗脱BE活性。对20mMTris-HCl(pH7)透析所述洗脱液，得到纯化的BE。如下面的实施例8所示，得到的纯化BE具有合成Mw为1000kDa或更高的糖原的能力。(生产实施例6:重组生产来源于四季豆的BE并且测试其合成高分子量葡彩瞎的能力)作为来源于四季豆(/^朋^/Msv"/wgfl/^1.)的BE,使用Nozaki，K.Wfl/.(2001)及Vwc/.说》c/ie附.65,1141-1148中描述的KBE2。(测试合成糖原能力)将直链淀粉A(Mn2900,由NacalaiTesque制造)或直链淀粉AS10(MwIO，OOO(Mn9100),由AjinokiCo.，Ltd.制造)溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩沖液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在30°C反应24小时。M溶液的组成KBE2的量，40,000U/g底物；底物浓度，0.5wt%;磷酸钾浓度，20mM;pH7.5。通过MALLS方法检验反应溶液中合成的葡^t的平均分子量和它的产率。下面的表1D示出结果。(表id)<table>complextableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>结果发现当使用KBE2时，不能合成1000kDa或更大的糖原。(生产实施例7:重组生产来源于热速芽孢杆菌的BE)除了使用编码来源于热速芽孢杆菌的BE的基因(SEQIDNO:9)代替编码来源于风产液菌的BE的基因并且加热温度为60。C之外，用与生产实施例l相同的方式重组生产来源于热速芽孢杆菌的BE。(生产实施例8:重组生产来源于热溶芽孢杆菌的BE)除了使用编码来源于热溶芽孢杆菌的BE的基因(SEQIDNO:9)代替编码来源于风产液菌的BE的基因并且加热温度为60。C之外，用与生产实施例l相同的方式重组生产来源于热溶芽孢杆菌的BE。(测量实施例1:测量来源于风产液菌VF5的BE的降低支链淀粉分子量活性)首先，将100nl蒸馏水加入50mg蜡质玉米淀粉(WCS，由SanwaCornStarchCo.,Ltd.制造)中，并且充分搅拌。随后向其中加入900二甲基亚砜(DMSO),搅拌并且在沸水浴中加热20分钟。向其中加入8.9ml蒸镏水，充分搅拌并且在沸水浴中再加热10分钟。向其中加入100^1M磷酸盐緩冲液(pH7.5),搅拌并用作底物溶液.将所述底物溶液分配为800ML/管的体积。也就是说，每管含有4mgWCS.向各管中分别加入66.7、83.3、100、116.7、133.3或150含有通过与生产实施例1相同的方法生产的来源于风产液菌VF5的BE的溶液(BE活性2.4U/mL),和133.3、116.7、100、83.3、66.7或50nL稀释剂，来调节反应溶液的体积至1000jiL,随后在70。C反应16小时。所述稀释剂是含0.05%TritonX-100的10mM裤酸钾緩冲液(pH7.5)。当M时间达到16小时，加入1NHC1将^J[溶液的pH从3降至4，在100。C另外加热反应溶液10分钟来终止反应。M终止^，用0.45卞m的过滤器过滤M溶液，通过MALLS方法测量反应溶液中所含产物的Mw。下面的"测量所产生葡IMt的重均分子量(Mw)的方法"中详细描述了MALLS方法。在纵轴(y-轴)上标出计算Mw(kDa)的对数，而在7jC平轴(x-轴)上标出酶的用量(HL)，使用MicrosoftCorporation制造的软件MS-Excel绘制幂近似曲线。图12中示出这个图表。近似曲线的方程表达为y=24,090x-1340(R2=0.9896)。从以上方程算出将4mgWCS底物的Mw降至400kDa所需的酶量VI(^L)为119^L。通过转换酶量/1g底物，计算1U分子量降低活性所需的酶量V2(mL)(=(119nL/1000)x(1000mg/4mg)=29.75(mL))。酶溶液的分子量降低活性El是单位分子量降低活性的倒数(El=1/V2=1/29.75=0.0336)(U/mL)。因此，BE活性/分子量降低活性=(2.4(U/mL)/0.0336(U/mL))=71。(测量实施例2:测量来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)除了使用生产实施例1中生产的来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为50°C之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为270。(测量实施例3:测量来源于if/wrfo幼"附nsofta附ews/s的BE的降4氐支链淀粉分子量活性)除了使用生产实施例5中生产的来源于及/MW/W/iei7IIMSWfl附ei!S/s的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为65°C之外，用与测量实施例l相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为35。(测量实施例4:测量来源于大肠埃希氏菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)除了使用生产实施例4中生产的来源于大肠埃希氏菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为30。