专利名称：1,3,4-噁二唑类衍生物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及噁唑类化合物，具体是一种噁二唑类衍生物及其制备方法，以及该噁二唑类衍生物作为荧光指示剂在检测细胞内钙离子中的应用。
背景技术：
钙离子作为第二信使广泛参与了细胞的各种生理活动的调控，如肌肉的收缩、心脏的跳动、内分泌、外分泌腺的分泌、糖原的合成分解、电解质的转运、多种激素、酶类和神经递质的释放、DNA的合成、细胞的代谢与功能的调节等。在正常细胞中，细胞内游离的Ca2+浓度约为O. lymol/I^l.Oymol/L，细胞外钙离子浓度比细胞内钙离子浓度高I万倍，约为I. 5mmol/L0细胞内外浓度梯度的存在是Ca2 +作为细胞信使的基础。当细胞受到刺激时，胞内Ca2 +浓度将升至f 10 μ mol/L，从而引起一定的生理反应。许多研究表明，人体的疾病和衰老过程是由于各种原因所致的机体Ca2+调节失衡，细胞内Ca2+含量增加、导致细胞内、 外Ca2+浓度差下降而引起的。因此，准确测定细胞内Ca2+的浓度及动态的变化具有非常重要的意义。目前，测定细胞内Ca2+的方法有生物发光蛋白法、有机显色剂法、离子传感器法、微电极法、核磁共振法、荧光指示剂法等。理想的胞内Ca2+的测定方法是在亚细胞水平无损伤地、直接、迅速、实时地观察细胞内任意部位的Ca2+的动态变化而不影响细胞内正常的生理、生化过程；而且要求指示剂与Ca2+结合的响应速度快于胞内Ca2+信号引起的相关生理和生化反应的速度；此外，还要求指示剂的选择性好，灵敏度和时空分辨率高。这里，荧光指示剂法以其高的灵敏度和选择性、响应速度快等优点显示出独特的优势，并且，荧光显微成像技术可通过使用Ca2+荧光指示剂实现细胞内Ca2+的高时空分辨。现在可用的Ca2+荧光指示剂分为比率型和非比率型两类。比率型荧光指示剂是采用两个测定波长处荧光强度的比值，利用指示剂与Ca2+结合前后的荧光强度的变化作为定量测定的基础。该方法可有效消除因指示剂负染不匀、生物样品厚度不均及设备等因素引起的误差，从而得到比非比率型荧光指示剂更准确的测定结果。比率型荧光指示剂分为激发比率型和发射比率型两种。现在可用的商业化的比率型Ca2+荧光指示剂(包括激发型和发射型)只有几种，如Fura-2，Indo-I等，但是这些指示剂有的需要紫外光的激发，导致生物样品的损伤和生物样品自身突光的干扰(a. Grynkiewicz, G.等人，J. Biol. Chem. 1985, 260, 3440-3450. b. Gee, K. R.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.，2000,10,1515-1518);有的由于其解离常数(Kd)值较小，不适合用于测定细胞或者生物样品高浓度Ca2+的区域和动态Ca2+的变化,如Bis-fura-2, Fura-red等(Takahashi, A.等人，physiological reviews, 1999，79，1089-1125)。因此，发展 Ca2+指示剂的焦点就集中在可见光或近红外的激发、好的选择性、高的灵敏度、大的Stokes位移、成比率测量等，并且该指示剂能够很方便负载于细胞或组织中，利用荧光显微成像技术实现对细胞内Ca2+的高时空分辨。
发明内容
本发明的目的之一是提供1，3，4-噁二唑衍生物；目的之二是提供该衍生物的制备方法，该方法工艺简单、成本低廉；目的之三是提供该衍生物的用途，即该衍生物可作为荧光指示剂检测细胞内的Ca2+，该指示剂对Ca2+有高的灵敏度和选择性，且对Ca2+的测定表现为成比率的激发或发射，并能够有效减小激发光和细胞或生物样品自身荧光的干扰，还可凭借裸眼来判断指示剂与Ca2+结合的情况。本发明提供的一种1，3，4-噁二唑类衍生物，其结构式为
权利要求
1.一种1，3，4-噁二唑类衍生物，其特征在于结构式
2.如权利要求I所述的一种1，3，4-噁二唑类衍生物的制备方法，包括如下步骤 a.在惰性气体保护下，将2-(4-烷氧基)-苯基)-5- (4-溴甲基)-苯基)-1，3，4-噁二唑和I丐离子响应基团按照摩尔比1:1，通过Wittig反应4小时,制得产物粗品； b.将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品； 所述的4-烧氧基为4-甲氧基苯、4-乙氧基苯或4-丙氧基苯。
3.—种1，3，4-噁二唑类衍生物，其特征在于结构式
4.如权利要求3所述的一种1，3，4-噁二唑类衍生物的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行 a.在惰性气体保护下，将2-(4-烷氧基)-苯基)-5- (4-溴甲基)-苯基)-1，3，4-噁二唑和I丐离子响应基团按照摩尔比2:1,通过Wittig反应4小时,制得产物粗品； b.将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品； 所述的4-烧氧基为4-甲氧基苯、4-乙氧基苯或4-丙氧基苯。
5.如权利要求I或3所述的一种噁二唑类衍生物作为检测细胞内钙离子的荧光指示剂。
全文摘要
本发明公开了一种1,3,4-噁二唑类衍生物及其合成方法，以及衍生物作为荧光指示剂用于细胞内钙离子(Ca2+)的检测。该方法包括如下步骤在惰性气体保护下，将1,3,4-噁二唑衍生物和钙离子响应基团，通过wittig反应，制得产物粗品；将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品。该1,3,4-噁二唑类衍生物表现出对Ca2+高的灵敏度和好的选择性，大的Stocks位移，成比率测量等优点；由于该指示剂在结合Ca2+前后颜色有较大的变化，可方便地通过裸眼识别判断；此外，该指示剂还可负载于细胞中，在激光共聚焦显微镜下可方便检测到细胞内Ca2+信号及其浓度的变化。
文档编号C07D271/107GK102827098SQ201210317190
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者刘巧玲, 樊丽, 韩玉洁, 范萌, 双少敏, 董川 申请人:山西大学