猴b病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物技术领域的检测方法及抗原技术领域，具体涉及一种猴B病 毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猴B病毒也称为猴疱疹病毒(Herpesvirus simian)，是一种人畜共患病原，自然宿 主是猕猴。猴感染B病毒后只引起局部或无症状感染，类似于人感染单纯疱疹病毒，而人感 染后则会导致脑炎、脑脊髓炎，严重时致呼吸麻痹死亡。对实验室工作人员的调查表明，至 今已有43例人感染B病毒的报道，虽然数目不高，但死亡率大于70%，幸存者会留下神经后遗 症。2002年颁布实施的国家标准，已将B病毒列入普通级实验用猴应排除的病原微生物。在 我国，猴子资源丰富，流动性较强。每年不仅有一定数量的猕猴、食蟹猴等出口欧美地区，而 且也从东南亚地区进口一定数量的猴子，因此对进出口猴子B病毒的检测，一直是检验检疫 工作的重要任务之一。目前针对B病毒的检测方法主要有病原分离、分子生物学检测方法和 血清学检测。在病原学检测方面：由于B病毒是生物安全四级病原微生物，其培养需在生物 安全四级实验室进行，因此病原分离检测仅在国家规定的特定实验室进行。在分子生物学 检测方面，虽然PCR方法可用于猴群的质量监测，但多数情况下不能检出病毒核酸的存在， 原因是B病毒像其他α疱疹病毒一样，感染后会在宿主神经节建立潜伏感染并很少活化。所 以抗体检测是判断猴是否感染Β病毒的重要依据。
[0003] 免疫梳方法是能够对病毒血清抗体进行定性、定量检测的一项新型体外诊断技 术，这种技术突破性地将病毒抗原点布在具有极强蛋白吸附力的硝酸纤维膜上，把包被好 的抗原膜贴附于PVC板以增加膜的强度和硬度，经机器裁切制成免疫梳。将此免疫梳插入稀 释好的待检血清样本时，特异性抗体与抗原结合并固着于膜上，再通过酶标二抗底物反应， 染色后，抗体阳性的样本表现为肉眼可见的红色斑点，阴性则无颜色变化。膜经过图像处理 系统数据化后可以进行定量分析。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种猴Β病毒 抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。
[0005] 本发明是通过以下的技术方案实现的： 1、一种用于构建猴Β病毒抗体的免疫梳的S0E-PCR引物组，引物BVF:如序列表Seq No. 1 所示，引物阶1?1:如序列表369如.2所示，引物阶1?2:如序列表369如.3所示。
[0006] 2、一种用于制备猴B病毒抗体的免疫梳的重组表达载体PGEX-4T-BV，序列如序列 表Seq No .4所示。
[0007] 3、一种用于制备猴B病毒抗体的免疫梳的重组表达载体PGEX-4T-BV的构建方法， 包括如下步骤： (1)根据猴B病毒的基因序列，设计S0E-PCR扩增引物，引物BVF:如序列表Seq No . 1所 示，引物阶1?1:如序列表369如.2所示，引物阶1?2:如序列表369如.3所示 ； (2) 进行SOE-PCR扩增猴B病毒基因； (3) 猴B病毒基因的回收； (4) 克隆质粒PMD18T-BV的构建及测序； (5) 表达载体pGEX-4T-BV的构建，序列如序列表Seq No. 4所示。
[0008] 4、如上所述的一种用于制备猴B病毒抗体的免疫梳的重组表达载体PGEX-4T-BV的 构建方法，所述的步骤(2 )采用S0E-PCR反应的具体步骤如下： 第一轮PCR反应条件： 将混合液在95 °C预变性5 min，94 °C变性1 min，60 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，15 个循环，72 °C总延伸10 min; 上述混合液如下所示：
第二轮PCR反应条件： 将混合液在95 °C预变性5 min，94 °C变性1 min，63 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，30 个循环，72 °C总延伸10 min; 上述混合液如下所示：
5、如上所述的一种用于制备猴B病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-BV的构建 方法，所述的步骤（5)pGEX-4T-BV的构建方法具体步骤如下：利用EcoRI与XhoI分别将 PMD18T-BV和pGEX-4T-l进行双酶切，并胶回收酶切的目的片段，将回收的目的片段进行连 接，将连接产物转化到BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性菌落， 并提取质粒进行Smal和EcoRI双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒命名为pGEX-4T-BV。