C之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为273。(测量实施例5:测量来源于蜡质芽抱片菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)除了使用根据非专利文献9所述方法中生产的来源于蜡质芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为30°C之外，用与测量实施例l相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为1086。(测量实施例6:测量来源于四季豆的BE的降低支链淀粉分子量活性)除了使用生产实施例6中生产的来源于四季豆的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为30°C之外，用与测量实施例1相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为130069。(测量实施例7:测量来源于热速芽孢杆菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)除了使用生产实施例7中生产的来源于热速芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为50°C之外，用与测量实施例l相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降寸氐活性为466。(测量实施例8:测量来源于热溶芽孢杆菌的BE的降低支链淀粉分子量活性)除了使用生产实施例8中生产的来源于热溶芽孢杆菌的BE代替来源于风产液菌VF5的BE并且反应温度为50。C之外，用与测量实施例l相同的方式确定BE活性/分子量降低活性。结果是，BE活性/分子量降低活性为402。下面的表1E总结了通过这些实施例测量的BE活性/分子量降低活性和糖原合成能力。(表1E)<table>complextableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>(测量所产生葡聚糖的重均分子量(Mw)和产率的方法)通过MALLS方法按照下面的方式测量所产生葡聚糖的Mw:使用柱ShodexOH-PackSB806MHQ(内径8mm，长度300mm，由ShowaDenkoK.K.制造)和保护柱ShodexOH-PackSB-G(内径6mm,长度50mm,由ShowaDenkoK.K.制造)，将多角度激光光散射检测器(DAWN-DSP，由WyattTechnology制造)和示差折光计(ShodexRI-71,由ShowaDenkoK.K.制造)按照这个顺序连接并用作检测器。将所述柱保持在40。C,使用0.1M硝酸钠溶液作为洗脱液，流速为1mL/分钟。分子量为约10,000或更高的a-葡聚糖在前11分钟内从HPLC系统内M出，其中调节管路，使得Shodex制造的支链淀粉P-S0(包含在GFC(水基GPC)的标准样品STANDARDP-82内)的峰在9.3分钟时洗出。具体而言，选择从洗脱开始至11分钟的所有峰，使得包含示差折光计和多角度激光光散射检测器检出的峰作为数据，并且使用数据分析软件(商品名STRA，由WyattTechnology制造)收集数据，并用该软件分析来确定Mw。在这些条件下排除了分子量为约10，000或更低的葡IMt。作为葡聚糖的dn/dc(固有折光指数的增量)使用0.145mL/g。测量示差折光计的峰面积，并且用这个峰面积除以dn/dc值，由此计算洗脱出的高分子量葡IMt的量(g)。洗脱出的高分子量葡IMt的量除以合成所用的底物量(其在计算^S式中4J^物浓度和HPLC上样体积的乘积)，并乘以100来确定产率(％)。也就是说，才艮据下面的等式计算产率产率(％)=((洗脱出的高分子量葡彩睹的量(g))+[(底物浓度(g/mL))x(HPLC上样体积(mL))"x100利用分子量为1，000，000或更高的高分子量葡彩瞎的量，可以确定糖原的产率。(实施例1:由低分子量直链淀粉生产糖原)(1-1:由直链淀粉A生产)将直链淀粉A(Mn2900,由NacalaiTesque制造)溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在70°C反应17小时。反应溶液的组成来源于风产液菌的BE的量，10,000、20,000或40,000U/g底物；底物浓度，2wt%;磷酸钾浓度，20mM;pH7.5。图2中示出了由低分子量a-葡彩瞎生产糖原的示意图。M之后，测量产生的a-葡聚糖的分子量。结果显示在表1和图3中。在表1中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率(％)表示分子量为1，000,000或更高(即糖原)的葡聚糖的产率。结果是，证实了当使用10,000-40,000U/g底物的量的BE时，由Mn为2900的直链淀粉A产生Mw为1,000,000或更高的糖原，并且几乎所有由直链淀粉A生产的葡聚糖都是糖原。(1-2:由各种分子量的底物生产糖原)分别使用直链淀粉AS-5、AS-IO、AS-30、AS-70或AS-110(Mw分别为5000、10000、30000、70000和110000,由AjinokiCo.,Ltd.制造)作为底物。由于它们的Mw/Mn几乎为1.1，它们的Mn分别为4,500、9，100、27,000、64,000和IOO，OOO。