一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法
【专利说明】一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物及其检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物。
【背景技术】
[0002]西方马脑炎病毒(Wasternequine encephalitis virus, WEEV)属于披膜病毒科甲病毒属，是引起西方马脑炎的病原体。该病毒可经呼吸道传播感染，但主要通过蚊虫传播。西方马脑炎可引起人和马发病，病马常呈亚临床症状，死亡率低于30% ;WEEV对人的致死率明显低于东方马脑炎病毒。该病在北美西部呈地方性流行，主要分布于加拿大、美国西部和中部，南美一些国家也有本病发生，如巴西、阿根廷、智利、秘鲁和乌拉圭等国家。西方马脑炎在我国也有报道，1990年何海怀等从新疆乌苏县采集的按蚊和博乐县采集的全沟硬蜱中分离出WEEV。吕新军在对我国人体血清调查中发现，WEEV抗体的阳性率为2.71%，但在马属动物中的流行情况未见相关报道。随着我国马术运动的发展，国际马术比赛的日益频繁，我国进出境马匹的数量也在不断增加。为保障我国养马业的健康发展，保证国际赛事的顺利进行，建立快速、敏感、特异的WEEV检测方法十分必要。本试验针对WEEV E1基因，筛选高度保守的片段，设计引物构建了阳性质控品，并建立了 WEEV PCR-DHPLC检测方法，并对其敏感性和特异性进行了分析。
[0003]目前，检测WEEV常用方法有病毒分离、血凝试验、血凝抑制试验、荧光RT-PCR等。传统的病原分离及血清学诊断方法操作繁琐，且对试验条件的要求较高，RT-PCR方法虽然能对该病毒进行检测，但仅依赖普通凝胶电泳还达不到高通量集成化诊断的层次。荧光RT-PCR和基因芯片等技术检测成本又相对较高。因而需要研究一种相对廉价，并能够对WEEV进行高通量快速排查、准确鉴别的集成化诊断技术。变性高效液相色谱(Denaturinghigh-performance liquid chromatography,DHPLC)是近期发展起来的一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法。它利用样品分子对固定相亲和力的差异，在用流动相洗脱时，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移动速率不同而达到分离的目的。一般来说，产物分子量1%大小的片段即能够被分开。例如，lOObp的产物能和lOlbp的产物分开，而用常规0.8%的琼脂糖凝胶电泳，其相差10 bp的片段大小也是无法被分离。因此利用DHPLC可以区分不同长度DNA片段的特点，进行细微差异的DNA序列分析即可从毒株水平快速识别各亚型病原。
[0004]目前国内外的已见报道主要用于进行大肠杆菌等食品微生物的检测鉴别、致病微生物耐药菌株的鉴别筛选以及遗传疾病的基因诊断等。本研究旨在根据WEEV的序列特点，将PCR-DHPLC技术用于WEEV的检测，通过特异性、敏感性试验，并与荧光定量RT-PCR方法进行比较，建立一种特异性强、敏感性高的PCR-DHPLC检测新技术，用于WEEEV的快速、高通量检测。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:提供一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
首先，本发明提供的一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物，引物序列如下:
WEEDHPF: 5-TTTCACCCTTTGACCATA-3
WEEDHPR: 5-ATTTCATACCCTGATACTGC-3
WEE-E1 Template-F:5-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3
WEE-E1 Template-R:5-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3
利用上述引物，本发明还提供一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法，包括下列步骤:
(1)样品中病毒RNA的提取及特异性片段的扩增；
(2)PCR-DHPLC 分析。
[0007]所述的样品中病毒RNA的提取及WEEV特异性片段的扩增的具体步骤是:
样品中病毒RNA的提取:对样品或灭活毒株进行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法试剂盒提取RNA保存备用，具体方法按RNA提取试剂盒说明书进行，RT-PCR反应采用Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒对WEEV及用于特异性试验的病毒RNA进行反转录；
WEEV特异性片段的扩增:取5uL已制备的RNA，加入10 μ Μ的WEEDHPF和WEEDHPR各1 μ L ;5 X RT-PCR buffer 5 μ L ; 2.5mM dNTP 1 μ L 和 0.5 μ L Enzyme mix 进行 RT-PCR 扩增；反应条件为 50°C 30min ；94°C 15min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，35 个循环；72°C10mino
[0008]所述的PCR-DHPLC分析条件为:
