专利名称：用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类哈氏弧菌的检测试剂盒，特别是一种用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒；本发明还涉及一种应用前述试剂盒进行检测的方法。
背景技术：
哈氏弧菌是一种具有发光特性的弧菌，在1936年由Johnson等将其命名为哈氏贝内克氏菌iBeneckea harveyi ), 1981年Baumann等将其正式归于弧菌属并命名为哈氏弧菌{Vibrio harveyi).该菌是海水中微生物区系的正常成员，也是海水中一种常见的致病菌。可引起海水养殖高体蛳、花鲈、斜带石斑鱼、长鳍真鲨、虹鳟和大西洋鲑、齿鲷、金头鲷、狼鲈、塞内加尔鳎、矛尾复鰕虎鱼等多种鱼类感染发病；该菌尤其是对对虾危害严重，曾引 起世界范围养殖对虾的大量死亡，有记述该菌引起印度尼西亚、菲律宾及台湾对虾育苗场斑节对虾和墨吉对虾幼体的大量死亡。可见哈氏弧菌能够引起多种海水养殖动物感染发病，严重制约了水产养殖业的发展。该菌传统的检验方法包括形态学检测、生理生化特征检测等，这些检测手段不仅工作量大，而且耗时长，已远远不能满足水产养殖生产上的诊断要求。编码DNA解旋酶B亚单位的基因(gyrB基因)序列具有保守性和变异性，其基因进化率较快，碱基替换频率较高，具设计PCR引物的保守区域，是弧菌科种间鉴定及检测的良好分子祀标。环介导恒温扩增技术(LAMP, loop-mediated isothermal amplification)是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，它具有很高的特异性和灵敏度，且反应在恒温下进行，快速简便，扩增产物量大，肉眼、电泳、浊度仪均可进行检测，不需昂贵的仪器。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种新的用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其灵敏度高、特异性强、操作简便，在水产养殖动物处于带菌状态或大规模爆发细菌性疾病之前能进行准确的检测。本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种应用前述试剂盒进行检测的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其特点是，其组成为
(O反应液A，I支，其体积百分比组成为
①IOXLampbuffer, 17% ；其中 Lampbuffer 的组成为200mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM (NH4) 2S04,20mM MgSO4，质量浓度 1% 的 Trition X-100，Lampbuffer 的 pH 为 8. 8 ；
②dNTP, 16. 5%，浓度为 IOmM ；
③硫酸镁水溶液，14%，浓度为25mM；
④甜菜碱水溶液，26.5%，浓度为8mol/L ；⑤vh-F3, 2. 5%,浓度为 10 μ Μ,
上游外部引物 vh-F3 为-.Ckk GAG CGACCA CTT CAT GT ；
⑥vh-B3, 2. 5%,浓度为 10 μ Μ,
下游外部引物 vh-B3 为TTA GCG CTG CAC GGA AAC ；
⑦vh-FIP, 10. 5%,浓度为 10 μ Μ,
上游内部引物 vh-FIP 为TCG CGC TCA AAG TCG AAG TGG-CAA GCG TTT GTT GAG CAC
C；
⑧vh-BIP，10. 5%,浓度为 10 μ Μ,
下游内部引物 vh-BIP 为TCT CGG TAG AAG TGG CGA TGC A-TCG CGT TGT GGG ATG
TTG ；
(2)反应液B 8000U 的 Bst DNA 酶，I 支；
(3)反应液C:10X荧光染料SYBR Green I，I支；
(4)哈氏弧菌基因组DNA的阳性对照试样，I支；
(5)健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，I支；
(6)超纯水，I支。本发明还提供了一种哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测方法，其特点是，该方法应用了以上技术方案所述的试剂盒；其步骤如下
(1)DNA抽提取ImL待检样品增菌液12000 r/min离心Imin,弃上清,将菌体悬浮于100 μ L的灭菌蒸懼水中，100°C煮沸IOmin,冰浴中冷却后12000 r/min离心IOmin,取上清作为PCR模板DNA ；
