br> 对灭活毒株进行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法试剂盒提取RNA保存备用，具体方法按RNA提取试剂盒说明书进行。RT-PCR反应采用Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒对WEEV及用于特异性试验的病毒RNA进行反转录。取5uL已制备的RNA，加入适量 WEEDHPF、WEEDHPR ；5X RT-PCR buffer ； dNTP 和 Enzyme mix 进行 RT-PCR 扩增。反应条件为 50Γ 30min ；94°C 15min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C 30s，35 个循环；72°C lOmin。
[0018]1.2.3标准阳性模板的制备
用 WEE-E1 Template-F 和 WEE-E1 Template-R 引物按照 1.2.2 的方法进行 RT-PCR 扩增(退火温度为58°C)，将RT-PCR产物按试剂盒说明书(宝生物工程有限公司)进行切胶回收，连接至PMD20T载体，转化DH5 a，37°C培养过夜，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，挑选经PCR鉴定正确的重组质粒，送英骏生物科技有限公司测序。将测序正确的重组质粒命名为 PMD20T-WEE。
[0019]选用限制性内切酶将重组质粒pMD20T-WEE进行线性化，并纯化回收，用SP6RiboMax Large Scale RNA Product1n System试剂盒进行体外转录，转录产物经无RNase的Dnase消化后除去其中的DNA，然后用RNeasy Kit进行纯化，制备出所需的cRNA。用核酸蛋白分析仪测定cRNA浓度，计算拷贝数。
[0020]1.2.4DHPLC分析条件
色谱柱:PS-DVB & C18 DNASep 色谱柱(4.6mmX50mm,粒度 3 μπι);柱温:60.1°C ;流动相:0.0min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ；0.5min, 45.9%缓冲溶液A，54.1%缓冲溶液B ;5.0min, 36.9%缓冲溶液A, 63.1%缓冲溶液B ;5.lmin，0%缓冲溶液A, 100%缓冲溶液B ;5.6min, 0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B ；5.7min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ；6.6min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ;流速:0.9mL/min ;检测器:荧光检测器(光源:150W Xenon灯；激发谱带宽:15nm ;发射谱带宽:15.3nm ;检测灵敏度:在波长350nm积分2s);上样量:PCR产物5yL。在变性分析模式下，采用双链DNA单片段(double-strandedsingle fragment)分析模式，清洗模式采用normal,分析检测过程仪器梯度由Navigatorsoftware分析软件控制设定。
[0021]1.2.5特异性试验
取马鼻肺炎病毒(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)和马流感病毒(H3N8)提取RNA (DNA)与西尼罗病毒RNA (WNV)、WEEV RNA、东方马脑脊髓炎(EEEV) RNA和委内瑞拉马脑脊髓炎(VEEV)分别进行PCR-DHPLC检测，并做空白对照，按照1.2.2扩增条件和1.2.4DHPLC分析条件进行PCR-DHPLC检测的特异性试验。
[0022]1.2.6灵敏度试验
将已制备的cRNA做10倍梯度稀释，按照1.2.2扩增条件和1.2.4DHPLC分析条件进行PCR-DHPLC检测，以此计算出PCR-DHPLC所能检出的最低模板拷贝数，确定本方法的灵敏度。同时进行荧光RT-PCR检测，以比较两种检测方法的灵敏度。
[0023]1.2.7临床验证与应用
应用建立的PCR-DHPLC方法和荧光RT-PCR方法对30份马血样进行检测，并对检测结果进行对比分析。
[0024]2.结果
2.1标准阳性模板的制备
将扩增得到的WEEV基因特异性保守片段克隆至pMD20T载体中，利用体外转录试剂盒制备出所需的cRNA作为阳性模板，对其进行RT-PCR鉴定，得到1317 bp的片段(图1)。经序列测定，扩增得到的特异性保守序列与GenBank中登陆序列同源性达到100%。
[0025]2.2 PCR-DHPLC反应条件的确立
为确保PCR-DHPLC的高效性、特异性及敏感性，我们对其反应条件进行了优化。由试验结果可知，PCR的最佳退为温度为55°C，反应循环数为35个循环；DHPLC的最佳洗脱温度为
60.re。
[0026]2.3特异性试验
取马鼻肺炎病毒(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)和马流感病毒(H3N8)提取RNA (DNA)与西尼罗病毒RNA (WNV)、EEEV RNA、西方马脑脊髓炎(WEEV) RNA和委内瑞拉马脑脊髓炎(VEEV)分别进行PCR-DHPLC检测，检测结果，仅WEEV出现扩增吸收峰，结果为阳性，其余均未出现相应的扩增吸收峰，结果均为阴性(图2)。
[0027]2.4灵敏度试验