将各种直链淀粉溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在70。C反应16小时。反应溶液的组成来源于风产液菌的BE的量，10,000U/g底物；底物浓度，2wt%;磷酸钾浓度，40mM;pH7.5。M之后，测量产生的a-葡聚糖的分子量。结果显示在表1和图4中。在表1中，来源于风产液菌的BE用Aq表示。结^il现，甚至从Mn为100,000的直链淀粉产生了糖原。反应开始前溶液中糖的Mn大于9100时，产物的分子量分成两个峰.存在分裂的峰时，只测量较高分子量的那个峰.有这种趋势，反应开始前溶液中糖的Mn越大，产物的Mw越小，且产率越高。(1-3:由各种浓度的底物生产糖原)作为底物，将直链淀粉A(Mn2卯0，由NacalaiTesque制造)溶解在1NNaOH中，1^用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩沖液,使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在70°C反应17小时。反应溶液的组成来源于风产液菌的BE的量，10,000或40,000U/g底物；底物浓度，2、4、8或12wtY。；磷酸钾浓度，40mM;pH7.5。M之后，测量产生的a-葡聚糖的分子量。结果显示在表l-2中。在表l-2中，糖原的产率(％)表示分子量为1,000,000或更高(即糖原)的葡聚糖的产率。结果发现，至少在底物浓度高达约12%时产生了糖原。有这种趋势，底物浓度越高，产物的Mw越小。<table>complextableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>(表1-2)<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage57<table>Aq:来源于风产液菌的分支蘇Mw:重均分子贵Mn:数均分子量(实施例2:由淀粉生产糖原)(2-l:由玉米淀粉生产糖原)将玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)(2wt。/。)悬浮在水中，并在100。C加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40。C,向其中加入异淀粉酶(缩写为IAM，5000或50000U/g底物，由(林)林原生物化学研究所制造)并且在40。C反应4小时、6小时、8小时或20小时，由此产生直链淀粉。之后，用5mM磷酸钾緩冲液调节溶液至pH7.5，向其中加入来源于风产液菌的BE得到混合物，其中底物浓度为2wt%，BE的量为10000、20000、40000或60000U/g底物，1^在55。C、65。C、70。C或75。C反应20小时。图5示出用脱支酶降解淀粉来得到直链淀粉、随后所述直链淀粉与BE反应来产生糖原的示意图。M之后，测量产生的a-葡m^的分子量。结果显示在表2和图6中，图6是标出结果的图表，其中IAM的量为5000U/g底物，BE的量为10000、20000、40000或60000U/g底物。在表2中，糖原的产率(％)表示分子量为1，000,000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。(表2)〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage５８</column></row><table>BE:来源于风产液菌的分支酶IAM:来源于介支淀粉假单胞菌的异淀粉醉Mw:重均分子量Mn:数均分子量结果发现，由玉米淀粉的异淀粉酶降解产物产生了糖原。几乎与异淀粉酶的量和BE的量无关，所得Mw为约5,000,000的糖原的产率为约30%或更高。异淀粉酶的反应时间为4小时或更高时，产生了糖原。在55。C、65°C、70。C或75。C的任意BE反应温度下产生了糖原。(2-2:由各种淀粉生产糖原)将玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)、蜡质玉米淀粉(由Roquette制造)、小麦淀粉(由和光纯药工业(林)制造)、马铃薯淀粉(由和光纯药工业(林)制造)或木薯淀粉(由VEDANENTERPRISECo.,Ltd.制造)(2wt"/。)悬浮在水中并且在100。C加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40。C，向其中加入异淀粉酶(5000U/g底物，由(林)林原生物化学研究所制造)并且在40。C反应20小时，由此产生直链淀粉。之后，用5mM磷酸钾緩沖液调节溶液至pH7.5,向其中加入来源于风产液菌的BE得到混合物，其中底物浓度为2wt%，BE的量为20000U/g底物，随后在55。C、65。C或75。C反应20小时。反应之后，测量产生的a-葡IMt的分子量。结果显示在下面的表3中。结果发现，可以使用各种淀粉作为异淀粉酶底物来生产糖原。(2-3:使用来源于嗜热脂肪芽抱ff菌的BE由淀粉生产糖原)将玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)(2wt。/o)悬浮在水中并且在100。C加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40°C,向其中加入异淀粉酶(5000U/g底物，由(林)林原生物化学研究所制造)并且在40。C反应20小时，由此产生直链淀粉。