专利名称：检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于MGB短探针的荧光RT-PCR方法检测东部马脑炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于MGB短探针针对对6K和El靶区域的荧光定量RT-PCR检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，适用于东部马脑脊髓炎病毒的快速分子生物学诊断和检测，可用于东部马脑脊髓炎病毒的检测，出入境检疫等，属于动物检疫领域。
背景技术：
东部马脑脊髓炎病毒(easternequine encephalomyelitis virus, EEEV)属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Genus Alphavirus)的成员，病毒粒子呈球形,直径60-65nm。有囊膜，囊膜上有糖蛋白纤突，核衣壳中包裹有单链的基因组RNA。是传染性和致死率很高的人畜共患病，能感染以马为代表的多种动物宿主，存在极大的潜在威胁，是目前 国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一。主要表现为发病急，持续高热，有严重中枢神经系统症状。人感染后临床表现与乙型脑炎很相似，对人致死率最高可达90%，EEEV为神经性甲病毒，可引起人和动物脑脊髓炎。自然状态下，病毒在鸟类和蚊子之间交替感染，人和马是该病毒的终末宿主。在马和人群中呈散发流行。主要发生于仲夏到秋末期间；主要临床症状为发热、厌食和精神高度沉郁，对于亚临床感染病例，病症相对温和。在美国，该病小规模爆发几乎年年都有，在东北部各州及佛罗里达，大量的马匹散在发病，偶尔也有死亡数百匹马的严重暴发。地方性EEEV的十分局限的滋生地可能反映它对媒介——黑尾赛蚊的严格需求。这种蚊越冬时成为幼虫，它需要阴暗、富含有机质的潮湿环境。美国东部有这样的环境。另外成年蚊的群体密度可以反映诸如雨量和温度等气候因素的变化。东方型马脑炎流行的条件是在地方性流行地既需要大量的黑尾赛蚊群及与之相适应的易感鸟群，同时还需要兼有嗜鸟血习性和嗜人或马血习性的其他蚊群作为疫病的传播媒介。这样复杂的条件就限制了东方型马脑炎的分布与流行范围，所以该病在动物和人群中的发生概率较低，而且地理上严格地限制在地方性流行区域。主要呈蚊一鸟传播方式。蚊是病毒的传播媒介，鸟是病毒的贮存宿主，该病毒在鸟类体内大量增值后，可以借助媒介昆虫而扩大传播范围。蚊在吸食含有病毒的血液后，病毒可在蚊体内增值并可达较高滴度，并持续终生存在。不同种蚊对病毒的感染阈(能使1% —5%蚊感染的病毒量)不同。其中，黑尾塞蚊(Culiseta melanura)是鸟类中EEEV的主要传播媒介。鸟类对EEEV十分易感，在病毒传播过程中，它们扮演着极为重要的角色，起着扩大感染宿主范围的作用。本病的传播与蚊和鸟类的分布密切相关。此外，EEEV还存在蚊一蚊传播方式。其他无脊椎动物如螨、鼠、蛇等啮齿类和爬行类动物在传播EEEV上也有一定意义。本病不会经气溶胶传播。EEEV为单股正链RNA病毒，全长分别为11. 7kb。它们具有甲病毒属特征的4个保守区，5’端前46nt形成带柄的环状，NSPl编码区内形成带柄环状，由24nt组成的42S与26S的结合部，位于3’端后和PolyA尾前19nt组成的区域。基因组编码4种非结构蛋白(NSP1 4)和5种结构蛋白(衣壳蛋白C，包膜糖蛋白El、E2、E3，6K，基因排列顺序为5’-C-E3-E2-6K-El-3’)。其中26S亚基因组RNA编码衣壳蛋白、包膜糖蛋白E1\E2和6K信号肽。E2蛋白是该病的主要保护性抗原，具有7个部分重叠的抗原表位，分别与血凝抑制、中和病毒和抗病毒感染活性有关，而E2-1区中的C区是甲病毒属特异性抗原表位，含病毒与细胞作用的受体。东部马脑脊髓炎为我国一类动物疫病，国家质量监督检验检疫总局将其列为出入境检验检疫一类动物疫病，随着动物国际贸易的日益繁荣，特别是各大型国际体育赛事的日益频繁，出入境的马匹越来越多，同时由于参赛马匹来自不同的国家和地区，健康状况参差不齐，疫情非常复杂，这些因素都可能危害我国养马业的发展和马术运动的正常开展，因此开展东部马脑脊髓炎的检测技术就显得尤为重要。根据临床症状、流行病学以及组织病理学可对本病作出初步诊断。确诊必须依靠病毒分离、鉴定，病毒抗原检测，核酸快速检测方法以及特异性血清学检测方法。病毒分离
材料需要有新鲜的马和其他发病动物的脑以及媒介昆虫组织。可以将待检材料接种小鼠、豚鼠、鸡胚、新生雏鸡或仓鼠肾原代细胞、鸡胚或鸭胚原代细胞以及BHK-21细胞株进行病毒分离。3周龄以下小鼠脑内接种分离病毒方法最为敏感。病毒鉴定通常采用交叉中和试验进行。亚型和抗原变异株的鉴定可以用针对El或E2糖蛋白的单抗进行血凝抑制试验(HI)或者采用寡核苷酸指纹图谱技术加以鉴别。抗原检测方法包括固相反向补体结合试验，免疫电镜，双抗体夹心ELISA检测方法，间接免疫荧光方法。特异性抗体检测方法包括中和试验，血凝抑制试验和ELISA检测方法。分子生物学检测方法由于快速简便，已经开始应用于东部马脑脊髓炎的快速诊断和检测，特别是荧光RT-PCR检测技术更为快速和特异。本研究为保证方法的通用性，保证探针的匹配性，我们在大量序列分析基础上，设计特异性引物探针用于检测东部马脑脊髓炎病毒。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测东部马脑脊髓炎病毒核苷酸序列，包括引物序列和MGB探针序列。