色谱柱:PS-DVB & C18 DNASep 色谱柱(4.6mmX50mm,粒度 3 μπι);柱温:60.1°C ;流动相:0.0min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ；0.5min, 45.9%缓冲溶液A，54.1%缓冲溶液B ;5.0min, 36.9%缓冲溶液A, 63.1%缓冲溶液B ;5.lmin, 0%缓冲溶液A, 100%缓冲溶液B ;5.6min, 0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B ；5.7min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ；
6.6min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ;流速:0.9mL/min ;检测器:荧光检测器(光源:150W Xenon灯；激发谱带宽:15nm ;发射谱带宽:15.3nm ;检测灵敏度:在波长350nm积分2s);上样量:PCR产物5 yL ;在变性分析模式下，采用双链DNA单片段(double-strandedsingle fragment)分析模式，清洗模式采用normal,分析检测过程仪器梯度由Navigatorsoftware分析软件控制设定。
[0009]缓冲溶液A为:0.1M的TEAA，缓冲溶液B为:0.1M的TEAA+25%的乙腈。
[0010]本发明的有益效果:
本发明建立的WEEV的PCR-DHPLC方法在检测其他马病病毒时相互之间无交叉反应，未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰JtWEEV不同模板浓度进行检测，检测极限可达到102拷贝/ μ L。所建立的方法结果与荧光RT-PCR的符合率达100%。
【附图说明】
[0011]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0012]图 1 cRNA 的 RT-PCR 鉴定结果。M，DL2000 DNA Marker ; 1-2，cRNA RT-PCR 鉴定产物。
[0013]图2 PCR-DHPLC检测WEEV的特异性。1.WEEV ；2.马鼻肺炎1型；3.马动脉炎病毒；4.马流感病毒(H3N8) ;5.东方马脑脊髓炎病毒；6.委内瑞拉马脑脊髓炎病毒；7.西尼罗病毒；8.空白对照
图 3 PCR-DHPLC检测 WEEV 的特异性。1.1.0X106 拷贝 / μ L ;2.1.ΟΧ 105拷贝 / μ L ;3.1.ΟΧΙΟ4 拷贝/yL ;4.1.ΟΧ 10 3 拷贝 / μ L ;5.1.Ο X 10 2 拷贝 / μ L ;6.10 拷贝/yL;7.1.0拷贝"1^
图4 WEEV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性分析。
【具体实施方式】
[0014]实施例1西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立 1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验毒株、核酸
马鼻肺炎病毒(EHV-1 )、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(H3N8)、西尼罗病毒RNA(WNV)、WEEV RNA、东方马脑脊髓炎(EEEV) RNA和委内瑞拉马脑脊髓炎(VEEV)RNA由本实验室保存。
[0015]1.1.2主要试剂
RT-PCR反转录试剂盒、RNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒购自Qiagen公司；三乙胺乙酸盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自TEDIA公司；引物由上海Invitrogen生物技术公司合成；胰化蛋白胨、酵母抽提物；琼脂糖、氨节青霉素、等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。硅胶膜型DNA纯化试剂盒、硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、DNA Marker (DL2000:2000 1000 750 500 250 100bp )，均购自大连宝生物有限公司。其它常规化学试剂购均为分析纯。
[0016]1.1.3主要仪器设备及生物信息学分析软件
变性高效液相色谱仪器(Transgenomic Wave 4500),为北京环球基因公司产品；AllegraTM21R高速冷冻离心机，BeckmanCoulter公司产品；Sigmal_15普通离心机，Sigma公司产品；DNAStar7.1软件(包含MegAlign程序和Editseq程序)；Premer 5.0引物设计软件。
[0017]1.2方法
1.2.1引物设计引物序列如下:
WEEDHPF: 5-TTTCACCCTTTGACCATA-3WEEDHPR: 5-ATTTCATACCCTGATACTGC-3WEE-E1 Template-F:5-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3WEE-E1 Template-R:5-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3
1.2.2病毒RNA的提取及WEEV特异性片段的扩增<