之后，用40mM磷酸钾緩冲液调节溶液至pH7.5，向其中加入来源于嗜热脂肪芽a菌的BE得到混合物，其中底物浓度为2wt。/。，BE的量为20000U/g底物，I^L#在55。C反应20小时。M之后，测量产生的a-葡i^的分子量。结果显示在下面的表3中.在表3中，葡彩瞎的产率表示分子量为10,000或更高的葡彩瞎的总产率，糖原的产率(％)表示分子量为l，OOO,OOO或更高的葡IMt(即糖原)的产率。结果发现，甚至4吏用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE可以产生糖原。<table>complextableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>(2-::使用异淀粉酶和BE—起生产糖原)将玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)(lwt。/0谱1F令^被先谅浙每^^,〗紫^二sa潘T令^-被裙W如紫4--bv且悬在100°C加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至65°C，向其中加入异淀粉酶(500000U/g底物，由(抹)林原生物化学研究所制造)和来源于风产液菌的BE(60000U/g底物)，用40mM彿酸钾緩冲液调节溶液至pH7.5并且在65°C反应16小时。反应之后，测量产生的a-葡聚糖的分子量。结果发现，甚至通过异淀粉酶和BE—起作用于淀粉可以产生糖原。(实施例3A:通过使4-a-葡聚糖基转移酶和BE—起作用于短糖链直链淀粉来生产糖原)(3-1:利用来源于风产液菌的BE和TaqMalQ生产糖原)将底物(麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)或麦芽七糖(G7))溶解在水中，并且向底物溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在65。C反应17小时。M溶液的组成来源于风产液菌的BE的量，40000、80000或160000U/g底物；TaqMalQ,10U/g底物；底物浓度，1%;鳞酸钾浓度，10mM;pH7.5。图7示出通过4-a-葡聚糖基转移酶由麦芽五糖生产直链淀粉、以及通过BE由直链淀粉生产糖原的示意图。反应之后，测量产生的a-葡彩瞎的分子量。结果显示在表4和图8中。图8示出Mw，其中BE用量为80000U/g底物。存在分离的峰时，只测量分子量较高的峰。结果发现，从G5、G6和G7利用4-a-葡^t基转移酶一起以高度有效的方式产生糖原。(3-2:利用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE和TaqMalQ生产糖原)将底物(麦芽七糖(G7))溶解在水中，并且向底物溶液中加入水、酶溶液和緩沖液,使得反应溶液具有下面的组成，并且所得混合物在50°C反应17小时。反应溶液的组成来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE的量，160000U/g底物；TaqMalQ的量，2.3U/g底物；底物浓度，0.5%;磷酸钾浓度，5mM;pH7.5。反应之后，测量产生的a-葡聚糖的分子量。结果显示在下面的表4中。在表4中，葡影瞎的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率表示分子量为l，OOO，OOO或更高的葡IM奢(即糖原)的产率。结果发现，甚至使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的BE时，可以由G7利用4-a-葡IMt基转移酶一起以高yl有效的方式产生糖原。<table>complextableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>(实施例4:在相对低温的条件下生产糖原)将直链淀粉A(Mn2卯0，由NacalaiTesque制造)溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在30。C反应16小时。反应溶液的组成:来源于风产液菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的BE的量，80,000U/g底物；底物浓度，2wt%;磷酸钾浓度，20mM;pH7.5。M之后，测量产生的a-葡IMt的分子量。结果显示在表5中.在表5中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡彩瞎的总产率，糖原的产率表示分子量为l，OOO，OOO或更高的葡斜奮(即糖原)的产率。结果证实，甚至使用其中任一种热稳定BE而且反应温度为30。C时，可以由直链淀粉A产生Mw为l,OOO，OOO或更高的糖原。从这个结果看出，糖原的产生不是由于高温M条件，而是由于热稳定BE的特性。(比较实施例1:利用来源于蜡质芽孢杆菌的BE生产a-葡彩瞎)将直链淀粉A、或酶促合成的直链淀粉(AS-IO(Mw10000;Mn9100)或AS-320(Mw320000;Mn290000))溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩沖液，使得M溶液具有下面的组成，所得混合物在30。C反应24小时。反应溶液的组成来源于蜡质芽孢杆菌的BE的量，40,000U/g底物；底物浓度，0.5wt%;礴酸钾浓度，20mM;pH7.5。