[0009] 6、一种猴B病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法，包括如下步骤： (1) 以重组表达载体PGEX-4T-BV表达猴B病毒蛋白； (2) 猴B蛋白的纯化与定量； (3 )免疫梳检测试纸的制备： (3.1) 将步骤（1)中表达的猴B病毒蛋白以0.01 mg/mL的浓度进行线性包被NC膜，将膜 晾干； (3.2) 用0.05g/mL的BSA封闭液封闭NC膜过夜，弃去封闭液后再次晾干； (3.3) 将包被好的NC膜裁剪成标准尺寸的试纸条，依次按一定间距整齐固定于PVC板 上，十二条为一组或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳检测试纸，最终于自封袋中低温保 存备用。
[0010] 7、如上所述的一种猴B病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法制备的一种猴B病 毒抗体的免疫梳检测试纸。
[0011] 8、如上所述的一种猴B病毒抗体的免疫梳检测试纸，其检测方法如下： (1) 将1:25倍稀释的待检血清样品转移至96孔酶标反应板中，标记顺序号； (2) 将免疫梳检测齿依次伸入各反应孔内的血清液面之下，37 °C轻轻震荡30-60 min； (3) 取出免疫梳用TBS-T缓冲液冲洗三次，每次3-5 min，同时将稀释好的碱性磷酸酶标 记1:500兔抗猴二抗溶液顺次加入另一排酶标反应板孔中，每孔2 300 yL，将洗过的免疫梳 依次伸入各反应孔中，37 °C震荡30-60 min; (4) 取出免疫梳按上述方法冲洗3次后置于干净的方盒中加入显色液，静止、闭光显色 1-15 min，最后用蒸馏水冲洗免疫梳并观察记录反应结果； (5) 上述操作过程中设立阳性对照与阴性对照各1孔； (6) 阳性对照免疫梳齿上有明显的肉眼可见反应条带，蓝紫或黑色，且阴性对照梳齿上 无反应条带，说明检测有效，在此基础上进行下一步待测样品的判定； (7) 待测样品检测的免疫梳齿上与阳性对照梳齿上相同位置处出现可见反应条带的判 定为阳性检测结果，若待测样品检测的免疫梳齿上无反应条带出现则判定为阴性检测结 果。
[0012] 9、如上所述的一种猴B病毒抗体的免疫梳检测试纸在检测猴B病毒抗体中的应用。
[0013] 本发明提供了一种不需要特定仪器设备辅助的检测试纸，解决了目前进出口实验 猴B病毒抗体检测缺乏现场操作简便的试剂盒的现状，能够应用于大规模现地检样的检测 方法。该试纸具有快速、简便、经济、不需任何特殊仪器，保留了常规ELISA的敏感、特异的优 点，又克服了许多繁琐的操作，节省了操作时间，缩短了实验周期，完全可在野外进行实地 诊断检测，达到快速诊断的目的，能够满足□岸机场、码头的快速通关检测，具有良好的运 用推广前景。
【附图说明】
[0014] 图1为猴B病毒抗原表位基因的PCR扩增结果图， 其中，M:DNA Marker 2000; 1:猴B病毒抗原表位编码基因 PCR扩增结果;2:水对照。
[0015] 图2为猴B病毒抗原表位基因重组表达载体的酶切鉴定结果图， 其中，M:DNA Marker DS 5000 Ladder; l:pGEX-4T-BV双酶切鉴定；2:质粒pGEX-4T-BV。
[0016] 图3为猴B病毒抗原表位蛋白的SDS-PAGE分析结果图， 其中，1-3:空载体菌诱导对照;M:蛋白Marker; 4:诱导的pGEX-4T-BV蛋白表达。
[0017] 图4为猴B病毒抗原表位蛋白的纯化结果图， 其中，M:蛋白分子量Marker位置；1:切胶纯化后的猴B病毒的重组表达蛋白BV32。
[0018] 图5为重组猴B病毒BV32蛋白最佳包被量确定图， 其中，1-7分别代表BV32包被浓度为：lmg/mL、0 · lmg/mL、0.01mg/mL、lyg/mL、100ng/mL、 10ng/mL和Ing/mL 图6为Western-blot分析重组猴B病毒BV32蛋白特异性， 其中，1-5分别代表BV32蛋白与猴B病毒阳性血清、猴SRV1病毒阳性血清、猴SIV病毒阳 性血清、猴STLV1病毒阳性血清以及猴MeV病毒阳性血清免疫反应结果。
[0019] 图7为Western-blot分析重组猴B病毒BV32蛋白敏感性结果图， 其中，1-6分别代表BV3蛋白与1:25/50/100/200/400/800倍稀释的猴B病毒阳性血清反 应结果。
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