GAAGGACAAACTCGCTATCGCA BIP GTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC LF CTCTTTACGTTGGCCCTTCAC LB GATGGAGTTGTCTGGGTTGC 3、病毒基因组RNA提取 使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548)提取 猪传染性胃肠炎病毒或疑似猪传染性胃肠炎病毒感染的病变组织和粪便的DNA/RNA，以及 对照病毒的基因组DNA/RNA。
[0025] 4、RT-LAMP反应体系建立 按照试剂盒说明书，按25 μ 1体系配置： 2X反应缓冲液 12. 5 yL EM IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 猪传染性胃肠炎病毒RNA 5 μ L 超纯水 补足25 μ L。
[0026] RT-LAMP反应在以实时浊度仪（LA-320C，日本荣研公司）进行密闭全程监控的形 式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品 达到〇. 1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度 以63 °C做为反应温度。
[0027] 5、RT-LAMP 检测方法 1)特异性检测 使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪传染性胃肠炎病毒以及对照毒株-猪繁殖 障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、圆环病毒2型、细小病毒、伪狂犬病毒和流 行性腹泻病毒的基因组DNA/RNA，作为RT-LAMP反应的模板，同时以水作为空白对照，检验 RT-LAMP方法的特异性。
[0028] 2)敏感性检测 提取的猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA，测定其浓度，用RNA-Free Water连续10倍倍 比稀释成9个稀释度，以各RNA稀释度作为模板，进行RT-LAMP扩增和PCR扩增，对比本发 明的RT-LAMP方法和普通PCR方法对检测猪传染性胃肠炎的敏感性。
[0029] 3)荧光可视化检测 根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙 黄绿素商用染料，63°C下反应30分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线 分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
[0030] 实施例1 RT-LAMP检测方法的特异性结果 对1株猪传染性胃肠炎病毒、7株对照病毒和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如图1所 示，猪传染性胃肠炎病毒反应管在10分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照 病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。
[0031] 实施例2 RT-LAMP检测方法的敏感性结果 猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA的起始浓度为1. 65 X 10 ng/ μ L，经10倍倍比连续稀 释后，进行RT-LAMP和普通PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的RT-LAMP 法检测限约为1. 65 X 10 7ng/ μ L，而普通PCR法检测限为1. 65 X 10 5ng/ μ L。
[0032] 实施例3 RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果 根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，63°C反应60分钟后，在紫外灯下观察，图 4为观察结果，左管为以猪传染性胃肠炎病毒RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为 阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，只需使用 试剂盒配合本方法设计的RT-LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63°C 60分 钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
[0033] 实施例4猪传染性胃肠炎病毒定量标准曲线的绘制 以猪传染性胃肠炎病毒RNA为模板，以本RT-LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR 扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMDIS-T，转化大肠杆菌感受细胞 DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒RNA，经测序确认后，作为标准样 品，测定重组质粒PMD18-T-N的起始浓度，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释9个 稀释度，取各稀释度5 μ L作为模板进行RT-LAMP扩增， 设置对照：浓度为 I. 68Χ101 ng/yL、l. 68X10° ng/yL、l. 68X10 1 ng/yL、 I. 68 X 10 2 ng/ μ L、I. 68 X 10 3 ng/ μ L、I. 68 X 10 4ng/ μ L、I. 68 X 10 5 ng/ μ L、I. 68 X 10 6 ng/ μ L、I. 68X 10 7 ng/ μ L的标准重组质粒pMD18-T-N样品各一个，因为浓度的负对数值 与浊度值为〇. 1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1)做成 标准曲线，获得标准曲线方程，y=0. 4384x-5. 1347,如图5所示。从标准曲线方程来看相关 系数R2为0. 9937,呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓 度为IOy，再乘以基数1.68,即为1.68X10 y ng/yL。依据拷贝数换算公式copies/yL= (6. 02X 1023X (ng/ulX10 9)) / (RNA IengthX 660)，RNA length 为载体序列大小加上 目的基因序列大小，为2693+187=2880 bp，将其换算成拷贝数（copies/yL) :6. 02 X IO23 X (1.68X10 yX IO 9)/ (2880 X 660)，简化为：5.32X 10s X IOy。如某试验样品达到 浊度值为〇. 1的时间为20分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于3. 63,则浓度 为1〇 3·63,再乘以基数1. 68,即为该试验样品的浓度I. 68Χ 10 3^ng/ μ L，拷贝数为5. 32 X 10s XlO 3·63,即为5. 32 X IO437Copies/μ L，从而达到定量的效果。
[0034] 表1样品浓度负对数值与TGEV-LAMP浊度值时间线性关系表
【主权项】
1. 一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包 括RT-LAMP引物、2X反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪传染性胃肠炎病毒 RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)、内引 物FIP(SEQIDN0:3)与BIP(SEQIDN0:4)和环引物LF(SEQIDN0:5)与LB(SEQID NO：6)； 其中： F3TCAACAGATTGGTTATTGGAAT B3ATTAGCACCACGACTACC FIPAGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA BIPGTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC LFCTCTTTACGTTGGCCCTTCAC LBGATGGAGTTGTCTGGGTTGC 所述的 2X反应缓冲液是Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇2. 根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征 在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取，自 猪病变组织样品或粪便中提取的猪传染性胃肠炎病毒的RNA。3. 根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征 在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。4. 根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特 征在于，所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL15-35mM、MgS04 1 5-20mM、 (NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0· 4-0. 8%、Betaine1· 5-3.OM和dNTPs2. 5-4mM〇5. -种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于 兽医临床上检测疑似猪传染性胃肠炎病变组织或猪粪便排泄物等是否含有猪传染性胃肠 炎病毒，具体检测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪传染性胃肠炎病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系的建立 (4) RT-LAMP检测方法。6. 根据权利要求5所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用， 其特征在于，所述的RT-LAMP反应体系建立以25μ1计， 2X反应缓冲液 12. 5yL EM 1 yL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20 pmol LB 20 pmol F3 5pmol B3 5pmol 猪传染性胃肠炎病毒RNA 5 yL 超纯水 补足25μL。7. 根据权利要求5所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用， 其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测 的方法。8. 根据权利要求5所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用， 其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
【专利摘要】本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪传染性胃肠炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，其应用包括使用该试剂盒检测猪传染性胃肠炎病变组织和带毒粪便。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的逆转录环介导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪传染性胃肠炎病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪传染性胃肠炎病毒带来便利。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公开号】CN105385789
【申请号】CN201510942772
【发明人】陈忠伟, 张宁, 何颖, 秦毅斌, 卢冰霞, 郭旋, 赵武, 刘磊, 李斌, 段群棚, 周英宁, 梁家幸, 杨思仪, 蒋冬福, 苏乾莲
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所, 广西农垦永新畜牧集团金光有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月16日