根据非专利文献9中描述的方法制备来源于蜡质芽孢杆菌的BE。反应之后，通过在沸水浴中加热10分钟来终止所述反应，通过MALLS方法分析得到的a-葡聚糖。结果显示在表6中。在表6中，葡聚糖的产率表示分子量为10,000或更高的葡聚糖的总产率，糖原的产率表示分子量为1,000,000或更高的葡IM奢(即糖原)的产率。当使用直链淀粉A作为底物时，不能检测到高分子量a-葡彩瞎。无论使用哪种SI^合成的直链淀粉，分子量为10,000—500,000的葡聚糖几乎占产物的100%,不能检测到分子量为l，OOO，OOO或更高的葡聚糖。当使用Mn为9100的底物时，产物的Mw为86卯0，当使用Mn为2卯000的底物时，产物的Mw为61卯0。当使用高分子量底物时，发生底物转换为小分子化合物。另外，蜡质芽孢杆菌BE相似地作用于Mn为4500—290000的各种大小的直链淀粉，通过凝胶过滤分析所述产物，显示主要组分的分子量与上述试验中的几乎相同。也就是说，在任何情况下不能得到分子量大于l，OOO，OOO的高分子量a-葡聚糖。(实施例3B:通过BE单独作用于短糖链直链淀粉来生产a-葡聚糖)将底物(麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)或麦芽七糖(G7))溶解在水中，加入来源于风产液菌的BE，调节反应溶液使之具有下面表7中显示的底物浓度和BE量，用10mM磷酸钾緩冲液调节pH至7.5并且在下面表7中显示的温度下反应17小时。M之后，测量产生的a-葡l^的分子量。结果显示在下面的表7中，在表7中，糖原的产率(％)表示分子量为1，000,000或更高的葡IM奮(即糖原)的产率。结果发现，使用低分子量底物G4-G7时，可以合成糖原。(实施例5:BE和支链淀粉糾用于淀粉来生产糖原)将玉米淀粉(由和光纯药工业(株)制造)(2wt。/o)悬浮在水中并且在100°C加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至60。C，向其中加入支链淀粉酶(5U/g底物；Kleistase，由大和化成(林)制造)并且在60°C反应20小时，由此产生直链淀粉，随后在100°C加热10分钟来终止反应。之后，用10mM磷酸钾緩冲液调节溶液至pH7.5，加入20000U/g底物的量的来源于风产液菌的BE，并且在65°C>^应20小时。反应之后，测量产生的a-葡聚糖的分子量。结果显示在下面的表8中。在表8中，糖原的产率(％)表示分子量为1，000，000或更高的葡聚糖(即糖原)的产率。结果是，与用异淀粉酶脱支的玉米淀粉类似，用支链淀粉酶脱支的玉米淀粉可以产生糖原。(表5)<table>complextableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>Aq:来源于风产液菌的分支醉Bst:来源于嗜热脂肪芽孢軒菌的分支酶Mw:重均分子量Mn:数均分子量(表6)<table>complextableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>Aa:来源于风产液菌的分支酶Mw:重均分子量Mn:数均分子量(表8)<table>complextableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>(评价实施例l:对用支链淀粉酶降解的抗性)据报导，使用现有技术，通过BE作用于直链淀粉得到的a-葡^t与天然糖原不同，这种差异在于它容易被支链淀粉酶降解(非专利文献10)。检验通过本发明的方法生产的糖原是否与天然糖原类似，对用支链淀粉酶降解有抗性。将玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)(1wt)悬浮在水中并且蒸汽加压锅中糊化。将产物冷却至40。C，加入异淀粉酶(40000U/g底物，由(林)林原生物化学研究所制造)并且在40°C反应6小时来形成直链淀粉。之后，用3mM磷酸钟緩冲液(pH7.0)和5NNaOH调节溶液至pH7.5，加入来源于风产液菌的BE至浓度为20000U/g底物并且在65°C反应19小时来产生重均分子量为9719kDa的糖原。将这种糖原、来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(林)制造)、蜡质玉米淀粉(由Roquette制造)或玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)溶解在1NNaOH中并且用HC1中和。之后立即加入来源于短芽孢杆菌的支链淀粉酶(由大和化成(林)制造)，调节反应溶液至底物浓度为0.5wt。/。和支链淀粉酶(0、2、4、16、64、256U/g底物)，并用10mM醋酸钠緩冲液(pH5.0)调节溶液至pH5.0，随后在60°C反应30分钟。反应之后，测量产物的分子量。结果显示在图9中。结果发现，淀粉iSit降解，但是来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(林)制it)和才艮据本发明的生产方法生产的糖原几乎不被支链淀粉酶降解。因此，证实了根据本发明的生产方法生产的糖原与天然糖原具有相同的性质并且可以称为真正的糖原。(评价实施例2:对用a-淀粉酶降解的抗性)已知糖原几乎不被支链淀粉酶降解，并且根据本发明人的试验发现对a-淀粉酶降解有极端的抗性。例如，通过用300U/g人唾液a-淀粉酶处理30分钟，蜡质玉米淀粉和常规玉米淀粉被降解至分子量为10,000或更低，但是在相同^Ht下来源于牡蛎的试剂糖原几乎不被降解。