本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测东部马脑脊髓炎病毒的检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案选择东部马脑脊髓炎病毒特定保守序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为23个碱基左右，GC含量为50% — 60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。MGB短探针的长度为18碱基。一组检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，如下1)5’ -GGG CCG GCT TTT TTA CTT GTC TG-3’ (SEQ ID NO 1)2)5，-GTA CGG GAT CCC CAC CTT GTT C_3，(SEQ ID NO 2)3)5，-[FAM]-CGC CTT GGG CGC CGC ARC-[MGB]-3，(SEQ ID NO 3)其中R代表A或G ;序列I)和2)分别为检测东部马脑脊髓炎病毒的正义引物和反义引物，序列3)为检测东部马脑脊髓炎病毒的荧光探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM (6-carboxy-突光素)，3’端标记淬灭基团MGB。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了东部马脑脊髓炎病毒检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。检测东部马脑脊髓炎病毒检测试剂盒，由以下组分组成I)裂解液购自INVITR0GEN公司；2) RT-PCR反应液，表I为反应液配方；表I反应液配方 组分终浓度
5XRT-缓冲液IX RT-缓冲液
25mM MgCl2I. 5mmol/L
2. 5mM dNTPO. 05mmol/L dNTP~
正义引物0. 3umol/L
反义引物0.3ymol/L
荧光探针O. 3umol/L5 X RT-缓冲液，25mM MgCl2购于Promega公司；2· 5mM dNTP购自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托上海基康生物工程有限公司合成，其中5XRT-缓冲液组成为 375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT、250mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 3，25°C )。3)反转录酶 M-MLV，购自 Promega 公司，200U/ μ L。4) RNA 酶抑制剂，购自 Promega 公司，40U/ μ L。5) Taq DNA 聚合酶 5U/ μ L,购自 Promega 公司。6)DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率彡18. OM Ω. cm的水，Mi I Iipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为O. 1%，37°C搅拌处理 12hr，151bf/in2(1034X105Pa)高压蒸汽灭菌 15 分钟。7)阴性对照东部马脑脊髓炎病毒阴性组织样品，用O. Olmol/L pH7. 2PBS缓冲盐水制成20%悬液，151bf/in2(1034X105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。8)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段。回收东部马脑脊髓炎病毒ssp.NorthAmerican variant 8765_10185nt RT-PCR 扩增产物，长度为 1421bp，与 pMD_T20 载体(购自TAKARA公司)进行连接，转化TOPlO感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为PMD-T20-EEEV-8765-10185。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-SP6试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备东部马脑脊髓炎病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。东部马脑脊髓炎病毒ssp. North American variant 8765_10185nt基因片段如序列表中SEQ ID NO 4所示。对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定0D260nm/0D280nm的比值在I. 6 - 2. O之间，即视为合格引物。对含有IO4拷贝数的RNA模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相对较低，且升幅较闻。将筛选好的引物浓度从O. 1“11101/1至0.8 4 11101/1以0· I μ mol/L为间距递增，探针浓度从O. 025 μ mol/L至O. 2 μ mol/L以O. 025 μ mol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现采用表I所列引物浓度和探针浓度时荧光增幅相对较高。