将制备的WEEV cRNA 10倍梯度稀释成浓度分别为1?1.0 X 106拷贝/ μ L，并分别以此为模板进行PCR-DHPLC检测。结果显示PCR-DHPLC检测WEEV的灵敏度可达到1.0 X 102拷贝/ μ L (图3)。同时将稀释的cRNA进行荧光RT-PCR检测，显示荧光RT-PCR的灵敏度为10拷贝(图4)。结果表明PCR-DHPLC的灵敏度比荧光RT-PCR方法的灵敏度低一个数量级。
[0028]实施例2临床验证与应用
对30份临床血样提取RNA，应用本试验建立的PCR-DHPLC方法，荧光RT-PCR方法进行检测，同时设阳性对照和空白对照。两种检测方法的验证比较结果表明，PCR-DHPLC检测30份样品均为阴性，与荧光定量RT-PCR检测方法结果一致，且阳性及阴性对照均成立。
【主权项】
1.西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物，其特征在于，引物序列如下:WEEDHPF: 5-TTTCACCCTTTGACCATA-3 ；WEEDHPR: 5-ATTTCATACCCTGATACTGC-3 ；WEE-E1 Template-F:5-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3 ；WEE-E1 Template-R:5-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3ο2.西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法，其特征在于，包括下列步骤: (1)样品中病毒RNA的提取及特异性片段的扩增；(2)PCR-DHPLC 分析。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，样品中病毒RNA的提取及WEEV特异性片段的扩增的具体步骤是: 样品中病毒RNA的提取:对样品或灭活毒株进行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法试剂盒提取RNA保存备用，具体方法按RNA提取试剂盒说明书进行，RT-PCR反应采用Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒对WEEV及用于特异性试验的病毒RNA进行反转录； WEEV特异性片段的扩增:取5uL已制备的RNA，加入10 μ Μ的WEEDHPF和WEEDHPR各1 μ L ;5 X RT-PCR buffer 5 μ L ; 2.5mM dNTP 1 μ L 和 0.5 μ L Enzyme mix 进行 RT-PCR 扩增；反应条件为 50°C 30min ；94°C 15min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，35 个循环；72°C10mino4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，DHPLC分析条件为: 色谱柱:PS-DVB & C18 DNASep 色谱柱(4.6mmX50mm,粒度 3 μπι);柱温:60.1°C ;流动相:0.0min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ；0.5min, 45.9%缓冲溶液A，54.1%缓冲溶液B ;5.0min, 36.9%缓冲溶液A, 63.1%缓冲溶液B ;5.lmin，0%缓冲溶液A, 100%缓冲溶液B ;5.6min, 0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B ；5.7min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ；6.6min, 50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B ;流速:0.9mL/min ;检测器:荧光检测器(光源:150W Xenon灯；激发谱带宽:15nm ;发射谱带宽:15.3nm ;检测灵敏度:在波长350nm积分2s);上样量:PCR产物5 yL ;在变性分析模式下，采用双链DNA单片段(double-strandedsingle fragment)分析模式，清洗模式采用normal,分析检测过程仪器梯度由Navigatorsoftware分析软件控制设定。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，缓冲溶液A为:0.1M的TEAA，缓冲溶液B为:0.1M的TEAA+25%的乙腈。
【专利摘要】本发明公开了一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物和方法，包括下列步骤：（1）样品中病毒RNA的提取及特异性片段的扩增；（2）PCR-DHPLC分析。本发明建立的WEEV的PCR-DHPLC方法在检测其他马病病毒时相互之间无交叉反应，未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰；对WEEV不同模板浓度进行检测，检测极限可达到102拷贝/μL。所建立的方法结果与荧光RT-PCR的符合率达100%。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68, C12R1/93
【公开号】CN105385788
【申请号】CN201510910818
【发明人】郑小龙, 邓明俊, 孙涛, 岳志芹, 王群, 朱来华, 孙明君
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月10日