检验通过本发明的方法生产的糖原是否与天然糖原类似，对用a-淀粉酶降解有抗性。将在评价实施例1中制备的糖原、来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(林)制造)、蜡质玉米淀粉(由Roquette制造)或玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)溶解在1NNaOH中并且用HC1中和。之后立即加入来源于人唾液的a-淀粉酶(XIII-A型，由Sigma制造)，调节M溶液至底物浓度为0.5wt。/。和a-淀粉酶(0、5、37.5、75、150、300U/g底物)，用20mM磷酸钾緩沖液(pH7.0)调节溶液至pH7.0，Nl^在37。C反应30分钟'M之后，测量产物的分子量。结果显示在图10中'当a-淀粉酶的量为0、5或37.511^底物时，因为产物不能过滤，所以不能测量淀粉的分子量。结果发现，淀粉迅逸降解，但是来源于牡蛎的试剂糖原(由和光纯药工业(林)制造)和根据本发明的生产方法生产的糖原几乎不被a-淀粉酶降解.因此，证实了根据本发明的生产方法生产的糖原与天然糖原具有相同的性质并且可以称为真正的糖原。(实施例6:证实糖原的溶解度)将直链淀粉A(Mn2900，由NacalaiTesque制造)或直链淀粉AS10(Mw10,000(Mn9100),由AjinokiCo"Ltd.制造)溶解在1NNaOH中，1^用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在70。C反应24小时。反应溶液的组成来源于风产液菌的BE的量，34,000U/g底物；底物浓度，0.5wt%;鳞酸钾浓度，20mM;pH7.5。通过这个反应得到的糖原的产率(％)为10.1%(使用直链淀粉A作为底物时)或者59.0%(使用直链淀粉AS10作为底物时)。通过下面的方法确定溶解度。将得到的糖原通过乙醇沉淀回收，干燥，在室温(约20。C)加入蒸馏水浮到2mg/mL混合物。在室温下用凝涡混合器将混合物搅拌30秒，用0.45nm过滤器过滤。通过MALLS方法测量滤出液中溶解糖原的量。另外，通过下面的方法确定支链淀粉酶抗性和a-淀粉酶抗性。首先，将通过乙醇沉淀回收的糖原悬浮在水中，通过100。C加热4吏之完全溶解。支链淀粉酶处理中以量为256U/g底物的Kleistase(由大和化成(林)制造)在60°C处理30分钟。a-淀粉酶处理中以量为300U/g底物的XIII-A型(由Sigma制造)在37。C处理30分钟。M终止之后，通过MALLS方法计算葡^t的Mw。通过根据下面方程确定的比率来评估对支链淀粉酶和a-淀粉酶的抗性。即支链淀粉酶抗性(％)={(Mw支链淀粉蘇处理后)/(M界处理前)}x100，—a-淀粉酶抗性(％)={(Mwa-淀粉醉处理后)/(Mw处理前)}x100结果显示在下面的表9中。(表9)<table>complextableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>结果发现，通过本发明的方法可以得到具有高溶解度、对支链淀粉酶和a-淀粉酶有高抗性的糖原。(实施例7:通过结^^吏用来源于风产液菌VF5的BE和来源于7jC生栖热菌的4-a-葡^t基转移酶(TaqMalQ)来改善糖原的产率)(实施例7-1:通过TaqMalQ和来源于风产液菌的BE作用于直链淀粉A来生产糖原)将直链淀粉A(Mn2卯0,由NacalaiTesque制造)溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在65。C反应20小时。>^溶液的组成来源于风产液菌的BE的量，5000或20000U/g底物；TaqMalQ的量，5、10或20U/g底物；底物浓度，2wt%;磷酸钾浓度，20mM;pH7.5。下面的表10显示反应M和产物的分析结果。(表10)<table>complextableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>底物直链淀粉ABE:来源于风产液菌的BEMalQ:来源于水生栖热菌的4-a-葡聚糖基转移酶因此发现，可以使用来源于风产液菌的BE和TaqMalQ来生产Mw为1000kDa或更高的糖原。这表明，通过加入TaqMalQ可以显著提高糖原的产率。实施例7-2:通过TaqMalQ和来源于风产液菌的BE作用于玉米淀粉来生产糖原将玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)(2wt。/。)悬浮在水中并且在100。C加热30分钟，由此使玉米淀粉糊化。将混合物冷却至40°C,向其中加入量为5000U/g底物的异淀粉酶(由(林)林原生物化学研究所制造)并且在40°C反应20小时来生产直链淀粉。之后用5mM磷酸钾緩冲液调节溶液至pH7.5,并加入来源于风产液菌的BE(20000U/g底物)和TaqMalQ(0.1、0.5、1、2、3、4、5、10或20U/g底物)并且在65°C反应20小时。下面的表ll显示反应务降和产物的分析结果。因此发现，在异淀粉酶作用于玉米淀粉之后，可以利用来源于风产液菌的BE和TaqMalQ以高度有效的方式生产Mw为1000kDa或更<table>complextableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>高的糖原。(实施例7-3:通过TaqMalQ和来源于风产液菌的BE作用于作为底物的液化脱支玉米淀粉来生产糖原)将玉米淀粉(由和光纯药工业(林)制造)(2wt。