我们针对Roche Light Cycler2. O, Roche480 以及 ABI 7900HT 荧光 PCR 检测仪， 在42°C /30min,94°C /3min的逆转录后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进而确定扩增的循环次数为40。最终确定采用扩增效果较好的方案为RT-PCR反应参数反应条件为 42°C /30min,94°C /3min ；94°C /15s，58°C /5s, 65°C /30s, 40 个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。研究表明，Mg2+浓度对荧光PCR扩增结果有一定，故应用筛选好的弓丨物探针，将Mg2+的浓度从0. 5mmol/L至5. 0mmol/L以0. 5mmol/L为间距递增,对不同Mg2+浓度条件下的扩增进行了比较。优化后的Mg2+为见表I。我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义74°C作用30分钟，能将IOnM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求具DNA聚合酶活性及5’ 一 3’核酸外切酶活性，无3’ 一 5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94°C I小时后仍保持50%活性。从多次重复试验结果中选定I. 25U Taq酶作为使用的Taq酶量。本发明的优点是本发明选择东部马脑脊髓炎病毒核酸6K和El区作为靶区域，设计引物和探针建立并优化了东部马脑脊髓炎病毒荧光RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果I)快速该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果。2)更为灵敏比常规的PCR方法灵敏度高100倍；对已知拷贝数的体外转录RNA进行检测。结果显示，灵敏度均可达10拷贝/反应，重复性好。3)特异由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统RT-PCR方法；建立的荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的其他病毒以及相关弹状病毒时，结果为阴性，未发现交叉反应。方法研究过程中涉及的病毒核酸见表2。表2方法研究中用到的病毒核酸
权利要求
1.一组检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 3所示，其中序列SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2分别为检测东部马脑脊髓炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO :3为检测东部马脑脊髓炎病毒的荧光探针。
2.根据权利要求I所述的检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于所述荧光探针序列SEQ ID NO 3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
3.—种检测东部马脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成 1)裂解液； 2)荧光RT-PCR反应液，其中包括RT缓冲液、MgCL2、dNTP、正义引物、反义引物和荧光探针； 3)反转录酶M-MLV； 4)RNA酶抑制剂； 5)Taq DNA聚合酶； 6)DEPC 7jC ； 7)阴性对照东部马脑脊髓炎病毒阴性组织样品； 8)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列； 其中，正义引物为序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述荧光RT-PCR反应液包括1XRT缓冲液、I. 5mM MgCL2、0. 05mM dNTP、0. 3 μ M正义引物、O. 3 μ M反义引物和O. 3μ M荧光探针。
全文摘要
本发明公开了检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒。该检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3所示，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为检测东部马脑脊髓炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测东部马脑脊髓炎病毒的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物的检测东部马脑脊髓炎病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好、不易污染及操作安全的特点。
文档编号C12Q1/70GK102808043SQ20121033675
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者高志强, 谷强, 李海花, 张伟, 张鹤晓, 刘环, 蒲静, 乔彩霞, 张利峰, 吴亚琼, 于军超, 王慧珊 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心