一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
【专利说明】一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及 其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪传染性胃肠炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 猪传染性胃肠炎（Porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是一种 由α-冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（transmissivle gastroenteritis virus of swine，TGEV)引发的猪的一种高度接触传染性疾病。该病毒可在易感动物小肠绒毛上皮细 胞上复制，导致细胞变性、绒毛缩短等并引起营养吸收障碍和腹泻。不同年龄和品种猪均易 感。新生仔猪感染TGEV后20h内呈现胃肠炎症状，在l-4d死亡，1周龄仔猪感染后死亡率 可达100%。
[0004] 猪传染性胃肠炎（TGE)是一种世界范围内流行的疾病，美国的Doyle和 Hutchingsl946年首次道了 TGE，之后日本、英国、加拿大、朝鲜等许多国家相继报道了本 病，呈现世界性分布。我国从20世纪50年代末期就有该病的报道，近年来全国各地区地区 时有发生与流行，并且经常伴随着与猪轮状病毒病和猪流行性腹湾病的混合感染，目前无 有效的治疗药物，因此给我国养猪业造成了极大地经济损失。由于TGE的发病日龄小，感染 率、死亡率高，世界动物卫生组织（OIE)已将其列为B类疾病中必检的传染病。因此，很有 必要对猪传染性胃肠炎的快速诊断方法进行研究来有效而快速地防控TGE。
[0005] 对猪传染性胃肠炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪传染性胃肠炎的关键。目 前已建立了病毒分离、免疫电子显微镜技术（IEM)、血清学试验、核酸探针和聚合酶链反应 (PCR)等方法。传统的病毒分离鉴定方法尽管可以作为确诊该病的最终诊断依据，但其操作 时间长，过程复杂，不适于快速检测要求。IEM、核酸探针和PCR等技术具备敏感性高及特异 性强等优点，但对试验条件要求比较高，需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，且操作相对 复杂，检测成本高，只有专业检测实验室才能配备，基层单位难以开展容易造成实验室污染 导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决基层检测猪传染性胃肠炎病毒困难、耗时长和仪器昂贵 等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，为实现本发 明目的所使用的技术方案为：一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该 试剂盒包括RT-LAMP引物、2X反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪传染性胃肠 炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3 (SEQ ID NO :1)与B3 (SEQ ID NO: 2)、内引物 FIP (SEQ ID N0:3)与 BIP (SEQ ID N0:4)和环引物 LF (SEQ ID N0:5)与 LB (SEQ ID NO ：6)； 其中： F3 TCAACAGATTGGTTATTGGAAT B3 ATTAGCACCACGACTACC FIP AGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA BIP GTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC LF CTCTTTACGTTGGCCCTTCAC LB GATGGAGTTGTCTGGGTTGC 所述的 2X 反应缓冲液是 Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine 和 dNTPs〇
[0007] 以上所述的猪传染性胃肠炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒 提取的猪传染性胃肠炎病毒的RNA，自猪病变组织样品或粪便中提取的猪传染性胃肠炎病 毒的RNA。
[0008] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0009] 以上所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL 35-55mM、KCL 15-35mM、MgSO4 15-20mM、（NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0.4-0.8%、Betaine 1.5-3.0M 和 dNTPs 2.5-4mM，其 配制方法在pH为8. 6条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0010] 一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上 检测疑似猪传染性胃肠炎病变组织或猪粪便排泄物中是否含有猪传染性胃肠炎病毒，具体 检测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪传染性胃肠炎病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系建立 (4) RT-LAMP检测方法。
[0011] 以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25 μ 1计， 2X反应缓冲液 12. 5 yL EM IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 猪传染性胃肠炎病毒RNA 5 yL 超纯水 补足25 μ L。
[0012] 以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测 的方法。
[0013] 以上所述的RT-LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监 控，反应温度为63°C、反应在10-30分钟间出现扩增。
[0014] 本发明的实质性特点和进步是： 1)特异性强 本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出 来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
[0015] 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为I. 65X 10 5 ng/μ L，而使用本发明的RT-LAMP检测方法， 检测限约为1.65X 10 7 ng/μ L，是普通PCR的100倍。
[0016] 3)迅速获得结果 普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应 方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA 提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在10分钟 左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进 行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反 应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳 性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫 外线分析显像来判定结果，从基因组RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
[0017] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在 反应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。此外，本发明的 RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进 行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
[0018] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeter real-time LA-320池度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果， 不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可 求出各时间的猪传染性胃肠炎病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明的RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1 :猪传染性胃肠炎病毒；2 : 猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；3 : 口蹄疫病毒；4 :猪瘟病毒；5 :圆环病毒2型；6 :猪细小 病毒；7 :伪狂犬病毒；8 :流行性腹泻病毒；9 :空白对照(水)。结果显示猪传染性胃肠炎病毒 反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
[0020] 图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪传染 性胃肠炎病毒敏感性检测的结果。其中1:1.65x1ο 1 ng/μ L ;2 :1. 65 X 10°ng/μ L ;3: I. 65 X 10 ng/ μ L ；4 ： I. 65 X 10 2ng/ μ L ； 5 ： I. 65 X 10 3ng/ μ L ；6 ： I. 65 X 10 4ng/ μ L ；7 ： L 65X 10 5ng/yL ;8 :1· 65X 10 6ng/yL ;9 :1· 65X 10 7 ng/yL ;10 :水。猪传染性胃肠炎病 毒基因组RNA的起始浓度为I. 65 X IO1 ng/ μ L，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和 PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为1. 65 X 10 7 ng/μ L，而普通PCR方法检 测限约为 1.65X 10 5ng/μ L。
[0021] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA 为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0022] 图5是本发明猪传染性胃肠炎病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对 应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪传染性胃 肠炎病毒拷贝数。
【具体实施方式】
[0023] 1、材料的准备 猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、圆环病 毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒，均为市售疫苗。RT-LAMP RNA扩增试 剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204 ;病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自 康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
[0024] 2、RT-LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的猪传染性胃肠炎病毒N基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软 件PrimerExplorer V4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内 引物，LF和LB为环引物，其中 F3 TCAACAGATTGGTTATTGGAAT B3 ATTAGCACCACGACTACC FIP AGTAGAAGAACCACCTTTCAG