/。)以6wt。/。的浓度悬浮在水中并且在100。C用a-淀粉酶(由大和化成(林)制造)液化至DE12。M终止之后，向其中加入异淀粉酶(5000U/g底物，由(林)林原生物化学研究所制造)并且在40。C反应20小时来实现脱支。脱支产物的Mn为约600。用5mM磷酸钾緩冲液调节溶液至pH7.5，加入来源于风产液菌的BE(5000U/g底物)和TaqMalQ(lU/g底物)并且在65。C反应20小时，由此得到Mw为11360kDa的糖原。(实施例8:l吏用来源于及/^flto^^7w"sMfl附朋s/s的BE生产糖原)《吏来源于及/^rfW/^r附附Mfl柳e"s/s的BE作用于直链淀粉A和AS-10来生产糖原。具体而言，将直链淀粉A(Mn2900，由NacalaiTesque制造)或AS-10(Mn9100,由AjinokiCo.,Ltd.制造)溶解在1NNaOH中，随后用HC1中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在65°C反应17小时。反应溶液的组成来源于及/w^^^7mms06fl附ewws的BE，40,000U/g底物；底物浓度，2wt%;醋酸钠浓度，40mM;pH6.0。下面的表12显示反应M和产物的分析结果。(表12)<table>complextableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>因此发现，4吏用来源于及/^rfW/^i7MMsMa附^w/s的BE可以以高度有效的方式生产Mw为1000kDa或更高的糖原。(实施例9:使用来源于热速芽孢杆菌的BE生产糖原)使来源于热速芽孢杆菌的BE作用于直链淀粉A和AS-10来生产糖原。具体而言，将直链淀粉A(Mn2900，由NacalaiTesque制造)或AS-10(Mn9100,由Aji加kiCo.，Ltd.制造)溶解在lNNaOH中，1^用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩冲液，使得>^应溶液具有下面的组成，所得混合物在55。C反应16小时.M溶液的组成来源于热速芽孢杆菌的BE的量，20,000U/g底物；底物浓度，2wt%;Tris浓度，20mM;pH7.0。下面的表13显示M条件和产物的分析结果。(表13)<table>complextableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>BE:来源于热速芽孢杆菌的BE因此发现，使用来源于热速芽孢杆菌的BE可以以高度有效的方式生产Mw为1000kDa或更高的糖原.(实施例10:使用来源于热溶芽孢杆菌的BE生产糖原)使来源于热溶芽孢杆菌的BE作用于直链淀粉A和AS-10来生产糖原。具体而言，将直链淀粉A(Mn2卯0，由NacalaiTesque制造)或AS-IO(Mn9100，由AjinokiCo.,Ltd.制造)溶解在1NNaOH中，随后用HCl中和。之后立即向直链淀粉溶液中加入水、酶溶液和緩沖液，使得反应溶液具有下面的组成，所得混合物在45。C反应16小时。反应溶液的组成来源于热溶芽孢杆菌的BE的量，20,000U/g底物；底物浓度，2wt%;Tris浓度，20mM;pH7.0。下面的表14显示^Jl务fr和产物的分析结果。(表14)<table>complextableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>BE:来源于热溶芽孢軒菌的BE因此发现，使用来源于热溶芽孢杆菌的BE可以生产Mw为1000kDa或更高的糖原。已经参考上述本发明的优选实施方案描述了本发明，但是不应认为本发明限于这些实施方案.应该理解，本发明的范围应该只通过权利要求来解释。应该理解，通过对本发明的具体优选实施方案的描述，本领域的技术人员可以基于本发明的描述和公知技术实现等同的范围。应该理解，本说明书中引用的专利、专利申请和文献的公开内容通过引用以其整体并入本文，就像在本说明书中具体描述一样。工业实用性根据本发明，提供了廉价地生产具有与天然糖原相同性质的高度分支和高分子量的a-葡聚糖的方法。通过本发明的方法生产的糖原与常见的天然糖原类似，可以在广泛范围内应用。天然糖原在多种工业领域中应用。例如，可以预期根据本发明方法生产的糖原可以用作免疫刺激剂、健康食品材料等。还可以预期通过本发明方法生产的糖原可以用于化妆品材料、食品材料(调味料)和其它工业材料中。通过本发明方法生产的糖原的用途还包括，例如微生物感染的治疗剂、湿润剂(例如有效改善皮肤保湿性的化妆品、防止嘴唇扭陡的化妆品)、复合调味料(例如具有扇贝(眼)味道的复合调味料)、抗肿瘤剂、形成发酵乳的促进剂、胶体颗粒聚集体、影响头发易梳性和光泽的改善头发表面摩擦阻力的物质、细胞活化剂(表皮细胞活化剂、成纤维细胞增殖剂等)、ATP生成促进剂、皮肤老化症状例如皱紋的改善剂、皮肤M的改善剂、荧光颗粒表面处理剂和环状四糖(CTS;cyclo{—6}-ot-D-glcp-(l—3)-a-D-glcp-(l—6)-a-D-glcp-(l—3)-a-D-glcp-(l—))合成的底物。本发明的方法中生产的糖原可以用作皮肤的外用制剂(例如化妆水、乳液、霜、精华素、生发剂、育发剂、面膜、唇骨、护唇霜、化妆粉底液、化妆粉底霜、粉底、眼影、腮红、香波、润丝、发用液剂、头发滋补剂、长效巻发剂、染发剂、处理(剂)、浴用剂、护手霜、护腿霜、护颈霜、爽身水等)、或眼用溶液等中。