专利名称：检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用基于MGB探针的荧光定量RT-PCR方法检测西部马脑炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于TaqMan针对衣壳蛋白编码区的荧光定量RT-PCR检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，适用于西部马脑脊髓炎病毒的快速分子生物学诊断和检测，可用于西部马脑脊髓炎病毒的检测，出入境检疫等，属于动物检疫领域。
背景技术：
西部马脑脊髓炎病毒(westernequine encephalomyelitis virus, WEEV)属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Genus Alphavirus)的成员，病毒粒子呈球形,直径60-65nm。有囊膜，囊膜上有糖蛋白纤突，核衣壳中包裹有单链的基因组RNA。能感染以马为代表的多种动物宿主，西部马脑炎马对人的致死率为10%左右。我国于1990年分别从新疆 乌苏县的一组赫坎按蚊和博乐县的全沟硬蜱中分离出WEEV。自然状态下，WEEV在鸟类和蚊子之间交替感染，人和马是该病毒的终末宿主。在马和人群中呈散发流行。主要发生于仲夏到秋末期间；主要临床症状为发热、厌食和精神高度沉郁，对于亚临床感染病例，病症相对温和。该病毒也可引起平胸类禽鸟的死亡。据报道，西方马脑脊髓炎(WEE)在美国西部、加拿大、墨西哥以及中美洲和南美洲有发生。西方马脑脊髓炎常在广阔地域内发生，如在1000平方英里的范围内都可见到散发病例。西方马脑脊髓炎(WEE)主要经蚊子传播，偶尔也可经小型野生哺乳动物传播。美国西海岸温暖潮湿地区常有可传播该病的蚊虫。病毒在蚊虫和野生鸟体内的相互循环传播导致了该病的持续存在，并呈散发流行。但目前尚未发现由鸟类引起的人的感染。本病的传播媒介为蚊虫，鸟类仅为贮存宿主。在人发生WEE之前，一般该地区会有马或野鸟的发病。本病可引起人和马的发病，人和马是该病毒的终末宿主。病马常呈亚临床感染，病症相对温和。感染马的致死率低于30%。该病潜伏期5 14天，临床症状包括发热、厌食和精神高度沉郁。严重时，病马表现为狂躁不安、失明、共济失调、精神极度沉郁、卧地不起、痉挛，最后可导致死亡。在热带或亚热带炎热潮湿、蚊虫活动猖獗的夏季，未接种西方马脑脊髓炎的马如果出现特征性的嗜睡症状，可怀疑感染本病，但确诊需要进行实验室检测。人感染本病毒后，患者表现为高热，头痛，痉挛，呕吐和嗜睡，有的迅速发展为昏迷状态而死亡。致死率一般为3 4%，明显低于脊髓部马脑炎病毒感染，儿童和婴儿感染死亡率高于成人。感染儿童中30%可能留有神经后遗症，如行动迟缓，癫痫和行为紊乱。本病成人感染率为1:1000，1 4岁儿童感染率为1:58，1岁以下婴儿感染率为1:1。WEEV为单股正链RNA病毒，全长分别为11. 5kb。它们具有甲病毒属特征的4个保守区，5’端前46nt形成带柄的环状，NSPl编码区内形成带柄环状，由24nt组成的42S与26S的结合部，位于3’端后和PolyA尾前19nt组成的区域。基因组编码4种非结构蛋白(NSPll)和5种结构蛋白(衣壳蛋白C，包膜糖蛋白El、E2、E3，6K，基因排列顺序为5’ -C-E3-E2-6K-E1-3’)。西部马脑脊髓炎为我国一类动物疫病，随着动物国际贸易的日益繁荣，特别是各大型国际体育赛事的日益频繁，出入境的马匹越来越多，同时由于参赛马匹来自不同的国家和地区，健康状况参差不齐，疫情非常复杂，这些因素都可能危害我国养马业的发展和马术运动的正常开展，因此开展西部马脑脊髓炎的检测技术就显得尤为重要。目前西部马脑炎主要靠血清学检查(免疫荧光法和ELISA)，普通RT-PCR法和流行病学资料作出诊断，但存在灵敏度低或易于污染的确定，不利于病毒的快速检测。因此，需要建立更高度敏感、特异和快速的检测方法，用于随时监测该病的流行情况并加以控制，同时也可应用于马匹等动物的出入境检测，为西部马脑炎的检测提供技术支持。本研究中基于MGB短探针采用TaqMan荧光RT-PCR —步法建立了用于WEEV检测的荧光RT-PCR检测技术，对反应条件进行了优化，使该方法高度敏感、特异。并通过灵敏度、特异性、重复性试验以及对临床样品的检测，结果进一步证明了该方法敏感、特异。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测西部马脑脊髓炎病毒 核苷酸序列，包括引物序列和探针序列。本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测西部马脑脊髓炎病毒的检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案选择西部马脑脊髓炎病毒特定保守序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为23个碱基左右，GC含量为50%_60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。探针的长度为18碱基。一组检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，如下I) 5’-CCGMGATCCRAACCCTCCTAG-3’ (SEQ ID NO I)2) 5’-GACCTCCTAAGATCTTCRATTTGAG-3’ (SEQ ID NO 2)3) 5，-[FAM]-CCGAAACGGCCTCCAGCG[MGB]-3，(SEQ ID NO 3)其中R代表A或G ;M代表A或C，序列I)和2)分别为检测西部马脑脊髓炎病毒的正义引物和反义引物，序列3)为检测西部马脑脊髓炎病毒的荧光探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM (6-carboxy-荧光素)，3’端标记淬灭基团MGB。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了西部马脑脊髓炎病毒检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。检测西部马脑脊髓炎病毒检测试剂盒，由以下组分组成I)裂解液购自INVITR0GEN公司；2) RT-PCR反应液，表I为反应液配方；表I反应液配方
组分终浓度
5XRT-缓冲液IX RT-缓冲液
权利要求
1.一组检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 3所示，其中序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2分别为检测西部马脑脊髓炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO :3为检测西部马脑脊髓炎病毒的荧光探针。
2.根据权利要求I所述的检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于所述 荧光探针序列SEQ ID NO 3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
3.—种检测西部马脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成 1)裂解液； 2)荧光RT-PCR反应液，其中包括RT缓冲液、MgCL2、dNTP、正义引物、反义引物和荧光探针； 3)反转录酶M-MLV； 4)RNA酶抑制剂； 5)Taq DNA聚合酶； 6)DEPC 7jC ； 7)阴性对照西部马脑脊髓炎病毒阴性组织样品； 8)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列； 其中，正义引物为序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述荧光RT-PCR反应液包括1XRT缓冲液、4. Ommol /T, MgCL2>O. OSmmoI /T, dNTP>O. 4 μ mol/L 正义引物、O. 4 μ mol/L 反义引物和O. 2ymol/L荧光探针。
全文摘要
本发明公开了检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒。该检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3所示，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为检测西部马脑脊髓炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测西部马脑脊髓炎病毒的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物的检测西部马脑脊髓炎病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好、不易污染及操作安全的特点。
文档编号C12N15/11GK102808044SQ201210336760
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者高志强, 谷强, 李海花, 张伟, 张鹤晓, 刘环, 蒲静, 乔彩霞, 张利峰, 吴亚琼, 于军超, 王慧珊 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心