(2)LAMP扩增向反应管中加入反应液A15 μ L，超纯水8 μ L，模板DNA I μ L，反应液B I μ L ；65°C孵育60 min，80V灭活5 min ;同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，阳性对照采用哈氏弧菌基因组DNA的阳性对照试样；
(3)显色检测再向反应管中加入反应液CIyL;观察显色结果，显绿色的为哈氏弧菌阳性，显粉色的为哈氏弧菌阴性。本发明所涉及的病原哈氏弧菌S090801 (Vibrio harveyi S090801)已经在公开文献《矛尾复鰕虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的建立》中所公开(菌株S090801)，上述公开文献发表于《水产科学》，2011，30 (12) :758_763。菌株S090801的DNA序列长度及Genebank登录号见下表
权利要求
1.一种用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其组成为 (O反应液A，I支，其体积百分比组成为 ①IOXLampbuffer, 17% ；其中 Lampbuffer 的组成为200mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM (NH4) 2S04,20mM MgSO4，质量浓度 1% 的 Trition X-100，Lampbuffer 的 pH 为 8. 8 ；②dNTP, 16. 5%，浓度为 IOmM ； ③硫酸镁水溶液，14%，浓度为25mM； ④甜菜碱水溶液，26.5%，浓度为8mol/L ；⑤vh-F3, 2. 5%,浓度为 10 μ Μ, 上游外部引物 vh-F3 为-.Ckk GAG CGACCA CTT CAT GT ；⑥vh-B3, 2. 5%,浓度为 10 μ Μ, 下游外部引物 vh-B3 为TTA GCG CTG CAC GGA AAC ；⑦vh-FIP, 10. 5%,浓度为 10 μ Μ, 上游内部引物 vh-FIP 为TCG CGC TCA AAG TCG AAG TGG-CAA GCG TTT GTT GAG CACC； ⑧vh-BIP，10. 5%,浓度为 10 μ Μ, 下游内部引物 vh-BIP 为TCT CGG TAG AAG TGG CGA TGC A-TCG CGT TGT GGG ATGTTG ； (2)反应液B 8000U 的 Bst DNA 酶，I 支； (3)反应液C:10X荧光染料SYBR Green I，I支； (4)哈氏弧菌基因组DNA的阳性对照试样，I支； (5)健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，I支； (6)超纯水，I支。
2.一种哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测方法，其特征在于，应用权利要求I所述试剂盒；其步骤如下 (1)DNA抽提取ImL待检样品增菌液12000 r/min离心Imin,弃上清,将菌体悬浮于100 μ L的灭菌蒸懼水中，100°C煮沸IOmin,冰浴中冷却后12000 r/min离心IOmin,取上清作为PCR模板DNA ； (2)LAMP扩增向反应管中加入反应液A 15yL，超纯水8 yL，模板DNA lyL，反应液B I yL;65°C孵育60 min，80°C灭活5 min ;同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，阳性对照采用哈氏弧菌基因组DNA的阳性对照试样； (3)显色检测再向反应管中加入反应液ClyL;观察显色结果，显绿色的为哈氏弧菌阳性，显粉色的为哈氏弧菌阴性。
全文摘要
一种用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其组成为反应液A，1支，其组成为10×Lampbuffer，dNTP，硫酸镁水溶液，甜菜碱水溶液，引物vh-F3、vh-B3、vh-FIP、vh-BIP，BstDNA酶，10×荧光染料SYBRGreenⅠ，阳性对照试样，阴性对照试样和超纯水。本发明还涉及应用该试剂盒进行检测的方法。本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于水产养殖场现场快速检测。本发明方法解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂、需要复杂仪器等缺陷，为水产动物疾病检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对哈氏弧菌引起的疾病的现场检测的迫切需要。
文档编号C12R1/63GK102839216SQ20121033601
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者张晓君, 陈丽, 毕可然, 闫斌伦, 秦国民 申请人:淮海工学院