根据本发明的方法，可以得到(类似于天然糖原)具有高溶解度以及直链淀粉酶和a-淀粉酶低降解性的糖原。这被认为是由于具有合成糖原能力的BE(尤其是热稳定BE)的特异性质。所得糖原对上述酶的低消化性是很重要的，例如，对于显示所述糖原的免疫刺激活性，因此本发明尤其有用。权利要求1.一种生产糖原的方法，其包括以下步骤使具有合成糖原能力的分支酶在溶液中作用于底物，由此生产糖原，其中所述底物是主要由α-1，4-葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更大的α-葡聚糖，而且开始反应前溶液中糖的数均分子量大于180但不超过150,000。2.根据权利要求1的方法，其中(分支酶的分支酶活性)/(分支酶的分子量降低活性)是500或更低。3.根据权利要求l的方法，其中所述分支酶是热稳定分支酶.4.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶来源于嗜热菌或中温性菌。5.根据权利要求l的方法，其中所述分支酶来源于属于选自产液菌属(Aquifex)、红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜热聚球蓝细菌属(Thermosynechococcus)和埃希氏菌属(Escherichia)之中属的细菌。6.根据权利要求l的方法，其中所述分支酶来源于选自风产液菌、嗜火产液菌(Aquifexpyrophilus)、Rhodothermusobamensis、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)、嗜热月旨肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、热速芽抱軒菌(Bacilluscaldolyticus)、热链形芽抱軒菌(Bacillusthermocatenulatus)、热溶芽抱軒菌(Bacilluscaldolyticus)、黄热芽孢杆菌(Bacillusflavothermus)、酸热芽孢杆菌(Bacillusacidocaldarius)、热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)、史氏芽抱軒菌(Bacillussmithii)、Thermosynechococcuselongatus和大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)的细菌。7.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶来源于选自风产液菌、Rhodothermusobamensis、嗜热月旨肪芽孢杆菌、热速芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的细菌。8.根据权利要求1的方法，其中所述分支酶的最佳反应温度不低于45ic并且不超过卯x:。9.根据权利要求l的方法，其中开始反应前溶液中的所述糖是脱支淀粉、脱支糊精或酶促合成的直链淀粉。10.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量大于180并且小于4,000。11.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量为4,000或更大，但小于8，000，并且调节所述分支酶用量和反应时间，使得分支酶用量和反应时间的乘积为25,000U小时/g底物或更高。12.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量为8,000或更大，但小于IOO，OOO，并且调节所述分支酶用量和反应时间，4吏得分支酶用量和反应时间的乘积为40,000U小时/g底物或更高。13.根据权利要求1的方法，其中开始反应前溶液中所述糖的数均分子量为100,000或更大，并且是150,000或更小，调节所述分支酶用量和反应时间，使得分支酶用量和反应时间的乘积为150,000U■小时/g底物或更高。14.根据权利要求1的方法，其进一步包括使4-a-葡聚糖基转移酶作用于数均分子量大于180并小于1,500的a-葡聚糖以产生所述底物的步骤。15.根据权利要求14的方法，其中所述4-a-葡聚糖基转移酶是来源于水生栖热菌(T7^!7Mt/Stt《WariCMS)的淀粉麦芽糖酶。16.根据权利要求1的方法，其中所述数均分子量大于180并小于1,500的a-葡聚糖包含聚合度为4-7的麦芽寡糖。17.根据权利要求1的方法，其进一步包括使脱支酶作用于数均分子量为500或更大的低分支a-葡聚糖以产生所述底物的步猓。18.根据权利要求1的方法，其中所迷4-a-葡聚糖基转移酶与所述分支酶共存o19.根据权利要求18的方法，其中所述4-a-葡聚糖基转移酶是来源于水生栖热菌的淀粉麦芽糖酶。全文摘要本发明涉及生产糖原的方法，所述方法包括用能合成糖原的分支酶在溶液中处理底物由此生产糖原的步骤，其中所述底物是主要通过α-1，4-葡萄糖苷键连接并且聚合度为4或更大的α-葡聚糖，而且开始反应前溶液中糖的数均分子量大于180，但是不超过150,000。这种分支酶的分支酶活性/降解活性可以是500或更低。这种分支酶可以是热稳定的分支酶。文档编号C12P19/18GK101198703SQ200580038018公开日2008年6月11日申请日期2005年9月28日优先权日2004年9月30日发明者栗木隆,梶浦英树,高田洋树,鹰羽武史申请人:江崎格力高株式会社